DB21/T3367—2021 海洋生物体中皮质醇的测定（Determination of hydrocortisone in marine organism）

前言
本文件按照GB/T 1.1—2020给出的规则编写。本文件由辽宁省农业农村厅提出并归口管理。

本文件主要起草单位：辽宁省海洋水产科学研究院、大连海关技术中心、大连海洋学校。
本文件主要起草人：刘桂英、王琦、葛坤、田金、宋广军、胡超魁、邵泽伟、李安龙。

本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈。我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。
归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅农产品质量安全监管局（沈阳市和平区太原北街2号综合楼A座）；联系人：马京京；联系电话：024-23447862、13840306249；电子邮箱：lnncpjg@163.com。
文件起草单位通讯地址：辽宁省海洋水产科学研究院（大连市沙河口区黑石礁街50号）；联系电话：0411-84671027。

1 范围
本文件规定了海洋生物体中皮质醇检测的原理、试剂、仪器和设备、样品前处理、样品测定与结果、方法灵敏度、准确度和精密度。
本文件适用于鱼类、虾类、棘皮类、贝类生物体中皮质醇的测定。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 8170 数值修约规则与极限数值的表示和判定
GB/T 30891 水产品抽样规范

3 方法原理
生物样品中的皮质醇，用0.2%甲酸乙腈溶液提取，经固相萃取柱净化、浓缩后，采用超高效液相色谱质谱联用仪检测，外标法定量。

4 试剂
4.1 乙腈：色谱纯。
4.2 甲酸：色谱纯。
4.3 氯化钠：分析纯。
4.4 无水硫酸钠：分析纯。
4.5 0.1%甲酸溶液：用移液管量取1mL甲酸，用水稀释并定容至1000mL。
4.6 0.2%甲酸乙腈溶液：用移液管量取1mL甲酸，用80%乙腈稀释并定容至500mL。
4.7 标准品：皮质醇（Hydrocortisone，C21H30O5，CAS号50-22-7），纯度98%以上。
4.8 标准贮备溶液（10mg/L）：准确称取1.00mg皮质醇标准品，用乙腈配制至10mg/L，避光贮存于-18℃条件下。
4.9 标准溶液（1mg/L）：准确吸取标准贮备溶液1mL于10mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，避光冷藏于2℃～6℃条件下保存。
4.10 针孔式微孔滤膜：0.22μm，有机系（亲水性聚丙烯、玻璃纤维、亲水性PTFE、聚醚砜或其他等效材质）。
4.11 除非另有说明，在分析中所使用的水均应符合GB/T 6682规定的一级用水要求。

5 仪器和设备
5.1 超高效液相色谱质谱联用仪：配有电喷雾离子源和三重四极杆。
5.2 固相萃取装置：固相萃取柱Captiva EMR（200mg，6cc）。
5.3 离心机：转速5000r/min。
5.4 分析天平：感量0.0001g和0.01g。
5.5 高速组织捣碎机。
5.6 均质机。
5.7 氮吹仪。
5.8 涡旋混匀仪。

6 测定步骤
6.1 样品制备与保存
6.1.1 水产品试样抽取：按GB/T 30891的规定执行。
6.1.2 水产品试样制备：取样品约100g，用高速组织捣碎机充分捣碎，经均质机混匀后均分成两份，一份用于检测，另一份作为留样。
6.1.3 样品于-18℃条件下冷冻避光保存。

6.2 提取
称取样品5.00g，置于50mL聚丙烯离心管中，加入10mL 0.2%甲酸乙腈溶液，充分摇匀并涡旋混合。加入1g氯化钠和4g无水硫酸钠，充分涡旋混匀1min，超声10min后静置，以5000r/min、4℃条件离心15min。取上清液4mL置于新的聚丙烯离心管中，加入1mL水混匀，待净化。

6.3 净化和浓缩
将待净化溶液全部倒入固相萃取柱中，保持约每秒一滴的流速，收集全部流出液。待萃取结束后，于45℃水浴条件下采用氮吹仪浓缩至液面高度恒定，用水定容至1mL。上清液经0.22μm有机滤膜过滤后转入进样瓶中，供超高效液相色谱质谱联用仪检测。

6.4 样品测定
参照下述条件进行测定：
— BEH C18色谱柱（2.1mm×50mm，i.d.）；
— 进样量：10μL；
— 柱温：30℃；
— 流速：0.2mL/min。