DB21/T2743-2017 动物源细菌抗菌药物敏感性检测方法标准 前言 本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。 本标准由辽宁省兽药饲料产品质量安全检测中心和中国兽医药品监察所联合提出，由辽宁省畜牧兽医局归口。 本标准起草单位：辽宁省兽药饲料产品质量安全检测中心、中国兽医药品监察所。 本标准主要起草人：李欣南、韩镌竹、许彬、李洪伟、高红倩、韩春晓、高铎、武凤娇、苏崴艺、李永才、李香珍、宋立、张纯萍等。 本文件部分内容可能涉及专利，发布机构不承担专利识别责任。 1 范围 本标准规定了动物源细菌常见抗菌药物微量肉汤稀释法药物敏感性试验的试剂与材料、仪器设备、操作步骤及质量控制要求。 本标准适用于动物源非苛养菌常见抗菌药物的微量肉汤稀释法药物敏感性检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡注日期的文件，仅所注日期版本适用；凡不注日期的文件，其最新版本（包括所有修改单）适用。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 微量肉汤稀释法是一种定量测定抗菌药物对动物源细菌体外抗菌活性的标准方法。通过将抗菌药物进行系列稀释，加入待检菌悬液，在一定条件下培养后，采用肉眼或自动分析系统判读结果，测定最小抑菌浓度（MIC）。 4 试剂和材料 4.1 化学试剂 实验所用试剂应为分析纯或生化试剂，且不得含微生物污染。试剂采购、验收与储存应符合相关规定。 4.2 实验用水 应符合GB/T 6682规定的三级水要求。 4.3 琼脂培养基 见附录A中A.1。 4.4 Mueller-Hinton肉汤（M-H肉汤）培养基 见附录A中A.2。 4.5 0.85%无菌生理盐水 称取8.50g氯化钠（精确至0.01g），加入1L蒸馏水溶解后，于121℃高压灭菌15min。 4.6 抗菌药物 使用标准品或对照品，参照兽药典或CLSI相关文件（M07-A10、M37-A3、M45-A3）进行溶解与使用。 4.7 药敏检测板 按产品说明书操作使用。 4.8 质控菌株 应来源于国家级菌种保藏中心或具资质机构提供的标准菌株。使用代次不超过35代，至少每30天更新一次。 5 仪器设备 包括恒温培养箱（36±1℃）、分析天平（0.01g及0.00001g）、无菌操作台、麦氏比浊仪、自动加样器、药敏结果判定仪及相关无菌操作设备等。 6 检测程序 动物源细菌抗菌药物敏感性检测程序见图1。 7 操作步骤 7.1 菌落培养 取新鲜划线平板上的单菌落进行培养，一般培养时间不超过24小时。 7.2 菌液制备 挑取3～5个单菌落，用0.85%无菌生理盐水或M-H肉汤稀释至0.5麦氏单位，菌液浓度约为1～2×10^8 CFU/mL。 7.3 抗菌药物工作液制备 7.3.1 溶剂与稀释液 除蒸馏水外，其余溶剂需经0.22μm滤膜过滤除菌。 7.3.2 储备液制备 抗菌药物储备液浓度应符合试验要求，可制备不同浓度梯度储备液。 7.3.3 工作液制备 将储备液用M-H肉汤进行系列稀释，通常设置10个浓度梯度，并设置阴性与阳性对照。 7.4 接种与反应体系建立 将菌液按要求稀释后加入药敏板，每孔加入0.1mL，进行后续培养与结果判读。