DB13/T1469-2011 杨树耐盐性鉴定技术规程
发布日期：2011-11-15
实施日期：2011-11-30
发布单位：河北省质量技术监督局

前言
本标准依据GB/T1.1—2009的规定编写。本标准由沧州市质量技术监督局提出。本标准起草单位：天津市农业生物技术研究中心、沧州市农林科学院。本标准主要起草人：杨迎霞、刘仲齐、黄素芳。

1 范围
本标准规定了利用叶表皮细胞进行杨树耐盐性鉴定的方法及评价指标。本标准适用于杨树品种资源和育种材料的耐盐性鉴定及评价。

2 术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
2.1 叶片表皮细胞死亡率
指从杨树叶片上剥离下来的表皮细胞，浸泡在一定浓度的NaCl溶液中胁迫一段时间后，表皮细胞死亡的数量占观察细胞总数的比率。

3 耐盐性鉴定原理
用叶表皮细胞的死亡率能快速鉴定杨树的耐盐潜力。杨树的叶表皮细胞在高盐环境中，发生质壁分离，最后导致细胞质膜的破裂。耐盐能力不同的细胞，在盐胁迫环境中发生质膜破裂的程度不同。以染料中性红为指示剂，对杨树的叶表皮细胞进行染色，质膜没有破裂的活细胞，其液泡内的微酸性环境使中性红变成桃红色。质膜破裂的死细胞不着色。根据着色细胞的多少可以区分耐盐能力不同的杨树品种和杨树个体。

4 鉴定方法
4.1 鉴定准备
4.1.1 培养器皿的选择
水培槽是长×宽×高=35cm×25cm×15cm的塑料箱，水槽内铺泡沫棉，泡沫棉的厚度2cm。
4.1.2 营养液的配置
营养液选用Hoagland营养液，配方见附录A。
4.1.3 盐溶液的配置
将234g分析纯NaCl溶解在1000ml去离子水中，配制成4mol·L NaCl溶液。
4.1.4 染色剂的配置
将0.3g中性红溶解在1000ml去离子水中，配制成0.03%的中性红（3-氨基-6-甲氨基-2-甲基苯嗪盐酸盐）溶液。

4.2 鉴定步骤
4.2.1 样品准备
选取整齐一致的一年生杨树枝条截成15-20cm的茎段，插于泡沫棉中，置于含有Hoagland营养液的水培槽中培养，1个月后从生长一致的杨树插条上选取第一和第二片完全展开叶进行叶片表皮细胞耐盐性鉴定。
4.2.2 培养条件
培养时平均温度白天为28℃，夜间为22℃，光照周期为14h/10h，光照强度为5000Lux，平均湿度为65%。
4.2.3 盐胁迫及染色处理
取准备好的杨树叶片，用镊子或刀片从离体叶片上剥取表皮细胞，浸入4mol·L NaCl溶液中，胁迫10min，然后在0.03%中性红溶液中染色10min。3个叶片为一个重复，共3次重复。

5 耐盐性评价
5.1 叶片表皮细胞死亡率的计算
把染色后的叶表皮放在（10×10）倍的光学显微镜下观察，用C5型0.5网形目镜尺在（5×5）mm范围内统计活细胞数量和细胞总数。叶片表皮细胞死亡率的计算公式如下：
细胞死亡率（%）=（单位面积细胞总数 - 单位面积活细胞数）/ 单位面积细胞总数 × 100

5.2 耐盐性评价
根据单位面积叶片表皮细胞的死亡率，把杨树的耐盐性分成强、中、弱三个等级。
【表1 杨树耐盐性分级标准】
级别 | 叶片表皮细胞死亡率(A) | 耐盐性
--------------------------------------
强 | A ≤ 20% | 强
中 | 20% < A < 60% | 中等
弱 | A ≥ 60% | 弱

附录A（规范性附录）
Hoagland营养液配方
表A.1 Hoagland营养液配方元素配比
化合物名称 | 浓度
--------------------------------------
Ca(NO3)2 | 945mg·L
KNO3 | 607mg·L
NH4H2PO4 | 115mg·L
MgSO4·7H2O | 493mg·L
H3BO3 | 2.86mg·L
MnCl2·4H2O | 1.81mg·L
ZnSO4·7H2O | 0.22mg·L
CuSO4·5H2O | 0.08mg·L
(NH4)6Mo7O24 | 0.02mg·L
FeSO4·7H2O | 27.85mg·L
Na2-EDTA | 37.25mg·L

注：Na2-EDTA加热溶解（≤70℃）后，加入FeSO4