本标准规定了高效液相色谱(HPLC)法测定配合饲料、预混合饲料及浓缩饲料中呋喃唑酮的方法。本标准可用于含10mg/kg～5 000 mg/kg呋喃唑酮的配合饲料和含量为0.5%～20%的预混合饲料及浓缩饲料。 NY/T 727-2003 饲料中呋喃唑酮的测定高效液相色谱法 NY/T727-2003 标准下载解压密码：www.bzxz.net

NY/T727--2003
本标准修改采用ISO14797：1999（E）《高效液相色谱法测定饲料中呋喃唑酮含量》（英文版）。本标准根据ISO14797：1999（E)重新起草。考虑到我国国情和实验室设备状况，在采用ISO14797：1999（E)时，本标准做了一些修改。有关技术性差异和编辑性修改已编人正文中并在它们所涉及的条款的页边空白处用垂直单线标识。在附录B中给出了这些技术性差异及编辑性修改的一览表以供参考本标准的附录A、附录B均为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标推由全国饲料标准化技术委员会归口。本标准负责起草单位：国家饲料产品质量监督检验中心（北京），参加起草单位：农业部饲料工业中心。
本标主要起草人：闫惠文、杨曙明、赵小阳、王彤、杨文军。1范围
饲料中联腩唑酮的测定
高效液相色谱法
NY/T 727-2003
本标准规定了高效液相色谱（HPLC)法测定配合饲料、预混合饲料及浓缩饲料中呋唑酮的方法。本标准可用于含10mg/kg~5000mg/kg肤喃唑酮的配合饲料和含量为0.5%~20%的预混合饲料及浓缩饲料。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准·然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样方法
3原理
配合饲料以少量水湿润，用乙睛和甲醇的混合液将峡嘴唑酮提取出来，预混合饲料和浓缩饲料直接用乙睛和甲醇的混合液将呋唑酮提取出来，提取液经氧化铝短柱净化，用稀释液稀释后在反相HPLC上分离，紫外检测器365nm处测定。4试剂和材料
除非另有说明，在分析中仅使用确认为优级纯或色谱纯的试剂。4.1水：符合GB/T6682级用水的规定4,2提取剂：乙：甲醇一1：1。充分混匀，使用前放至室激。4.3稀释剂将350mL提剂（4.2)与650mL水（4.1)混合。4.410%乙酸溶液：将10 mL冰乙酸用水稀释至100mL4.5乙酸钠缓冲液c(CH,COaNa)=0.01 rmol/L.pH=6.0。用约700mL水溶解0.82客乙酸钠，用Z酸溶液（4.4）将pH调至6.0，加水稀释至1000mL，混勾。
4.6HPLC流动相：取800mL乙酸钠缓冲液（4.5）和200mL乙腈，混合均勾，通过0.2um的滤膜过滤，用前超声脱气10 min。
4.7呋喃唑酮标准物：N-(5-硝基-2-呋喃甲叉)-3-氮基-2-噬唑烷酮。注意：由于肤腩唑酮对光十分敏感，所有操作都应在避光条件下操作，操作时还应避免吸入，接触有毒的肤腩唑蘭标准物和溶液，配制溶液要在通风橱内进行，二作注意带眼镜、穿工作服防护。4.8呋喃唑酮备液（约250私离/ml）：称取25mg土1mg呋喃唑酮标准物（4.7），准确至0.1mg，用提取液（4.2）溶解，稀释至100ml，混勾，贮于0℃~8℃冰箱中。计算溶液浓度时要计人标准物的纯度。溶有效期个月。
4.9呋唑酮工作液（约5热冠/mL和12.5g/mL）：准确吸取2.0mL和5.0ml贮备液（4.8）分别置于100mL容量瓶中，加65mL水，用提取液（4.2）稀释至刻度并混匀，每批样品均需制备新鲜的工NY/T 727--2003
作液。
4.10中性氧化铝，活度1（对于全去活的氧化铝可有0%～1%的水）。处理方法如下：将中性氧化铝（100目～200目）放人马福炉，于550℃灼烧3h，移至干燥器中冷却，装人密封容器中保存。
5仪器设备
常用的实验室仪器设备，特别是下述仪器设备：5.1pH计（带温度补偿，精确至0.01)。5.2溶剂过滤系统，全玻璃滤器，孔径0.2μm。5.3超声水浴。
5.4振荡器，水平方向振荡，频率250r/min～300r/min。5.5过滤装置，使用中速滤纸。
5.6玻璃纤维。
5.7玻璃层析柱，长30cm，内径10mm，末端缩小能放置玻璃毛。过滤系统，能安放孔径为0.2μm聚二氟乙烯（PVDF)或聚四氟乙烯（PTFE)滤膜。5.8
5.9HPLC系统，由下述部件组成：5.9.1泵，无脉冲，能将流速保持在0.1mL/min～2.0mL/min。5.9.2进样系统，进样环体积20μL~～50μI.。5.9.3UV检测器，适合在波长365nm测定。如可能可使用二极管阵列检测器，其还能用于呋唑酮的确证。
5.9.4记录仪。
5.9.5保护柱：长20mm，内径3.9mm，填有粒度为37μm~100μm的Ci8键合硅胶或质量相当的其他保护柱。
5.9.6分析柱：柱长200mm，内径3.0mm，填有粒度为5um的键合硅胶的C18柱或性能相当的其他分析柱。
分析柱的性能应确保以下条件：呋喃唑酮的容量因子 K'≥1。
注：容量因子的计算见式（1)
K'=R-1
式中：
K'-—容量因子；
tr—呋喃唑酮的保留时间，单位为分钟（min)；t—不保留成分的保留时间，单位为分钟(min)。5.10微量注射器。
6试样制备
按GB/T14699.1采集实验室样品。将实验室样品（通常500g）粉碎，使之全部通过1mm筛，充分混勾。贮于磨口瓶中备用。
7分析步骤
7.1一般要求
每次测定均应平行进行空白样品、空白添加样品的测定，如果可能还要进行参比样品的测定。注意：空白样品是一些味唑酮含量小于10mg/kg样品的均匀混合物，空白添加样品是添加了峡2
喃唑酮的空白样品。空白样品和参比样品在0℃～8℃下可贮存一年。如测得的添加回收率小于94%或大于106%，分析应重新进行。7.2空白添加样品的制备
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添加样品中呋喃唑酮含量应与测试样品中预期的呋喃唑酮含量相当。制备方法如下例：欲制备个呋喃唑酮含量为250mg/kg的添加样品，准确吸取5.0mL呋喃唑酮贮备液（4.8)置于250mL三角瓶中，用氮气吹至剩约0.5mL，加入5g空白饲料样品，充分混匀，放置至少10min，然后再做提取。
7.3提取
称取适量制备好的试样，置于适当的三角瓶中，准确加入一定体积（如需要）的水，混合后放置5min，准确加人提取剂（4.2），盖好盖子，置于回旋振荡器上剧烈振摇30min，用过滤装置（5.5）过滤，滤液按7.4规定进行柱层析。
用稀释液（4.3)稀释滤液，使最后溶液中呋喃唑酮含量达5ug/mL～10μg/mL。充分混匀，用过滤系统(5.8)过滤，滤液按7.5所述进行HPLC分析。具体提取条件见表1。
样品中呋喃唑酮含量
10 mg/kg~~2 500 mg/kg
2 500 mg/kg~5 000 mg/kg
0. 5% ~7%
7%～10%
10% ~20%
7.4柱层析
称样量
5g±50mg
5 g±100 mg
1g±50mg
1 g±10 mg
0. 5g±5mg
水/ml
提取剂/mL
每个样品提取液，需用一根干法填充的玻璃层析柱。该玻璃层析柱下端放人一小团玻璃纤维（5.6），上面填有4g中性氧化铝（4.10）。向柱中加人20mL根据7.3制备的样品提取液，弃去最初的4mL流出液，用刻度试管收集随后的8mL流出液。必要时，将流出液用稀释剂（4.3）稀释，使呋喃唑酮含量达5μg/mL～10μg/ml，稀释倍数为f。用过滤系统（5.8)过滤，滤液按7.5所述进行HPLC分析。7.5HPLC分析
7.5.1色谱条件
a）流动相流速：0.6mL/min；
b）进样量：20 μL；
c）检测波长：365nm。
7.5.2分析程序下载标准就来标准下载网
7.5.2.1向HPLC分析仪中连续注人呋喃唑酮工作液（4.9），直至得到基线平稳，峰形对称而且峰高或峰面积能够重现的呋喃唑酮峰，即三个连续测定的峰高或峰面积中最大与最小值间的差异小于其平均值的5%。
喃唑酮峰应是对称的（f。。<2）。注：fa为呋喃唑酮峰峰高10%处，尾半部峰宽与前半部峰宽之商。两个呋喃唑酮工作液所得色谱峰峰高与浓度间应有正比例关系，如果偏差大于5%，则需制备新的工作液。
注人空白样品和添加空白样品的提取净化液，如果呋喃唑酮峰形不对称或不能与基质中的杂峰分开，需更换分析柱或改变流动相中有机相与水相的比例。依次注人呋喃唑酮工作液（4.9）、五个样品提取（净化）液和喃唑酮工作液（4.9），观察工作液的峰3
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高或峰面积差异不得超过均值的5%。可依此顺序不断加人待测样品。7.5.2.2如果测得的喃唑酮含量明显低于预期值.则需用比7.3所列体积多50 mL提取液（4.2)重新提取样品并上机分析。
如果新的分析结果较前一结果高出15%以上，则需用再多50mL的提取液（4.2）重新提取样品并上机分析，如此重复，直至两次测定的结果差异小于15%为止。8确证
8.1总则
如果从峰形、测定数值对呋喃唑酮的峰产生了怀疑，或所测定呋喃唑酮含量低于25mg/kg，则必须用重叠色谱分析（8.2)或二极管阵列检测器（8.3)来确证。8.2重叠色谱法
于样品提取液中加人适量的呋喃唑酮工作液（4.9），加人的量应与提取液中呋喃唑酮的量相当。依次注人样品提取液、喃唑酮工作液和添加了呋喃唑酮的样品提取液。如果添加提取液样品峰的半峰宽变化不大于10%，且峰高或峰面积发生了成比例的变化，则可确证原呋喃唑酮峰就是呋喃唑酮的。
8.3二极管阵列检测器
8.3.1条件
测定条件同7.5.1的规定，只是将UV检测器换为二极管阵列检测器，具体参数如下：参数
测定波长
频带宽度
参比波长
参比频带宽度
光谱范围
光谱值
8.3.2步骤
4nm（即波长365±2nm）
100 nm
225 nm～400nm
基线、峰最大值、上升斜率和下降斜率拐点HPLC系统稳定后，依次注入5μg/mL的呋喃唑酮工作液（4.9）、有疑问的样品提取液和又一5ug/mL的呋喃唑酮工作液（4.9）。记录、存储各个色谱峰的基线、最大值以及峰两侧的拐点数据8.3.3评价
将样品峰不同光谱值（样品一-基线）归一化并绘制成图，记录峰值和峰前后的拐点值。分别将样品峰光谱和呋喃唑酮工作液的光谱归一化，并绘图。在峰顶处标示。8.3.4确证标准
样品峰只有满足下述条件，才能证实是呋喃唑酮：a）样品峰的保留时间应与标准峰的保留时间相同（差异≤土5%），如有怀疑，需做标准物添加（即将标准物加到样品中)实验。
b）样品峰的纯度评定是基于所记录的峰顶、上升斜率拐点和下降斜率拐点不光谱的符合程度。所有光谱图每个波长的相对吸收值应该相等（差异≤15%）。波长大于220nm、样品光谱图与标准光谱图在相对吸收至少等于10%的部分无明显区别，样c）
品峰和标准峰的最大吸收波长相同，即其差异不大于检测系统分辨率决定的范围（一般是2nm~～4nm），两个光谱图任一观察点的偏差均不能超过该特定波长下标准测定物吸收值的15%。
9结果计算
样品提取液中哄喃唑酮的含量是通过比较样品提取色谱峰的峰高或峰面积和在样品前后注人的4
呋喃唑酮工作液的峰高或峰面积的平均值而计算出来的。9.1呋喃唑酮含量为10mg/kg~～5000mg/kg的样品：配合饲料样品中呋喃唑酮的含量Wt，可用式(2)计算：Wt
式中：
试样中呋喃唑酮的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；A
试样提取液测得的色谱峰面积；呋喃唑酮标准工作液测得的色谱峰面积；标准工作液中呋喃唑酮含量，单位为微克每毫升（μg/ml.）；加到试样中的提取液体积，单位为毫升（mL）；试样质量，单位为克（g)；
提取液的稀释倍数。
注：也可用峰高代替峰面积做计算。结果保留至1 mg/kg。
9.2喃唑酮质量分数为0.5%～20%的样品。预混合饲料或浓缩饲料中呋喃唑酮的质量分数Wip，可用式（3)计算：A×C。×
×f× 10
式中：
试样中呋喃唑酮的含量，%；
试样提取液测得的色谱峰面积；A
呋喃唑酮标准工作液测得的色谱峰面积；C.—一标准工作液中呋喃唑酮含量，单位为微克每毫升（μg/mL）；V
加到试样中的提取液体积，单位为毫升（mL）；试样质量，单位为克（g）；
提取液的稀释倍数。
注：也可用峰高代替峰面积做计算。结果保留至0.01%。
10精密度
10.1重复性
在同一实验室由同一操作人员完成的两个平行测定的结果应满足以下要求：a）当喃唑酮含量为10mg/kg～5000mg/kg时，相对相差≤8%；b）当喃唑酮含量为0.5%～~20%时，相对相差≤10%。10.2再现性
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·（2)
在不同实验室由不同操作人员用不同的仪器设备完成的两个测定结果应满足以下要求：a）当呋腩唑酮含量为10mg/kg~5000mg/kg时，相对相差≤17%；b）当喃唑酮含量为0.5%~~20%时，相对相差≤20%。5
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附录A
（资料性附录）
呋嘴唑酮标准色谱图和光谱图
肤腩噬酮标准色图
20.0022.00
260.00280.00300.00320. 00340.00360.00380.00400.00420.00440.00图2肤喃唑酮标准光谱图
（资料性附录）
本标准与IS014797：1999（E）技术性和编辑性差异及其原因NY/T 727.---2003
表B.1本标准与ISO14797：1999(E)技术性和编辑性差异及其原因本标准的章条编号
技术性及编辑性差异
增加了浓缩饲料的测凝。
将最低检测限由原标准的 25 mg / kg 修改为 10 mg/kg。
增加了GB/T14699.1--1993.
增加了 GB/T 6682。
增加了GB/T14699.1-1993。
除了 ISO 6498.
修改了原提取步骤的编排格式。此处为编辑性修改。
增加了“或所测定呋唑酮含量低于25 mg/kg\。
将“可用”改为“赠必频用”
将计算公式中的蜂高改为蜂面积。原
这一修改是针对我国浓缩饲料产量较高，以增加方法的适用性。
根据实验数据，我国饲料生产中存在主动与被动加人呋嘴唑酮的情况，后者含量-般较，方法力求将两种体说到有效控。
以适合我国国情。
力求本标谁与我国其他相关标催的配套性。
简化标准格式，便于操作潜使用。力求做到测定的准确性。
力求与我国其他标推近。
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