本标准规定了固氮菌肥料产品的分类、技术要求、试验方法、检验规则、包装、标识、运输、贮存等。本标准适用于含有益的固氮菌、能在土壤和多种作物根际中固定空气中的氮气，供作物氮素营养，又能分泌刺激素刺激作物生长的活体制品。本标准也适用于以固氮菌为主的含有能促进固氮、生长的植物促生根际细菌(PGPR)的复合固氮菌肥料。 NY 411-2000 固氮菌肥料 NY411-2000 标准下载解压密码：www.bzxz.net
本标准规定了固氮菌肥料产品的分类、技术要求、试验方法、检验规则、包装、标识、运输、贮存等。本标准适用于含有益的固氮菌、能在土壤和多种作物根际中固定空气中的氮气，供作物氮素营养，又能分泌刺激素刺激作物生长的活体制品。本标准也适用于以固氮菌为主的含有能促进固氮、生长的植物促生根际细菌（PGPR）的复合固氮菌肥料。

GB/T 625-1989 化学试剂硫酸
GB/T 629-1997 化学试剂氢氧化钠
GB/T 1250-1989 极限数值的表示方法和判定方法
GB/T 6543-1986 瓦楞纸箱
GB/T 6682-1992 分析实验富用水规格和试验方法

中华人民共和国农业行业标准
NY411—-2000
固氮菌肥料
Azotobacter fertilizer
2000-12-22发布
中华人民共和国农业部发布
2001-04-01实施
中华人民共和国农业
行业标准
固氨菌肥料
NY411—2000
中国标准出版社出版
北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码：100045
电话：6852394668517548
中国标准出版社皇岛印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经售开本880×12301/16印张1字数23千字2001年4月第一版2001年4月第一次印刷印数1-800
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科目565-506
版权专有侵权必究
举报电话：(010)68533533
NY411-2000
本标准在原有标准NY/T227—1994《微生物肥料》的基础上，对其中的固氮菌肥料部分进行修改。主要修改内容如下：
一在技术要求中删除成品无害化指标；一在检验方法中增加允许差，并增加抽样和判定规则。本标准自实施之日起，同时代替NY/T227一1994中的固氮菌肥料部分。本标准的附录A、附录B、附录C都是标准的附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准起草单位：农业部微生物肥料质量监督检验测试中心、中国农业科学院土壤肥料研究所。本标准主要起草人：李元芳、吴观以、李慧荃、葛诚、沈德龙。1范围
中华人民共和国农业行业标准
固氮菌肥料
Azotobacter fertilizer
NY411—2000
本标准规定了固氮菌肥料产品的分类、技术要求，检验方法、检验规则、包装、标识、运输、贮存等。本标准适用于含有益的固氮菌、能在土壤和多种作物根际中固定空气中的氮气，供作物氮素营养，又能分泌激素刺激作物生长的活体制品。本标准也适用于以固氮菌为主的含有能促进固氮、生长的植物促生根际细菌(PGPR）的复合固氮菌肥料。2引用标准
下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB/T625--1989
化学试剂硫酸
GB/T629—1997
化学试剂氢氧化钠
GB/T1250—1989
极限数值的表示方法和判定方法瓦楞纸箱
GB/T65431986
GB/T6682—1992
3定义
分析实验室用水规格和试验方法本标准采用下列定义。
3.1自生固氮菌
在土壤里能固定空气中的氮，供作物氮素营养，又能分泌激素刺激作物生长的微生物。3.2根际联合固氮菌
既依赖根际环境生长，又在根际中固定空气中的氮气，对作物的生长发育产生积极作用的微生物。3.3固氮效能
固氮菌每消耗1g碳水化合物（糖）从空气中摄取氮素的毫克数，固氮效能用mg氮/g糖表示。4产品分类
4.1按剂型不同分为：液体固氮菌肥料、固体固氮菌肥料和冻干固氮菌肥料。4.2按菌种及特性分为：自生固氮菌肥料、根际联合固氮菌肥料、复合固氮菌肥料。5技术要求
5.1菌种
在含一种有机碳源的无氮培养基中能固定分子氮，并具有一定的固氮效能。菌体一般为短杆状（固氮螺菌属菌体呈螺旋状），革兰氏染色阴性。中华人民共和国农业部2000-12-22批准2001-04-01实施
5.1.1自生固氮菌
NY411--2000
用固氮菌属（Azotobacter）、氮单胞菌属（Azomonas）的菌种，也可用茎瘤根瘤菌（Azorhizobiumcaulinodans）和固氮芽胞杆菌（Paenibacillusazotofixans）菌株。5.1.2根际联合固氮菌
可用下列菌种：固氮螺旋菌（Azosbirillum），阴沟肠杆菌（Enterobactercloacae）经鉴定为非致病菌的菌株粪产碱菌（Alcaligenesfaecalis）经鉴定为非致病菌的菌株，肺炎克氏杆菌（Klebsiellapneumoniae）经鉴定为非致病菌的菌株。
使用本准则规定之外的菌种生产固氮菌肥料时，菌种必须经过鉴定，并符合5.1要求。生产固氮微生物肥料所使用的菌种，必要时还要进行菌种染色鉴别（见附录B）和菌种固氮效能测定（见附录C）。
5.2成品技术指标（见表1）
外观、气味
水分，%
细度，过孔径0.18mm标准筛
的筛余物，%
有效活菌数，个/mL
（个/g、个/瓶）
杂菌率\，%
有效期”，月
表1成品技术指标
乳白或淡褐色液体，混
浊，稍有沉淀，无异臭味
1）其中包括10~马丁培养基平板上无霉菌固体
黑媽色或褐色粉状，湿
润、松散，无异臭味
25.0~35.0
2）此项仅在监督部门或仲裁检验双方认为有必要时才检测。6抽样
乳白色结晶，无味
按每一发醛罐菌液制成的产品为一批，逐批抽样检验。抽样过程要严格避免杂菌污染。6.1抽样工具及用品
抽样前预先准备好无菌塑料袋（或塑料瓶）、金属勺、剪刀、封口机、牛皮纸封样袋、标签、抽样封条和胶水。
6.2抽样数量及抽样方法
在成品库抽样，可按“”形分层设点抽取，抽样以件为单位，小包装产品以一包装箱为一件。大包装（30～50kg）产品以一袋（或一桶）为一件。抽样件数由样品基数的大小确定。110件，全部抽样；11～200件，抽样10件；201～400件，抽取20件；样品基数大于400件者，按超过部分的2%增加抽样件数，但总件数不要超过40件。
每件包装产品抽取一小袋，在无菌条件下每袋取样200g。然后将所有样品混匀，按四分法缩到2000g分装4袋，然后封口。每2袋为一份装人牛皮纸封样袋。液体产品每件吸取10mL，一同放人无菌的三角瓶中，混匀后分成两份，每份250mL。冻干产品，每件取一支放人无菌的三角瓶中，加无菌液体培养液，溶解混匀后分成两份，每份50mL。贴上标签和封条（一份被抽样单位留存，一份交检测中心检测）。2
7检验方法
7.1仪器设备及试剂
7.1.1仪器设备
生物显微镜（10×100）；
菌落计数器，
恒温培养箱；
恒温干燥箱；
恒温摇床；
灭菌锅；
无菌室或超净工作台；
酸度计：
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试管：q15mm×150mm，18mm×180mm培养血：直径9cm；
三角瓶：500mL；
无菌吸管：0.5、1、5、10mL，
玻璃刮刀；
滤纸，
酒精灯；
标准筛：孔径0.18mm和0.15mm；1号羊毛画笔：
无菌水，
无离子水。
7.1.2试剂
选择培养基(见附录A)；
刚果红染液（0.5%）。
7.2成品检验
7.2.1气味检验
取固氮菌肥料样品打开包装，进行感观检验。7.2.2外观检验
将固体固氮菌肥料包装打开，装在白色糖瓷盘中，将液体固氮菌肥料摇匀，在明亮光线下进行感观检验。
7.2.3pPH值测定
液体固氮菌肥料的PH值测定：取供检菌液直接测定pH值，取三次测定结果的平均数，固体固氮菌肥料的pH值测定：取50mL烧杯一个，加人菌肥25g，无离子水25mL。通过磁力搅拌器使溶液均匀后用酸度计测定pH值。取三次测定结果的平均数。7.2.4含水量测定
称取固体固氮菌肥三份，每份20.00g，精确到0.01g，放人已称恒重的铝盒中。置105℃干燥箱内烘烤4h，移至于燥器内，冷却后称重。根据烘干前后质量差按式（1)计算含水量。取三个样品测定数的平均值。平行样品绝对偏差应低于1%。含水量(%)=mo=m×100
式中：mo—-烘干前样品质量，g;.（1)
一烘干后样品质量，g。
7.2.5吸附剂颗粒细度测定
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称样10.00g（精确至0.01g），置于标准筛中（直径分别为0.18mm或0.15mm），用水冲洗，用毛笔轻刷，至粉末不再通过为止。将筛余物置105～110℃温度下烘干，称重。筛余物百分含量按式（2)计算：
筛余物(%）=筛余物量+（1=显样晶含水量百分数)× 100样品质量
7.2.6有效活菌数和杂菌含量测定采用平板计数法测定有效活菌数及杂菌率。7.2.6.1测定步骤
·（2)
采样应不少于500g，从中称取10.00g，加入带玻璃珠的100mL的无菌水中（液体菌剂取10mL，加人90mL的无菌水中），静置20min后在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，即成母液的菌悬液。
用无菌吸管吸取5mL上述母液的菌悬液加人45mL无菌水中，混匀成1110稀释的菌悬液，这样依次稀释，分别得到1：1×10°,1：1×10°，1：1×10°，1：1×105等浓度（每个稀释度必须更换无菌吸管)。
用0.5mL无菌吸管分别吸取不同稀释度菌悬液0.1mL，加至直径为9cm平血的选择培养基（见附录A）表面，用无菌玻璃刮刀将菌悬液均勾地涂于琼脂表面，或取1mL不同稀释度菌悬液加人培养血内，与琼脂培养基混勾，每个样品取3个连续适宜稀释度，每一稀释度重复3次，同时加无菌水的空白对照。28℃培养2～3d后每个稀释度取5～10个菌落的菌体，涂片染色（见附录B）。显微镜观察识别后，选一个适宜稀释度（菌落在30～300个之间的平板)，计算出同一稀释度三个平血上菌落平均数。杂菌数是指在选择培养基上，除有效活菌外的其他菌的菌落数与马丁培养基上霉菌数之和。马丁培养基10-稀释度菌悬液加样，操作步骤同样品有效活菌数检测操作。7.2.6.2允许差
平行样品误差按式（3)计算，并应符合表2的规定。)
式中：8—单一标准差；
工一同一个稀释度任一个平板测定值；王——同一个稀释度平板测定的平均值；一重复次数。
表2平板上菌落数对应的单一标准差平板上菌落数，个/血
单一标准差,士
7.2.6.3测定结果的计算
按式（4)、式（5)计算样品的有效活菌数及杂菌率有效活菌数(个/g)=菌落平均数×稀释倍数×母液菌悬液的体积(mL)菌剂克数或毫升数
杂菌数
杂菌率（%）=
有效菌数+杂菌数
100～300
加样量（mL）
（3）
....(4)
....(5)
7.2.7有效期检验在产品说书标明的有效期到达前10d测定成品各项指标，方法同7.2.1～7.2.6。4
8检验规则
8.1检验分类
8.1.1产品出厂检验
产品交货时进行的检验。
8.1.2产品型式检验
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新产品鉴定或国家质检机构质量监督检验。8.2检验项目
型式检验的检验项目按5.2要求进行。出厂检验不检有效期。8.3判定规则
8.3.1合格产品：
a）检验结果符合5.2所规定的技术指标的产品为合格产品；b）产品有效活菌数符合指标，杂菌率不符合指标，但小于本标准规定的两倍时（液体10%、固体30%，冻干瓶4%），而且在马丁培养基平板上霉菌数小于30×105，其他指标有一项不符合，也可判为合格产品；
c）产品有效活菌数及杂菌率符合指标，在水分、外观、pH值、细度等次要检测项目中，有3项不符合技术指标，也判为合格产品。8.3.2不合格产品：
a）产品有效活菌数不符合技术指标或投人菌种没有完全相应的检验出，判为不合格产品；b）产品杂菌率超过本标准规定的两倍（液体10%，固体30%、冻干瓶4%），判为不合格产品；c）产品有效活菌数符合指标，杂菌率不符合指标，但小于本标准规定的两倍时（液体10%、固体30%、冻干瓶4%），其他指标有两项不符合指标，判为不合格产品；d）产品检验在马丁培养基平板上霉菌数≥30×105判为不合格产品；e）产品水分、pH值、细度、外观等次要检测项目中，有4项不符合技术指标，判为不合格产品。8.3.3含有植物促生根际细菌（PGPR）的固氮菌肥料产品检测时，只测固氮菌数量，不测植物促生根际细菌的数量，也不视其为杂菌。8.3.4本标准中质量指标合格判断，采用GB/T1250中修约值比较。9包装、标识、运输和贮存
9.1包装
9.1.1内包装
液体肥料小包装用塑料瓶或玻璃瓶，大包装用塑料桶。固体肥料用不透明聚乙烯塑料袋包装。冻干菌剂用玻璃指形管真空干燥。
9.1.2外包装
外包装采用纸箱，纸箱质量应符合GB/T6543的要求。箱外用尼龙打包带加固。9.1.3每箱（袋）产品中附有产品合格证和使用说明书，在使用说明中标明使用方法、用量及注意事项。9.2标识
在包装箱（袋）上印有产品名称、商标、标准编号、肥料登记证号、生产单位、厂址、生产日期、批号和净重，并印有防晒、防潮、防冻等标记，若有必要还要加印易碎、防倒置等标记。内包装上有产品名称、商标、标编号、肥料登记证号、有效菌含量、生产日期、有效期、产品性能、使用说明书及生产单位、厂址等。
9.3运输
适用于常用运输工具，运输过程中有遮盖物，防止雨淋、日晒及35℃以上高温。气温低于0℃时采取5
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保温措施，防止菌肥冻冰。运输过程中轻装轻卸，避免包装破损。9.4存
产品贮存在阴凉、干燥、通风的库房内，最适温度为10℃～25℃，不得露天堆放，以防雨淋和日晒，避免冻冰及长时间35℃以上高温。NY411—2000
附录A
(标准的附录）
有效活菌数和杂菌（霉菌）测定的选择培养基A1固氮菌用阿须贝氏（Ashby）培养基磷酸二氢钾（KHPO.）
硫酸镁（MgSO，·7HO)
氯化钠(NaCI）
碳酸钙（CaCO,）
甘露醇（C.HuO）
硫酸钙（CaSO·2H,0)
A2固氨（茎瘤）根瘤菌培养基
乳酸钠（C,H,O,Na）
磷酸氢二钾（K,HPO）
磷酸二氢钾（KHPO）
氯化钠(NaCI）
化钙（CaCl2)
氯化铁（FeCl,）
硫酸镁（MgSO·7HO)
酵母膏
（或酵母粉
A3联合固氮菌培养基
D-葡萄糖酸钠(C.H,O,Na)
磷酸二氢钾（KH,PO,）
磷酸氢二钾(K,HPO,）
硫酸镁（MgSO.·7H.O）
醇母膏
（或醇母粉
氯化钠(NaCI)
氯化钙(CaClz）
氯化铁（FeCl3）
钼酸钠（NazMoO,）
A4马丁培养基（测霉菌数）
磷酸氢二钾（K，HPO）
硫酸镁（MgSO·7H,O)
葡萄糖（C.Hi2O。H,O)
蛋白陈
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1%孟加拉红水溶液【四氟四碘荧光素（C2H,CI,IO,)每升培养基中加入0.1g氯霉紫，一起灭菌。注：以上各培养基需蒸馏水1000mL，琼脂18~20g。附录B
(标准的附录）
染色剂和染色方法
B1荚膜染色法
B1.1染色剂
石碳酸复红染色液
甲液：碱性复红（Basicfuchsin）（CzoHzoCIN，）95%酒精（CHCHOH）
乙液：石碳酸（C.H,OH）
蒸馏水
a）将碱性复红在研钵中研磨后，逐渐加人95%酒精，继续研磨使之溶解，配成甲液。b）将石碳酸溶解在蒸馅水中配成乙液。c）把甲液和乙液混合摇勾，成为石碳酸复红，通常可将混合液稀释5～10倍使用。稀释液易变质失效，一次不宜多配。B1.2染色方法
B1.2.1取少量培养菌涂于载玻片水滴中，涂成薄层。B1.2.2自然干燥或稍加热。
B1.2.3在石碳酸复红染1min后，水洗，干后镜检。B1.3染色结果
菌体为红色，菌体周围有一层透明圈即为英膜。B2
芽胞染色法
B2.1染色剂
B2.1.15%孔雀绿
孔雀绿（C23H2sCIN,）
蒸馏水
B2.1.20.05%碱性复红
碱性复红（CH2CIN，）
95%酒精
B2.2染色方法
B2.2.1制片。
B2.2.2加孔雀绿染液3～5滴于涂片处，酒精灯火焰加热至冒汽，但不沸腾，并随时补加染液，维持涂片处不干，染色约5~10min。
B2.2.3自来水冲洗30s。
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B2.2.4用0.05%碱性复红染色1min，水洗，镜检（若0.05%碱性复红浓度太高，可根据具体情况适当稀释)。
B2.3染色结果
芽胞绿色，菌体红色。
B3革兰氏染色法
B3.1染色剂
B3.1.1结晶紫染色液
甲液：结晶紫（C2H3CIN，·9H,O）乙醇（95%）(CH,CH2OH）
乙液：草酸铵［(NH),C,·H,O)
蒸馏水
甲，乙液相混，静置48h后使用。B3.1.2卢哥(Lugol)氏碘液
碘(I2)片
碘化钾(KI)
蒸馏水
先用少量（3~5mL）蒸馏水溶解碘化钾，再投入碘片，待碘全溶后，加水100mL，配成母液，使用时加两倍水，稀释成卢哥氏碘液。B3.1.3脱色液：95%乙醇。
B3.1.4复染液：0.5%的番红水溶液2.5%番红酒精溶液
蒸馏水
B3.2染色方法
B3.2.1制片。
滴加结晶紫液，覆盖1min。
用水冲净结晶紫液。
B3.2.4滴加碘液冲去残水，并覆盖1min。B3.2.5
用水冲去碘液，用吸水纸吸去水分。10ml
加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30s后水洗，吸去水分。番红染色液染10s后，自来水冲洗。干燥，镜检。B3.3染色结果
革兰氏正反应菌体垦紫色，负反应菌体呈红色。鞭毛染色
B4.1染色剂
甲液：丹宁酸（C6Hs2046）
氟化铁（FeCL）
甲醛（15%）（HCHO）
氢氧化钠(NaOH)(1%）
蒸馏水
乙液：硝酸银（AgNO，）bzxZ.net
蒸馏水
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