NY/T 1491-2007 花卉植物病毒检测规程 NY/T1491-2007 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS 65.020
中华人民共和国农业行宁业标准NY/T1491--2007
花卉植物病毒检测规程
Rules for viruses detection on floral plants2007-12-18 发布
2008-03-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准的附录A.附录B和附录C为规范性附录。本标准由华人民共和国农业部提出并归口。NY/T1491—2007
本标准主要起草单位.农业部花开产品质量监督检验测试中心（昆明）、农业部蔬莱产品质量监哲检验测试中心(北京)。
本标推起草人：唐开学、王继华、主丽花、翌素萍、张颇、熊丽、刘肃、陆琳、苏艳、H
1范围
花卉植物病毒检测规程
本标推规定了主要花并植物常见病声的检测方法本标准适用丁主要花植物常见病的检测：2规范性引用文件
NY/T1491-2007
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内穿）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究尼否可使用这些文件的最新版。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T8247-2000主要花卉产品等级3定义
脱毒核心材料nuclear stok uf virus free初次应用茎尖分生组织脱毒或其他有效脱毒方法培养形成的无病毒的再生材料。3.2
扩繁材料propagatian stock
由脱毒核心材料在严的隔离条件卜生产出的符合质量标淮的种苗(球）。3.3
生产用材料certifiedstock
用扩繁材料在隔离条件下牛产川的符合质量标准的种苗（球）3.4
病毒病株允许率tolerance f wirus plant同一检验批次的花斤植株中病毒病株允许存在的最人限度，用病毒病株数凸桔株总数的百分率表示。
4抽样
4.1脱毒核心材料
每株（粒)均需检测。在继代培养中，每3个月捡测一次随机选取每株的中，上位置组织作为恰测样品。样本在4C6℃下保存24h内检测。4.2扩材料及生产用材料
抽样方法分为两次抽样。第-次抽样从同检测批次中随机抽取，抽样比例小于等于1000株（粒），按6%~10%抽取，最低抽样数量为100株（粒），不足100株（粒）时全部作为检测样品：人F10000株（粒），按3%~5%抽取，最大样品抽样数为1000株（粒）。第二次抽样在第一次抽取的样品中再随机抽取10%
5主要检测对象
5.1鑫香石竹
NY/T1491—2007
豪香石竹斑骏病毒（arnuziunmotlecarmnwirus（CarMV）穿香石竹死班斑点病毒Caruzrionnrcroricfleckclosterovirus（CNFV)麝香石竹潜隐病南Carnation latemcartavirus(cLV)穿香石竹蚀环病毒（urnationelchedringcautimouirus（CERV）香石竹叶脉斑驳病毒(arnationveinmollepotyirus(CVMV）扇香i竹环斑病毒arnationringspotdianthouirus（CRSV）5.2菊花
菊花B病毒ChrysanthenmumBcariauirus（CVB)番茄斑萎病毒Tonatuspuuewilttospouirus（TSWV）番茄不李病毒Tomatnaspermycucunawirus（TAV）黄瓜花叶病毒(ucumber mosaic cucumnurus （CMV)）5.3满天星
黄瓜花叶病毒ururmber osaic curumovirus （CMV)5.4火鹉
芋花叶病毒Dasheen niasaic potyuirus（DsMV）5.5非洲菊
烟草脆裂病毒Tobaccorattletohruuirus（TRV）黄瓜花叶病毒Cucumber moseuic cucumozirus（CMV)番茄斑病毒Tonatospntedrilttuspuuirus【TswV）5.6月季
苹果花叶病毒Applemesaxcilaruirus（ApMV）本坏死环斑病毒Prunus necrutic ringspot itaruirus（PNRsV)5.7一品红
-品红花ul病毒Pninsettia mosaic tymovirus（PoMV）5.8洋桔梗
黄瓜花叶病毒Cucumtermusaiccucumozirus（CMV)）烟草脆裂病毒Tobaccorattletnhruuirus（TRV）5.9卦血草
黄瓜花叶病毒Cucumhermosaiccucumouirus（CMV）芜肯花叶病毒Turni边mosaicbotyvirus（TuMV）5.10百合
黄瓜花叶病毒Cucumbermesaiccucumouirus（CMV)百合儿症病毒Lilysympanmiesscarlauirus（LsV）白合斑酸病毒Litvmottleutymirus（LMoV）5.11郁金香
郁金香碎他病毒Tulipbreakingpotyuirues（TBV）黄瓜花叶病毒Cucumbermnsaiccucunurus（MV）百合症病毒Lilysyprentessarlarnrus(LsV)5.12莺尾
尾重花叶病毒Irisseueremosaicpotytirus（ISMV）水仙潜隐病毒Narcissuslatentmacluruirus（(NalV)5.13唐首蒲
菜豆黄花叶病毒BeunyelLoremosaicpntyuirus（BYMV）烟草花叶病毒TohaccomosaicItbanuuirus（TMV)黄花叶病毒Cucumbermosaiccurumouirus（CMV)5.14马蹄莲
芋花叶病聋 Dasheen mosaic pot yuirus (LsMV5.15水仙
黄瓜花叶病毒Cucumberosaiccucumnuirus（CMV）水仙花叶病毒Narcissusmosaicpotervirus（NMV)水仙黄条斑病毒Narcissus vellurstripepotyvirus（NYV）5.16兰花
建兰花叶病毒Cymbtdium mosaic poteuvirus (CymMV)齿兰环斑病毒（dontngtossumringspottobumouirus（ORsV）烟草花叶病毒Tobaceomosaictobainrvirus（TMV)5.17凤仙花
凤仙花坏死斑点病毒Impatiens mecrotic pot tnspouirus （IVSV）黄瓜花叶病毒Cucumbermosaiccucumuvirus（CMV）番茄斑萎病毒Tnnutusputtedteilttospuvirus（TSwV）5.18仙客来
黄瓜花叶病毒Cucumbermosaiccucumnirus（MV）5. 19凤梨
番茄斑萎病毒Tmnatosputtedteilttaspauirus（TSWV）6检测方法
指示植物检测法按附录A执行
双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)按附录B执行：反转录一聚合酶链式反应(RT-PCR)按附录C执行,7质量要求
各种花卉种苗（球）病毒病株允许率应符合GB/T18247—2000中的规定NY/T1491—2007
NY/T1491—2007
A.1指示植物的栽植
每次检测指示植物数量不应少株，附录
[规范性附录]
指示植物检测法
种子播种于经过消毒的富含有机质士壤的花盆中，出苗后移栽到苗盘，真叫长至2片～3片时分欲移裁,第4 叶～6 叫完全展开后接种栽植的环境条件：温度为20℃~25℃，光照时数为12h，A.2机械摩擦接种
将待测样品与3倍量（W/V)的磷酸缓冲液(0.2Iol/L,PH7.4)混合研磨，用细纱布过滤句浆液在10c0g~-10C00下离心10min15min后取上清液：接种时,叶面喷撤300目~600目金刚砂粉，用毛笔上清液摩擦叶片表面：接种后，立即用蒸馏水冲洗被接种叶片，每株指示植物只接种个样品，且每株指示植物接种两片以上叫片每次检测均设阳性阴性和空内对照，A.3管理
将植株裁培干20.~～2:℃严格隔离的防虫温室中,盆间距 50 I。遂H观察记录指示植物症状,各种花升病毒在指示植物上的症状见表A.1。A.4结果判断
根据指示植物症状.确定病毒有无。在所有接种的指示植物中只要有一株表现典型症状，该样品即为阳性。
表 4. 1 指示植物及症状
病毒种类
中文名
窦香仁竹坎死班点病毒英色葵
菊花B病击
矮牵牛
番茄不孕病击
黄瓜花叶病毒
芋花叶病荐
烟草脆裂病亭
芜普花叶病毒
百合无症病毒
郁金香碎色病素
水仙花叶病毒
兰花叶病市
齿“环既病南
心叶竭
春羽蔓绿绒
克利尖兰烟
爵香百合
台百合
燕色藜
指示植物
拉丁学名
Chenopretinn imatunricntar
Peaniea hgfricde!
Nicotiuna glutinusd
CMnn Stitn.
Philodemdrnn selloum
Nicotiama.clevtanini
Nicotiarut intzrum cy. Whie IiurleyLiliwn iongifluum
JFilium formusanum
Pinum sativnzn
Chemtotinarartiolrr
Nictian talnti , Xanthi.
指示植物症状
局部绿斑
黄化或坏死
褪绿或坏死斑
系统花叶
系统性叶脉选绿
后部环死斑或褪绿
边球竭他的局部坏死斑
叶片出现扭曲和白色涤斑
既驳或条纹
局部坏死斑
接种叶上形成大的污渍状病斑
局部坏环死研或环形斑
B. 1设备和材料
附录B
（规范性附录)
双抗体夹心酶联免症吸附(DAS-EL,ISA)检测法所用移液枪头、离心管、镊子等皆用蒸馏水清洗后，高温消毒。NY/T 1491 -2007
B 1. 1微量移液器:200 μl.--1 000 μI.,20 μI ~200 μL,10 μL~-100 μL,0. 1 μL~J0 μL,B.1.2 电-于天：感量为0.01 g,0. 0001gB. 1. 3离心机。
B.1.4冰箱
B.1.5恒温箱。
B.1.6酸度仪。
B.1.7洗板机、
B.1.8酶标检测仪。
药品和试剂
所用试剂为分析纯·水为蒸馏水，酶标抗体为碱性磷酸酶标记抗体，B.2. 1包被缓冲液(0. 05 mol/ I, Na2COs—NalICO 缓冲液,plI9. 6)1.5g
NaaCOa
Nalico
加蒸馏水游解至1000mL,调至pHl为9.6。B. 2. 2 洗涤缓冲液 ( PBST,pH 7. 4)Nacl
Na.HPO4- 12H.O
Tween-20
加馏水溶解至000ml,调至pH7.4。B.2.3样品磨碎缓冲液
脱脂奶粉
聚乙烯吡咯烷酶（PVP,MW2-）
无水亚硫酸钠
Tween- 20
溶于 PBST中,定穿至 1000 mL,1C保存。B.2.4酶标抗体稀释缓冲液(pH7.4)牛血清白蛋白BSA
NY/T 1491-2007
聚乙烯吡咯烷酮(PVP.MW-ccu）
落于PRST，定容至1000ml.1C保存B.2.5底物缓冲液
三艺醇胺
氯化镁
于800rml蒸馅水小,用2mol/1.盐酸调pH至9. 8,定容至1 000mL,4℃保存。B.2.6底物溶液（现用现配)
1 mg PNIPP溶于 1 mL底物缓冲液,浓度为 1 mg/mlB.2.7终止液[3mol/L氢氧化钠溶液】Na0H 120 g·溶于 I000 mL 蒸馏水中：B.3操作步骤
B.3.1包被抗体
在酶标板孔中,人100μI.用包被缓冲按工作度稀释好的抗体，将酶标板放人湿盒巾,置于4（冰箱内孵育过效或案温（20%～~25X:)下孵育4h。B.3.2样品准备
将植物材料和研磨缓冲羧按1：10(W/V)的比例改人一次性自封袋中,将袋口封紧,碾压样品，
B.3.3洗板
孵育结束后-用洗涤缓冲液清洗酶标板4次~-6次。每孔每次加PBST洗液100μL，每次停留I min-~2 min,
B.3.4包被样品
取B.20研磨后的上清液，每孔加100u1，每个待测样品进行2次重复·同时设朗性对照和阳性对照：
将酶标板放,人湿盒中,4℃冰箱内孵育过夜或21℃～24℃ 下孵育2.5h。B.3.5洗板
B.3.6包被酶标抗体
包被前10 rmin 雅备酶标抗休,将特异性酶标抗体用酶标抗体稀释缓冲液稀释至下作浓度，每孔加100μL。酶标板放人凝盘,21%24℃下孵育2.5h。B.3.7洗板
同 R.3. 3.
B.3.8加底物溶液
每孔加人100μl.的底物溶液。酶标板放人湿盒中21℃～24下敲光显色30min～60min：B.3.9加终止液
每孔加人50终止液终止反应。
B.3.10酶联检测
终止反应 20 mrin 内，将酶标板胃于酶标仪中，在4(05 nm 下测定吸收值（(Dacs）.记录反应结果。
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C.1设备和材料
附录心
【规范性附录】
RNA病毒的反转录一聚合酶链式反应(RT-PCR)检测法枪头、离心管和PCR小管等用均用IEP（焦碳酸-Z脂)处理C. 1. 1微量移液器:200 μL~-1 (00μL,20 μL-~200μL、20μI. ~100 μrL,0. 5μL~:0μl。C.1.2电子天平：感量为0.01g和0.0001。C.1.3 高速冷冻离心机。
C. 1. 4 热循环仪( ICR仪)。
C.1.5水平凝胶电泳系统。
C.1.6凝胶成像系统。
C.2药品和试剂
所用试剂为分析纯+用水为双蒸水C. 2. 1 RNA 提取试剂
Trizol.氯伤，异丙醇.70%乙樽，双蒸水。C.2.2反转录试剂
M MLV 反转录酶,5×M -MI.V 缓冲液(250 Jmol/I. Tris - HCl pH 8. 3,375 mmal/ L K(Cl,1 mmel/L Mg(Cl，50 mmol/LLTT).核糖核酸酶抑制剂,20 pmol/μl-随机引物,10 mmol/LdNTP。一20℃贮藏。
C.2.3PCR试剂
7ag DNA 案合/酶, 10 X RBuffer (1C0 inriol/ L. 'Tris - HCl pl 8. 3. 500 mmal/ L, KCI. 15 mmol/ 1,MgCl,),PCR引物(上游、下游）
C.2.45×TBE缓冲液
0. 5 mo:/ L ETTA ( pH 8. 0)
定穿率1000ml,4℃保存。
C.2.5加样缓冲液
0.25%溴酚蓝溶解于40%（W/V)蔗糖水溶液：4℃保存C.3操作步骤
C.3.1RNA的提取
将(, (5 样品组织放入灭菌研体,加人1 ml.Trizol 溶液研成勾浆,将勾浆液移人 l.5 mL离心管中，室温（20%℃～25%）效置5mim，使组织充分裂解，人20μl.氮仿，用力颠倒离心管以混勾，静置5min后，12000r/cmin离心10min。吸取上层水相，移至另一个1.5mL离心管中。加人50Cμl异内醇,混勾,窄温(2℃℃~25)放置10min12 000 r/min离心5 min.弃上清。研人1 ml.75%2醇.握荡8
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片刻后.7500r/min离心5min，小心地弃上清。室温（20C～25C）静置5tnin~15min，使RVA沉淀怡好下燥，加人50双蒸水，落解后备用C.3.2反转录
在0. 5μL PCR管中依次加人以下试剂:双蒸水 ddI.08μl..20 pmol/μL随机引物0.5μL,RNA模板 2μL,70变性10 min,冰上5 tnin，然片加人5×M MLV反转录缓冲液4μl,10 mmol/[. dNTP3μL,40 u/ul 核糖核酸酶抑制剂 0.μl.,200 u/uLM-MIV 反转求酶 1 ul.将以 F:所有成分混勾,低速离心后.热循环仪中42℃反应1h，C.3.3PCR扩增
依次在PCR管中加人：双蒸水32.7，zL10×FCR缓冲液5l,20umul/L上游物1：20 pl/L下游引物1μ,5agDNA臻合酶0.3反转录产物[0μL，充混包,按如卜程序进行PCR扩增：94℃10min.然后按94℃变性30s、退火（溢度详见本附录表（.1)60s.72%延伸60s逝行35个循环，街72t延仲10min
C.3.4扩增产物检测
将5×TBE以1：5稀释成1XTRE工作液，与晾脂糖配制成1.5%（W/V)的落液：加热使助脂糖完全熔化。待凝胶液冷却至50℃～60℃时，加人适量的溴化乙锭（终液度为0.5ug/uL），滞制平台，冷却。将PCR产物按6：1混合加样缓神冲液,点样。按1V/cm-10V/c电冰，至溴酚蓝迁移超过胶板长度的1/2以上，停止也泳，把胶板取出后.用凝胶成像系统进行规察、照相：C.4结果判断
附性对照有H标带出现,阴性对照无带时,检测的结果为有效。检测样品有与阳性对照相同的月标带时为阴性，无目标带为阴性。表 C. 1花卉病毒的特异性引物
病毒名称
百合隐症病再
百合斑驳病毒
(LMov)
黄瓜花病毒
李坏死环斑病声
(PNRSV)
郁金香碎色病毒
香石竹邸骏病毒
(CatMV)
筋花病毒
引物序列（5'--3°)
Pliatg rae tce sga cce gca LnP2, tex: a. att tgr gta tc
Pl; gtt ggt gr:t etr: nia ntt te.Pz:cat etg ttg iat gle te cr.P1:ct tea cat cTe. ia cc 1a
P2:1ac Ltl ctc atg tcg cct arP2:aig glt tgt cga ail igc a?12 :ctc 1ar ate ca agc agg lcPl.gay lac ggt cle aan gac gP2:agH Lll gog eag TRc gce a1gPl:tta gtt igc ccc egl igg ul cr.P2 : aag (g1 cnl. 产物(bp）
1491-2007
中华人民共和国
农业行业标准
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NY/T (492—2007
中国农业出版社山版
（北京市朝阳区麦广店街18号楼）（邮政编码：10002号
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20108年3H第1版
印张1
字数10F
2K8年$月北京第1次印刷
书号：16169·1559
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