NY/T 1756-2009
基本信息
标准号： NY/T 1756-2009
中文名称：饲料中孔雀石绿的测定
标准类别：农业行业标准(NY)
标准状态：现行
发布日期：2009-04-23
实施日期：2009-05-20
出版语种：简体中文
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下载大小：444707
标准分类号
关联标准
出版信息
出版社：中国标准出版社
标准价格：0.0 元
出版日期：2009-05-20
相关单位信息
发布部门：中华人民共和国农业部
标准简介
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标准内容
Ics65.120
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 1756—2009
饲料中孔雀石绿的测定
Determination ofmalachitegreen infeeds2009-04-23发布
中华人民共和国农业部
2009-05-20实施
本标准附录A为资料性附录。
本标准由中华人民共和国农业部畜牧业司提f“。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。NY/T1756—2009
本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国家饲料质量监督检验中心(北京)]、浙江省饲料监察所。
本标准主要起草人：李兰、索德成、应永飞、闫惠文、杨曙明、朱聪英、杜洪鸽、谭旭信。1范围
饲料中孔雀石绿的测定
NY/T1756—2009
本标准规定了用液相色谱仪和液相色谱-串联质谱仪测定饲料中的孔雀石绿及其同系物无色孔雀石绿含量的方法。
本标准分为高效液相色谱法和高效液相色谱串联质谱法，高效液相色谱一串联质谱法为确证法本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料、鱼粉中孔雀石绿和无色孔雀石绿含量的测定。
液相色谱法孔雀石绿和无色孔雀石绿的定量限均为10ug/kg；液相色谱-串联质谱法的定量限均为1.0μg/kg。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样
GB/T20195动物饲料试样的制备
3采样
按GB/T14699.1执行。
4试样的制备
选取有代表性饲料样品，按GB/T20195制备样品，过0.28mm孔筛。5液相色谱法
5.1原理
以乙腈-乙酸钠缓冲溶液提取样品中的孔雀石绿和无色孔雀石绿，提取液经过二氯甲烷液液萃取再经固相萃取柱净化，用接有二氧化铅柱的氰基柱进行高效液相色谱分离，紫外可见光检测器检测，外标法定量。
5.2试剂
除非另有规定，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T6682规定的一级用水。5.2.1孔雀石绿草酸盐标准品：纯度≥95%。5.2.2无色孔雀石绿标准品：纯度≥95%。5.2.3乙睛：色谱纯。
5.2.4二氯甲烷。
5.2.5盐酸羟胺溶液：称取12.5g盐酸羟胺溶于50mL水中。5.2.6乙酸钠缓冲溶液：称取4.95g无水乙酸钠和0.95g对甲苯磺酸于900mL水中，用冰乙酸调节pH4.5，用水定容至1000mL。
NY/T1756—2009
5.2.71.0mol/L对甲苯磺酸溶液：称取17.2g对甲苯磺酸，加水溶解并定容至100mL。5.2.8酸性氧化铝，粒度为0.071nm～0.1501nm，层析用。5.2.9乙腈-乙酸钠缓冲溶液：乙腈+乙酸钠=60+40(v+v)。5.2.10氯化钠溶液：称取25g氯化钠，加水溶解并定容至500mL。5.2.11孔雀石绿标准贮备溶液：精确称取孔雀石绿草酸盐(5.2.1)0.1000g，用乙溶解，定容至100ml。该溶液中孔雀石绿的浓度为1mg/mL，于一18℃保存可使用3个月。5.2.12无色孔雀石绿标准贮备溶液：精确称取无色孔雀石绿(5.2.2)0.1000g，用乙睛溶解，定容至100mL，该溶液中无色孔雀石绿浓度为1mg/mL，于一18℃保存可使用3个月。5.2.13孔雀石绿和无色孔雀石绿混合中间液：精确移取孔雀石绿标准贮备溶液（5.2.11)和无色孔雀石绿标准贮备溶液(5.2.12)各0.5mL，置于50mL棕色容量瓶中，用乙睛定容至刻度。该溶液中孔雀石绿和无色孔雀石绿均为10μg/mL，于2℃～8℃保存可使用1个月。5.2.14孔雀石绿和无色孔雀石绿标准工作液：精确移取孔雀石绿和无色孔雀石绿混合中间液(52.13)1mL，置于100mL棕色容量瓶中，用乙腈乙酸钠缓冲溶液(5.2.9)定容至刻度。该溶液中孔雀石绿和无色孔雀石绿均为100ng/mL，手分析前配制使用5.2.15盐酸羟胺甲醇溶液：取1mL盐酸羟胺溶液(5.2.4)，加甲醇定容至100mL。5.3仪器
5.3.1高效液相色谱仪：配紫外可见光检测器。5.3.2电子天平：感量0.0001g、感量0.001g。5.3.3离心机，转速4000r/min。5.3.4振荡器。
5.3.5旋转蒸发器，可控温25℃~40℃。5.3.6固相萃取柱：丙基磺酸阳离子树脂PRS(propylsulfonicacid)柱：200mg/5mL～500mg/5mL中性氧化铝柱：500mg/6mL~1000mg/6mL。5.3.7色谱柱：氰基柱(粒度为5um)，柱长250mm、内径4.6mm。5.3.8二氧化铅柱：柱长35mm、内径4.6mm。5.4分析步骤
5.4.1提取
称取饲料样品约5g（精确到0.001g），置于100mL离心管中，依次加入1.5mL盐酸羟胺溶液(5.2.5)、2mL对甲苯磺酸溶液(5.2.7)、5mL乙酸钠缓冲溶液(5.2.6)和20mL乙，加入约2g酸性氧化铝(5.2.8)，振荡2min，超声30min，4000r/min离心5min。将上清液转移至250mL分液漏斗中，向离心管中再次加入20mL乙睛，振摇2min，4000r/min离心5min，合并上清液至分液漏斗中。5.4.2液液萃取
加入50mL氯化钠溶液(5.2.10)、50mL二氯甲烷(5.2.4),旋摇，静置分层。用蒸发瓶收集下层液体后，在分液漏斗再次加入20m二氯甲烷，旋摇，静置分层，收集下层液体于同一蒸发瓶。将收集液在35℃下减压旋转蒸发（注意：开始时温度不要直接升到35℃，以免爆沸）至近干，加入5mL乙睛溶解残渣，备用。
5.4.3净化
5。4.3.1固相萃取柱的活化
按中性氧化铝柱在上、PRS柱在下的顺序将两柱串联，使用前用5mL乙睛预洗两柱。5.4.3.2上样
将5.4.2的样液缓慢转移到中性氧化铝柱内，在抽真空情况下过柱(保持流速1mL/min)。再用52
mL乙睛洗涤蒸发瓶2次，洗涤液均转移至柱内，最后用5mL乙睛洗涤小柱。5.4.3.3洗脱收集
NY/T1756—2009
弃去中性氧化铝柱，用乙睛-乙酸钠缓冲溶液(5.2.9)2mL、盐酸羟胺甲醇溶液(5.2.15)lmL洗脱，收集洗脱液，过膜(孔径0.45μm)，上机测定。5.4.4样品测定
5.4.4.1色谱条件
色谱柱：氰基柱，250mm×4.6mm，柱后氧化铅柱：35mm×4.6mm流动相：乙腈+乙酸钠缓冲溶液=60+40(v+v)；流速：1.0mL/min。柱温：室温。
进样量：50uL。
检测波长：600nm。
5.4.4.2定量测定
按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数。向液相色谱仪中注入孔雀石绿和无色孔雀石绿标准工作液(5.2.13)及试样溶液(5.4.3.3)，得到色谱峰面积响应值，用外标法定量。5.4.4.3结果计算
试样中孔雀石绿和无色孔雀石绿的含量W，以质量分数表示，单位为微克每千克（μg/kg)，按式(1)分别计算：
P,xVxc,×Vs
Ps×m×V
式中：
P—试样溶液峰面积值，
V样品的总稀释体积，单位为毫升(mL)：C标准溶液浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)：Ps—标准溶液峰面积平均值；
试样质量，单位为克(g)。
平行测定结果用算术平均值表示，保留3位有效数字。5.5重复性
同一分析者对同一试样同时2次平行测定结果的相对偏差不大于15%。6液相色谱-串联质谱法
6.1原理
以乙睛提取样品中的孔雀石绿和无色孔雀石绿，提取液经过固相萃取柱净化后，进行液相色谱-串联质谱仪测定，以内标法定量。6.2试剂
除非另有规定，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T6682规定的一级用水。6.2.1乙睛：色谱纯。
6.2.2甲醇：色谱纯。
6.2.3氨水。
6.2.4冰乙酸。
6.2.5酸性氧化铝：粒度为：0.071nm~0.1501nm，层析用。6.2.6
甲酸：优级纯。
6.2.7孔雀石绿草酸盐标准品：纯度≥95%。3
6.2.8无色孔雀石绿标准品：纯度≥95%。6.2.9氛代孔雀石绿标准品：纯度≥95%。6.2.10氛代无色孔雀石绿标准品：纯度≥95%。6. 2.11
甲酸溶液：1.0%，取甲酸1.0mL加水定容至100mL。6.2.12中性氧化铝柱：1g/6mL。6.2.13
PRS阳离子交换柱：500mg/5mL。6.2.14流动相：取0.1%甲酸溶液220mL，加入乙睛780mL，摇匀。淋洗液：取甲酸溶液20mL，加乙腈定容至100mL。6.2.15
洗脱液：取氨水5mL加甲醇至100mL，摇匀。NY/T1756—2009
6.2.17标准储备溶液：准确称取孔雀石绿革酸盐、无色孔雀石绿、氛代孔雀石绿、氛代无色孔雀石绿标准品，用乙睛分别配制成100μg/mL的标准贮备液，一18℃避光保存备用，有效期为3个月。6.2.18混合标准储备溶液：分别吸取孔雀石绿和无色孔雀石绿的标准储备溶液(6.2.17)，用乙稀释成1μg／mL，一18℃避光保存，有效期为1个月。6.2.19混合内标储备溶液：分别吸取氛代孔雀石绿和氛代无公孔雀石绿标准储备溶液(6.2.17)，用乙睛稀释成1μg／mL，一18℃避光保存，有效期为1个月。6.2.20混合内标工作溶液：用乙睛稀释内标储备溶液(6.2.19)，配制成每毫升含氛代孔雀石绿和氛代无色孔雀石绿各100ng的混合内标工作溶液，一18℃避光保存，有效期为1个月。6.2.21混合标准工作溶液：根据需要，临用时用流动相稀释混合标准储备溶液(6.2.18)和混合内标储备溶液(6.2.19)，配制成适当浓度的混合标准工作溶液，每毫升混合标准工作溶液含有氛代孔雀石绿和氛代无色孔雀石绿各100ng。
6.3仪器
6.3.1高效液相色谱串联质谱仪：配电喷雾(ESI)离子源。6.3.2电子天平：感量0.0001g、感量0.001g。6.3.3离心机，转速8000r/min。6.3.4振荡器。
6.3.5旋转蒸发器，可控温35℃～60℃。6.3.6固相萃取装置。
6.4分析步骤
6.4.1试样提取下载标准就来标准下载网
称取饲料样品约5g（精确到0.001g），置于50mL离心管中，依次加入200μL混合内标工作液(6.2.17)、约5g中性氧化铝（6.2.5)、20mL乙睛，涡旋混匀，超声30min；于8000r/min离心10min倾出上清液至旋转蒸发瓶中，另取20mL乙腈重复提取一次，合并上清液；在35℃下减压蒸至近干，用5mL乙睛溶解残渣，备用。
6.4.2试样净化
将中性氧化铝柱(6.2.12)串接在阳离子交换柱(6.2.13)上方，用5mL乙睛活化。取溶液(6.4.1)过柱，另取5mL乙晴清洗旋转蒸发瓶，溶液过柱，重复以上操作一次，取5mL乙睛淋洗柱子。移去中性氧化铝柱，用5mL淋洗液（6.2.15)淋洗阳离子交换柱，弃去流出液，抽干：用5mL洗脱液(6.2.16)洗脱。收集洗脱液，用氮气在50℃吹至近干，用流动相(6．2．14)溶解残渣，并定容到适当的体积，经0.22μm滤膜过滤后上机测定。
6.4.3色谱条件
色谱柱：Cl柱(150mm×2.1mm，3.5μm)；流动相：0.1%甲酸溶液+乙睛=22+78(v+v):
流速：0.25mL/min；
柱温：50℃；
进样量：20μL。
6.4.4质谱条件
离子源：电喷雾ESI离子源：
扫描方式：正离子扫描：
检测方式：多反应监测：
NY/T1756—2009
雾化气、锥孔气均为高纯氮气：碰撞气为高纯氢气：使用前，应调节各气体流量，以使质谱灵敏度达到检测要求：
喷雾电压、碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度：监测离子对情况见表1。
孔雀石绿和无色孔雀石绿的离子对表1
孔雀石绿
无色孔雀石绿
氛代孔雀石绿
氛代无色孔雀石绿
定性测定
定量离子对，m/z
329/313
331/239
334/318
337/240
定性离子对，m/2
329/208
331/316
每种被测组分选择1个母离子、2个以上子离子。在相同试验条件下，样品中待测物质的保留时间与混合对照品工作液中对应的保留时问偏差在士2.5%之内，且样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的对照品工作液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表2规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表2
相对离子丰度
允许的最大偏差，%
6.4.6定量测定
定性确证时相对离子丰度的最大允许误差>20~50
>10~20
在仪器正常工作条件下，对混合对照品工作液进样，以标准溶液中被测组分峰面积的为纵坐标，被测组分浓度为横坐标，用内标法对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。以氛代孔雀石绿为内标物计算孔雀石绿含量，以氛代无色孔雀石绿为内标物计算无色孔雀石绿含量。上述色谱和质谱条件下，孔雀石绿、无色孔雀石绿以及内标物氛代孔雀石绿和氛代无色孔雀石绿标准物质的多反应监测色谱图参见附录A。6.5试样中孔雀石绿和无色孔雀石绿的含量Wi，以质量分数表示，单位为微克每千克（ug/kg)，按式(2)分别计算：
式中：
CXC,XAXA.XV
C,XAXAXW
-孔雀石绿或无色孔雀石绿标准工作溶液的浓度，单位为微克每升（ug/L)；标准工作溶液中内标物的浓度，单位为微克每升（ug/L)：Csi
样液中内标物的浓度，单位为微克每升(ug/L)：C
样液中孔雀石绿或无色孔雀石绿的峰面积；孔雀石绿或无色孔雀石绿标准工作溶液的峰面积-标准工作溶液中内标物的峰面积；样液中内标物的峰面积；
样品定容体积，单位为毫升(mL)；W样品称样量，单位为克(g)。
平行测定结果用算术平均值表示，结果保留3位有效数字。3重复性
同一分析者对同一试样同时2次平行测定结果的相对偏差不大于20%。6
NY/T1756—2009
附录A
(资料性附录）
NY/T17562009
液相色谱法孔雀石绿和无色孔雀石绿标准溶液色谱图、孔雀石绿、无色孔雀石绿、氛代孔雀石绿和氛代无色孔雀石绿标准物质的提取离子流图A.1
液相色谱法孔雀石绿和无色孔雀石绿标准溶液色谱图DAD1A.Sig=618,1Ref=of(200711161KL000014.D)mAU
注为无色孔张石绿;2为孔雀石绿。7.5
见图A.1.
图A，1液相色谱法孔雀石绿和无色孔雀石绿标准溶液色谱图17.5
NY/T17562009
A.2孔雀石绿、无色孔雀石绿、氛代孔雀石绿和氛代无色孔雀石绿标准物质的提取离子流图见图A2。071211-10
071211-10
071211-10
071211-10
071211-10
071211-10
（浓度为5.Cng/nl）
MRM af 6 Channels ES-
337>240
MRM uf G Charmels ES+
334.1>318
MRM of6 Channels FS+
331316
MRM u 6 Charmel- ES+
331>239
MRM of 6 Channels ES+
329313
MRM af 6 Channels ES+
329>208
图A.2孔雀石绿、无色孔雀石绿、氛代孔雀石绿和氙代无色孔雀石绿标准物质的提取离子流图8
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中华人民共和国农业行业标准
NY/T 1756—2009
饲料中孔雀石绿的测定
Determination ofmalachitegreen infeeds2009-04-23发布
中华人民共和国农业部
2009-05-20实施
本标准附录A为资料性附录。
本标准由中华人民共和国农业部畜牧业司提f“。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。NY/T1756—2009
本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国家饲料质量监督检验中心(北京)]、浙江省饲料监察所。
本标准主要起草人：李兰、索德成、应永飞、闫惠文、杨曙明、朱聪英、杜洪鸽、谭旭信。1范围
饲料中孔雀石绿的测定
NY/T1756—2009
本标准规定了用液相色谱仪和液相色谱-串联质谱仪测定饲料中的孔雀石绿及其同系物无色孔雀石绿含量的方法。
本标准分为高效液相色谱法和高效液相色谱串联质谱法，高效液相色谱一串联质谱法为确证法本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料、鱼粉中孔雀石绿和无色孔雀石绿含量的测定。
液相色谱法孔雀石绿和无色孔雀石绿的定量限均为10ug/kg；液相色谱-串联质谱法的定量限均为1.0μg/kg。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样
GB/T20195动物饲料试样的制备
3采样
按GB/T14699.1执行。
4试样的制备
选取有代表性饲料样品，按GB/T20195制备样品，过0.28mm孔筛。5液相色谱法
5.1原理
以乙腈-乙酸钠缓冲溶液提取样品中的孔雀石绿和无色孔雀石绿，提取液经过二氯甲烷液液萃取再经固相萃取柱净化，用接有二氧化铅柱的氰基柱进行高效液相色谱分离，紫外可见光检测器检测，外标法定量。
5.2试剂
除非另有规定，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T6682规定的一级用水。5.2.1孔雀石绿草酸盐标准品：纯度≥95%。5.2.2无色孔雀石绿标准品：纯度≥95%。5.2.3乙睛：色谱纯。
5.2.4二氯甲烷。
5.2.5盐酸羟胺溶液：称取12.5g盐酸羟胺溶于50mL水中。5.2.6乙酸钠缓冲溶液：称取4.95g无水乙酸钠和0.95g对甲苯磺酸于900mL水中，用冰乙酸调节pH4.5，用水定容至1000mL。
NY/T1756—2009
5.2.71.0mol/L对甲苯磺酸溶液：称取17.2g对甲苯磺酸，加水溶解并定容至100mL。5.2.8酸性氧化铝，粒度为0.071nm～0.1501nm，层析用。5.2.9乙腈-乙酸钠缓冲溶液：乙腈+乙酸钠=60+40(v+v)。5.2.10氯化钠溶液：称取25g氯化钠，加水溶解并定容至500mL。5.2.11孔雀石绿标准贮备溶液：精确称取孔雀石绿草酸盐(5.2.1)0.1000g，用乙溶解，定容至100ml。该溶液中孔雀石绿的浓度为1mg/mL，于一18℃保存可使用3个月。5.2.12无色孔雀石绿标准贮备溶液：精确称取无色孔雀石绿(5.2.2)0.1000g，用乙睛溶解，定容至100mL，该溶液中无色孔雀石绿浓度为1mg/mL，于一18℃保存可使用3个月。5.2.13孔雀石绿和无色孔雀石绿混合中间液：精确移取孔雀石绿标准贮备溶液（5.2.11)和无色孔雀石绿标准贮备溶液(5.2.12)各0.5mL，置于50mL棕色容量瓶中，用乙睛定容至刻度。该溶液中孔雀石绿和无色孔雀石绿均为10μg/mL，于2℃～8℃保存可使用1个月。5.2.14孔雀石绿和无色孔雀石绿标准工作液：精确移取孔雀石绿和无色孔雀石绿混合中间液(52.13)1mL，置于100mL棕色容量瓶中，用乙腈乙酸钠缓冲溶液(5.2.9)定容至刻度。该溶液中孔雀石绿和无色孔雀石绿均为100ng/mL，手分析前配制使用5.2.15盐酸羟胺甲醇溶液：取1mL盐酸羟胺溶液(5.2.4)，加甲醇定容至100mL。5.3仪器
5.3.1高效液相色谱仪：配紫外可见光检测器。5.3.2电子天平：感量0.0001g、感量0.001g。5.3.3离心机，转速4000r/min。5.3.4振荡器。
5.3.5旋转蒸发器，可控温25℃~40℃。5.3.6固相萃取柱：丙基磺酸阳离子树脂PRS(propylsulfonicacid)柱：200mg/5mL～500mg/5mL中性氧化铝柱：500mg/6mL~1000mg/6mL。5.3.7色谱柱：氰基柱(粒度为5um)，柱长250mm、内径4.6mm。5.3.8二氧化铅柱：柱长35mm、内径4.6mm。5.4分析步骤
5.4.1提取
称取饲料样品约5g（精确到0.001g），置于100mL离心管中，依次加入1.5mL盐酸羟胺溶液(5.2.5)、2mL对甲苯磺酸溶液(5.2.7)、5mL乙酸钠缓冲溶液(5.2.6)和20mL乙，加入约2g酸性氧化铝(5.2.8)，振荡2min，超声30min，4000r/min离心5min。将上清液转移至250mL分液漏斗中，向离心管中再次加入20mL乙睛，振摇2min，4000r/min离心5min，合并上清液至分液漏斗中。5.4.2液液萃取
加入50mL氯化钠溶液(5.2.10)、50mL二氯甲烷(5.2.4),旋摇，静置分层。用蒸发瓶收集下层液体后，在分液漏斗再次加入20m二氯甲烷，旋摇，静置分层，收集下层液体于同一蒸发瓶。将收集液在35℃下减压旋转蒸发（注意：开始时温度不要直接升到35℃，以免爆沸）至近干，加入5mL乙睛溶解残渣，备用。
5.4.3净化
5。4.3.1固相萃取柱的活化
按中性氧化铝柱在上、PRS柱在下的顺序将两柱串联，使用前用5mL乙睛预洗两柱。5.4.3.2上样
将5.4.2的样液缓慢转移到中性氧化铝柱内，在抽真空情况下过柱(保持流速1mL/min)。再用52
mL乙睛洗涤蒸发瓶2次，洗涤液均转移至柱内，最后用5mL乙睛洗涤小柱。5.4.3.3洗脱收集
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弃去中性氧化铝柱，用乙睛-乙酸钠缓冲溶液(5.2.9)2mL、盐酸羟胺甲醇溶液(5.2.15)lmL洗脱，收集洗脱液，过膜(孔径0.45μm)，上机测定。5.4.4样品测定
5.4.4.1色谱条件
色谱柱：氰基柱，250mm×4.6mm，柱后氧化铅柱：35mm×4.6mm流动相：乙腈+乙酸钠缓冲溶液=60+40(v+v)；流速：1.0mL/min。柱温：室温。
进样量：50uL。
检测波长：600nm。
5.4.4.2定量测定
按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数。向液相色谱仪中注入孔雀石绿和无色孔雀石绿标准工作液(5.2.13)及试样溶液(5.4.3.3)，得到色谱峰面积响应值，用外标法定量。5.4.4.3结果计算
试样中孔雀石绿和无色孔雀石绿的含量W，以质量分数表示，单位为微克每千克（μg/kg)，按式(1)分别计算：
P,xVxc,×Vs
Ps×m×V
式中：
P—试样溶液峰面积值，
V样品的总稀释体积，单位为毫升(mL)：C标准溶液浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)：Ps—标准溶液峰面积平均值；
试样质量，单位为克(g)。
平行测定结果用算术平均值表示，保留3位有效数字。5.5重复性
同一分析者对同一试样同时2次平行测定结果的相对偏差不大于15%。6液相色谱-串联质谱法
6.1原理
以乙睛提取样品中的孔雀石绿和无色孔雀石绿，提取液经过固相萃取柱净化后，进行液相色谱-串联质谱仪测定，以内标法定量。6.2试剂
除非另有规定，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T6682规定的一级用水。6.2.1乙睛：色谱纯。
6.2.2甲醇：色谱纯。
6.2.3氨水。
6.2.4冰乙酸。
6.2.5酸性氧化铝：粒度为：0.071nm~0.1501nm，层析用。6.2.6
甲酸：优级纯。
6.2.7孔雀石绿草酸盐标准品：纯度≥95%。3
6.2.8无色孔雀石绿标准品：纯度≥95%。6.2.9氛代孔雀石绿标准品：纯度≥95%。6.2.10氛代无色孔雀石绿标准品：纯度≥95%。6. 2.11
甲酸溶液：1.0%，取甲酸1.0mL加水定容至100mL。6.2.12中性氧化铝柱：1g/6mL。6.2.13
PRS阳离子交换柱：500mg/5mL。6.2.14流动相：取0.1%甲酸溶液220mL，加入乙睛780mL，摇匀。淋洗液：取甲酸溶液20mL，加乙腈定容至100mL。6.2.15
洗脱液：取氨水5mL加甲醇至100mL，摇匀。NY/T1756—2009
6.2.17标准储备溶液：准确称取孔雀石绿革酸盐、无色孔雀石绿、氛代孔雀石绿、氛代无色孔雀石绿标准品，用乙睛分别配制成100μg/mL的标准贮备液，一18℃避光保存备用，有效期为3个月。6.2.18混合标准储备溶液：分别吸取孔雀石绿和无色孔雀石绿的标准储备溶液(6.2.17)，用乙稀释成1μg／mL，一18℃避光保存，有效期为1个月。6.2.19混合内标储备溶液：分别吸取氛代孔雀石绿和氛代无公孔雀石绿标准储备溶液(6.2.17)，用乙睛稀释成1μg／mL，一18℃避光保存，有效期为1个月。6.2.20混合内标工作溶液：用乙睛稀释内标储备溶液(6.2.19)，配制成每毫升含氛代孔雀石绿和氛代无色孔雀石绿各100ng的混合内标工作溶液，一18℃避光保存，有效期为1个月。6.2.21混合标准工作溶液：根据需要，临用时用流动相稀释混合标准储备溶液(6.2.18)和混合内标储备溶液(6.2.19)，配制成适当浓度的混合标准工作溶液，每毫升混合标准工作溶液含有氛代孔雀石绿和氛代无色孔雀石绿各100ng。
6.3仪器
6.3.1高效液相色谱串联质谱仪：配电喷雾(ESI)离子源。6.3.2电子天平：感量0.0001g、感量0.001g。6.3.3离心机，转速8000r/min。6.3.4振荡器。
6.3.5旋转蒸发器，可控温35℃～60℃。6.3.6固相萃取装置。
6.4分析步骤
6.4.1试样提取下载标准就来标准下载网
称取饲料样品约5g（精确到0.001g），置于50mL离心管中，依次加入200μL混合内标工作液(6.2.17)、约5g中性氧化铝（6.2.5)、20mL乙睛，涡旋混匀，超声30min；于8000r/min离心10min倾出上清液至旋转蒸发瓶中，另取20mL乙腈重复提取一次，合并上清液；在35℃下减压蒸至近干，用5mL乙睛溶解残渣，备用。
6.4.2试样净化
将中性氧化铝柱(6.2.12)串接在阳离子交换柱(6.2.13)上方，用5mL乙睛活化。取溶液(6.4.1)过柱，另取5mL乙晴清洗旋转蒸发瓶，溶液过柱，重复以上操作一次，取5mL乙睛淋洗柱子。移去中性氧化铝柱，用5mL淋洗液（6.2.15)淋洗阳离子交换柱，弃去流出液，抽干：用5mL洗脱液(6.2.16)洗脱。收集洗脱液，用氮气在50℃吹至近干，用流动相(6．2．14)溶解残渣，并定容到适当的体积，经0.22μm滤膜过滤后上机测定。
6.4.3色谱条件
色谱柱：Cl柱(150mm×2.1mm，3.5μm)；流动相：0.1%甲酸溶液+乙睛=22+78(v+v):
流速：0.25mL/min；
柱温：50℃；
进样量：20μL。
6.4.4质谱条件
离子源：电喷雾ESI离子源：
扫描方式：正离子扫描：
检测方式：多反应监测：
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雾化气、锥孔气均为高纯氮气：碰撞气为高纯氢气：使用前，应调节各气体流量，以使质谱灵敏度达到检测要求：
喷雾电压、碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度：监测离子对情况见表1。
孔雀石绿和无色孔雀石绿的离子对表1
孔雀石绿
无色孔雀石绿
氛代孔雀石绿
氛代无色孔雀石绿
定性测定
定量离子对，m/z
329/313
331/239
334/318
337/240
定性离子对，m/2
329/208
331/316
每种被测组分选择1个母离子、2个以上子离子。在相同试验条件下，样品中待测物质的保留时间与混合对照品工作液中对应的保留时问偏差在士2.5%之内，且样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的对照品工作液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表2规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表2
相对离子丰度
允许的最大偏差，%
6.4.6定量测定
定性确证时相对离子丰度的最大允许误差>20~50
>10~20
在仪器正常工作条件下，对混合对照品工作液进样，以标准溶液中被测组分峰面积的为纵坐标，被测组分浓度为横坐标，用内标法对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。以氛代孔雀石绿为内标物计算孔雀石绿含量，以氛代无色孔雀石绿为内标物计算无色孔雀石绿含量。上述色谱和质谱条件下，孔雀石绿、无色孔雀石绿以及内标物氛代孔雀石绿和氛代无色孔雀石绿标准物质的多反应监测色谱图参见附录A。6.5试样中孔雀石绿和无色孔雀石绿的含量Wi，以质量分数表示，单位为微克每千克（ug/kg)，按式(2)分别计算：
式中：
CXC,XAXA.XV
C,XAXAXW
-孔雀石绿或无色孔雀石绿标准工作溶液的浓度，单位为微克每升（ug/L)；标准工作溶液中内标物的浓度，单位为微克每升（ug/L)：Csi
样液中内标物的浓度，单位为微克每升(ug/L)：C
样液中孔雀石绿或无色孔雀石绿的峰面积；孔雀石绿或无色孔雀石绿标准工作溶液的峰面积-标准工作溶液中内标物的峰面积；样液中内标物的峰面积；
样品定容体积，单位为毫升(mL)；W样品称样量，单位为克(g)。
平行测定结果用算术平均值表示，结果保留3位有效数字。3重复性
同一分析者对同一试样同时2次平行测定结果的相对偏差不大于20%。6
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附录A
(资料性附录）
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液相色谱法孔雀石绿和无色孔雀石绿标准溶液色谱图、孔雀石绿、无色孔雀石绿、氛代孔雀石绿和氛代无色孔雀石绿标准物质的提取离子流图A.1
液相色谱法孔雀石绿和无色孔雀石绿标准溶液色谱图DAD1A.Sig=618,1Ref=of(200711161KL000014.D)mAU
注为无色孔张石绿;2为孔雀石绿。7.5
见图A.1.
图A，1液相色谱法孔雀石绿和无色孔雀石绿标准溶液色谱图17.5
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A.2孔雀石绿、无色孔雀石绿、氛代孔雀石绿和氛代无色孔雀石绿标准物质的提取离子流图见图A2。071211-10
071211-10
071211-10
071211-10
071211-10
071211-10
（浓度为5.Cng/nl）
MRM af 6 Channels ES-
337>240
MRM uf G Charmels ES+
334.1>318
MRM of6 Channels FS+
331316
MRM u 6 Charmel- ES+
331>239
MRM of 6 Channels ES+
329313
MRM af 6 Channels ES+
329>208
图A.2孔雀石绿、无色孔雀石绿、氛代孔雀石绿和氙代无色孔雀石绿标准物质的提取离子流图8
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