鸭坦布苏病毒抗体间接酶联免疫吸附试验（ELISA）方法 DB37/T2842-2016 本标准规定了鸭坦布苏病毒抗体间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测方法所需试剂及仪器、检测步骤、结果判定等。本标准所规定的检测方法适用于检测鸭血清中坦布苏病毒特异性抗体。 1 范围 本标准规定了鸭坦布苏病毒抗体间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测方法的技术要求，适用于鸭血清样本中坦布苏病毒特异性抗体的检测。 2 试剂及仪器 2.1 试剂 2.1.1 阳性血清：SPF鸭接种坦布苏病毒制备的血清。 2.1.2 阴性血清：SPF鸭血清。 2.1.3 坦布苏病毒抗原：原核表达的重组坦布苏病毒E蛋白。 2.1.4 酶标二抗：羊抗鸭辣根过氧化物酶标记的IgG。 2.1.5 磷酸盐缓冲液（PBS），见A.1。 2.1.6 包被液，见A.2。 2.1.7 洗涤液，见A.3。 2.1.8 样品稀释液（封闭液），见A.4。 2.1.9 底物溶液：商品化TMB底物显色液。 2.1.10 终止液，见A.5。 2.2 仪器 2.2.1 酶标仪。 2.2.2 微量加样器。 2.2.3 聚苯乙烯板。 2.2.4 水平振荡器。 2.2.5 恒温培养箱。 3 样品准备 3.1 待检鸭血清样品，每份不少于200μL，无溶血。 3.2 被检血清样品用样品稀释液按1：40倍稀释。 4 操作步骤 4.1 试验试剂预温到20℃～25℃。 4.2 将抗原按照浓度为2.6ng/μL用碳酸盐缓冲液稀释，每孔100μL加入到96孔聚苯乙烯板中，4℃孵育过夜后，用洗涤液100μL洗板3次，每次置于水平振荡器300r/min震荡3min，甩干板上残余液体。 4.3 每孔加入200μL封闭液，37℃温箱孵育1小时，用4.2方法洗板。 4.4 在A1、A2孔各加100μL阴性血清对照，A3、A4孔各加100μL阳性血清对照。 4.5 将待检血清样品加入其他各孔，每孔100μL，37℃温箱孵育1小时，用4.2方法洗板。 4.6 酶标二抗用样品稀释液按1:500倍稀释，每孔加100μL，37℃孵育1小时，用4.2方法洗板。 4.7 每孔加100μL底物溶液，37℃避光孵育15分钟。 4.8 每孔加入50μL终止液，轻轻振荡，终止反应。 4.9 置酶标仪于450nm测定各孔样品吸光度（OD）值，该操作需30分钟内完成。 5 结果判定 5.1 阴性对照OD均值等于（A1孔OD值+A2孔OD值）/2；阳性对照OD均值等于（A3孔OD值+A4孔OD值）/2。 5.2 阳性对照平均值减去阴性对照平均值，其差必须大于0.40，阴性对照平均值必须小于等于0.20，试验条件成立，否则重做。 5.3 判定： 5.3.1 阳性样品OD450≥0.40，待检血清为阳性；即已感染坦布苏病毒。 5.3.2 阴性样品OD450≤0.20，待检血清为阴性；即未感染坦布苏病毒。 5.3.3 可疑样品0.20
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