NY/T 1467-2007 奶牛布鲁氏菌病PCR诊断技术 NY/T1467-2007 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS11.220
中华人民共和国农业行业标准
NY/T1467—2007
奶牛布鲁氏菌病PCR诊断技术
PCR for diagnosis of brucellosis in dairy cattle2007-12-18发布
2008-03-01实施
中华人民共和国农业部
NY/T1467-2007
目前，我国家畜布鲁氏菌病的诊断主要方法包括虎红平板凝集试验、试管凝集试验、补体结合试验、乳牛全乳环状试验等血清学方法（GB/T18646-2002)，没有列人病原诊断的内容。对牛布鲁氏菌病的诊断，OIE推荐或指定的血清学诊断方法包括血清凝集试验（SAT）、补体结合试验（CFT）、酶联免疫吸附试验(ELISA)；病原诊断采用常规病原分离鉴定技术，并认为PCR方法的建立为该病的诊断提供了新的检测手段，可标准化后推广使用。本标准的附录A为资料性附录，附录B为规范性附录，附录C为规范性附录本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所本标准主要起草人：邱昌庆、曹小安、周继章。1范围
奶牛布鲁氏菌病PCR诊断技术
本标准规定了检测牛种布鲁氏菌（Babortus）套式聚合酶链反应诊断方法要求。NY/T1467-—2007
本标准适用于奶牛布鲁氏菌病的病原诊断、奶牛场检疫、疫情监测和流行病学调查。其他偶蹄动物布鲁氏菌病PCR诊断可参照本标准。2材料准备
2.1器材：PCR扩增仪、1.5mL离心管、2.0mL离心管、0.2mLPCR反应管、水浴箱、台式高速温控离心机、电泳仪、移液器、移液器吸管、紫外凝胶成像仪、冰箱。2.2试剂:NET缓冲液，自配，配方见附录A：RnaseA酶、蛋白酶K、TagDNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTPs、DL2000DNA分子质量标准、无水乙醇、酚-氯仿一异戊醇（25：24：1）、Tris、琼脂糖、EDTA、冰乙酸、氟化钠、溴酚蓝、二甲基苯青FF、溴化乙锭、十二烷基硫酸钠（SDS）、乙酸钠、盐酸、聚蔗糖。2.3引物：
Bp15\-CGTGCCGCAATTACCCTC-3\Bp25-CCGTCAGCTTGGCTTCGA-3\
Bp35-GATGCTGCCCGCCCGATAA-3
Bp45'-GCACCGAGCGAGCCTTGAAA-3引物在使用时用灭菌双蒸水稀释为50pmol/L。2.4被检材料：奶牛新鲜原乳、流产母牛乳汁、流产母牛阴道分泌物、血液（血清）、流产胎儿胃液、种公牛精液。布鲁氏菌病疑似病例病料采集和运输注意事项见附录B。2.5布鲁氏菌总DNA的提取。
2.5.1原乳乳样中布鲁氏菌总DNA的提取方法。2.5.1.1在室温下溶解冻存乳样（乳样长期保存应置于一20℃，当日检测可置于4℃），取500μL奶样于2mL离心管中，加人100μLNET缓冲液。2.5.1.2加人100L20%的SDS（终浓度3.4%），混匀。在95℃～100℃孵育10min后，迅速放置于冰上冷却10min～15min。
2.5.1.3在样品中加人RnaseA酶至终浓度为75ug/μL,50℃作用2h。然后加人蛋白酶K至终浓度为325μg/μ，50℃作用2h。
2.5.1.4在消化液中加入等体积的酚一氯仿一异戊醇（25：24：1)，颠倒2次～3次，摇匀，4℃下7000r/min离心10min。
2.5.1.5移上清液于另一离心管中。2.5.1.6重复2.5.1.4、2.5.1.5操作过程，加人2.5倍体积的预冷无水乙醇，一20℃沉淀30min，12000r/min离心10min，弃去所有液相。2.5.1.7用1mL70%乙醇漂洗，12000r/min离心2min，重复2次~3次。2.5.1.8真空或室温干燥，DNA沉淀物用25uL无菌双蒸水溶解作为模板，保存在一20℃备用。2.5.2血液中布鲁氏菌总DNA的提取。2.5.2.1血液分离血清。
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2.5.2.2布鲁氏菌总DNA的提取方法同2.5.1。2.5.3胃液中布鲁氏菌总DNA的提取胃液中布鲁氏菌总DNA的提取方法同2.5.1。2.5.4流产母牛阴道分泌物中布鲁氏菌总DNA的提取2.5.4.1用NET缓冲液2mL冲洗棉签蘸取的流产母牛阴道分泌物。2.5.4.2牛阴道分泌物中布鲁氏菌总DNA的提取方法同2.5.1。2.5.5流产胎衣中布鲁氏菌总DNA的提取2.5.5.1取病变明显的一小块流产胎衣剪碎或刮下黏膜层，将碎组织块或黏膜层置于2mL离心管中，加入400μLNET裂解缓冲液（pH7.6）。2.5.5.2胎衣中布鲁氏菌总DNA的提取方法同2.5.1。2.5.6公牛精液中布鲁氏菌总DNA的提取2.5.6.1取100μL精液，加入500uLNET裂解缓冲液（pH7.6)。2.5.6.2公牛精液中布鲁氏菌总DNA的提取方法同2.5.1。3PCR试验免费标准bzxz.net
3.1反应体系
第一次PCR扩增：
10×PCRbuffer(含Mg2+）
脱氧三磷酸核苷酸混合液（dNTPs）BP1和BP2引物
模板（被检样品总DNA）
无菌双蒸水
TaqDNA聚合酶
第二次PCR扩增：
10XPCRbuffer（含Mg?+）
BP3和BP4引物
模板（一扩产物）
无菌双蒸水
TagDNA聚合酶
各1μ
各1μ
样品检测时，同时要设阳性对照和空白对照，阳性对照模板为布鲁氏菌omp25阳性质粒，空白对照为双蒸水。
3.2反应程序
第一次PCR扩增：首先95℃变性5min，然后35个循环；分别为：94℃变性1min；49℃退火1min；72℃延伸1min。最后72℃延伸10min。第二次PCR扩增：20个循环，分别为：94℃变性30s；51℃退火1min；72℃延伸1min。最后72℃延伸6min。
3.3电泳
3.3.1制板
1%琼脂糖凝胶板的配方和制备，将1g琼脂糖放入100mLTAE电泳缓冲液中，加热融化。温度降至60℃左右时，加入10mg/mL溴化乙锭（EB)3L～5L，均匀铺板，厚度为3mm～5mm。2
3.3.2加样
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PCR反应结束，取第二次扩增产物各5μL（包括被检样品、阳性对照、空白对照）、DL2000DNA分子质量标准5uL、上样缓冲液1μL进行琼脂糖凝胶电泳。3.3.3电泳条件
凝胶电泳的条件和操作同常规。3.3.4胶成像仪观察
扩增产物电泳结束后，用凝胶成像仪观察检测结果、拍照，记录试验结果。4PCR试验结果判定
4.1将扩增产物电泳后用凝胶成像仪观察，DNA分子质量标准、阳性对照、空白对照为如下结果时试验方成立，否则应重新试验。
DL2000DNA分子质量标准（Marker）电泳道，从上到下依次出现2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp6条清晰的带。阳性对照电泳道出现一条419bp清晰的带。空白对照电泳道不出现任何带。4.2被检样品结果判定
在同一块凝胶板上电泳后，当DNA分子质量标准、各组对照同时成立时，被检样品电泳道出现一条419bp的带，判为阳性（十）；被检样品电泳道没有出现大小为419bp的带，判为阴性（一）。结果判定参见附录C图1。
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Tris-HCl
50mmol/L
125mmol/L
50mmol/L
附录A
(资料性附录）
NET缓冲液(pH7.6)配方
附录B
（规范性附录）
布鲁氏菌病疑似病例病料采集和运输注意事项NY/T14672007
B.1法律依据：《中华人民共和国动物防疫法》、《病原微生物实验室生物安全管理条理》、《动物检疫管理办法》、《国家动物疫情测报体系管理规范》。B.2怀孕奶牛发生流产，一律先按布鲁氏菌病疑似病例对待采样。B.3现场采样的工作人员要穿工作服和胶鞋、戴上口罩、防风眼镜和一次性塑料手套或乳胶手套，做好个人安全防护。
B.4采病料用的工具，手术刀、剪、镊子分别包装并提前干烤消毒，灭菌的加盖塑料管，灭菌的塑料袋一次性注射器、灭菌棉签、胶布，胶带，记号笔，保温桶。使用前要仔细检查塑料管、消毒的塑料袋，有破损者不得使用。
B.5病料采集：用一次性注射器抽取流产胎儿的胃液5mL～8mL，用手术刀、剪、镊子采病变明显的流产胎衣2cm×2cm两份；用消毒棉签蘸取流产母牛阴道分泌物或排出物取样两份；用一次性注射器采取流产母牛静脉血3mL两份；采流产母牛乳汁5mL～10mL两份。一份病料放入一只塑料管，盖好盖子，胶布封口，在塑料管壁记录畜种、编号、病料名、采样时间，然后将同一头牛的各种病料塑料管放入一个塑料袋封口，在塑料袋上同样记录畜种、编号、病料名、采样时间。将装有病料的塑料管竖直口朝上和冰袋一块放入保温桶，盖好盖子，胶带封口。派车专程送往有条件的实验室进行布鲁氏菌PCR检测。检测完成后，要及时无害化处理。阳性病料放入密封袋中，登记后冻存在专用柜中，备复检。B.6在运送病料的过程，装病料的保温桶不得倾倒，以防液体外溢。到达目的地后，对车体应全面消毒。
B.7现场采完病料，立即无害化处理胎衣、流产胎儿，现场要用2%烧碱溶液或其他有效的消毒剂彻底消毒。将流产母牛隔离，由专人饲养，待检测结果出来后，再做进一步处理。如果确诊为布鲁氏菌病，要按相关规定淘汰流产母牛。同时，禁止该畜群外调，并对整个牛群进行布鲁氏菌病检疫，逐头检测，淘汰阳性牛只，半年复检一次，直到全部阴性。B.8种公牛每次鲜精采集后的处理分装，应在生物安全柜或生物安全实验室内进行，以防污染，然后随机取两份样品，密封、登记，送往有条件的实验室用PCR方法进行布鲁氏菌检测。检测完成后，要及时无害化处理。阳性精液放入密封袋中，登记后冻存在专用柜中，备复检。NY/T1467-2007
M.DL2000marker
1.阳性对照
2.阴性对照
3、4.为检出的阳性样品
5.检出的阴性样品
附录C
（规范性附录）
样品检测结果判定图
图1奶样PCR检测结果电泳图
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