YY/T 0127.10-2009 口腔医疗器械生物学评价 第2单元：试验方法 鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验（Ames试验） YY/T0127.10-2009 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS 11, 060. 10
中华人民共和国医疗行业标准
YY/T 0127.10—2009
代替YY/T0127.102001
口腔医疗器械生物学评价
第2单元：试验方法
鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验（Ames 试验）
Biological evaluation of medical devices used in dentistry-Part 2 : Tes1 method-Salmonella typhimurium reverse mutation assay(Ames mutagenicity test)
2009-06-16发布
国家食品药品监督管理局
2010-12-01实施
YY/T 0127.10-2009
口腔医疗器械生物学评价系列标准中的第1单元，YY/T0268-2008&牙科学口腔医疗器械生物学评价第1单元，评价与试验是口腔医疗器械生物学评价与试验项目的选择，为指南性标准。YY/T0127&口腔材料生物学评价第2单元验方法分为以下几部分：—YY/T0127.1—1993口腔材料生物试验方法溶血试验；YY/T0127.2一×××X口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法急性全身毒性试验：静脉途径；
YY/T 0127.3--1998
：口腔材料生物学评价第2单元：口腔材料生物试验方法：根管内应
用试验；
-YY/T 0127. 4- --1998
试验；
-YY/T 0127.5—1999
试验；
-YY/T0127.6--1998
试验；
--YY/T 0127.72001
质应用试验；
口腔材料生物学评价第2单元：口腔材料生物试验方法骨埋植第2单元：口腔材料生物试验方法暇人毒性
口腔材料生物学评价
口腔材料生物学评价
显性致死
第2单元：口腔材料生物试验方法口腔材料生物学评价
第2单元：门腔材料生物试验方法牙髓牙本YY/T 0127.8-2001
第2单元：口腔材料生物试验方法皮下植人口腔材料生物学评价
试验，
YY/T 0127. 9---2001
第2单元：口腔材料生物试验方法细胞毒性口腔材料生物学评价
试验（琼脂覆盖法及分子滤过法）；YY/T0127.10—2009口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法鼠伤寒沙门氏杆薛回复突变试验(Ames试验)，
-YY/T0127.11—2001牙科学用于口腔的医疗器械生物相容性临床前评价第2单元：口腔材料生物试验方法盖髓试验；YY/T 0127. 12—2008 牙科学口腔医疗器械生物学评价第 2 单元:试验方法 微核试验：
—YY/T 0127.13
试验，
-YY/T 0127.14
试验，
口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法口腔黏膜刺激口腔医疗器械生物学评价：第2单元：试验方法急性经口金身毒性2009
-YY/T0244-1996口腔材料生物试验方法短期全身性试验：经口途径。本部分为YY/T0127的第10部分。本部分代替YY/T0127.10-2001口腔材料生物学评价第2单元：口腔材料生物试验方法鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验（Ames试验）\。本部分与YY/T 0127.102001相比，主要变化如下：标准名称改为：口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法鼠伤寒钞门氏杆菌回复突变试验(Ames 试验)\
一规范性引用文件做了相应修改；1
YY/T 0127.10—2009
浸提液剂量由 200 mg/ml. 改为最高剂量;一受试样品由五个剂量改为至少三个剂量。分为最高剂盘组、1/2最高剂量组和1/4最高剂量组：
·一增加对固化类材料样品制备要求：“对于固化类材料，考虑固化状态材料的诱变性时，建议采用固化24h士2h的试样进行试验。即试样固化后放于室温下，密封保存24h土2h。也可根据其使用特点选择何时进行试验，但在报告中应予以注明：由于多氯联苯在国内、国外已经不再使用，因此将“多裁联苯”改为“苯巴比妥与3-甲基葱或与 β-苯丙黄酮”作为诱导剂。本部分的附录A为规范性附录。
本部分由国家食品药品监督管理局提出。本部分由全国口腔材料和器械设备标准化技术委员会归口。本部分冉国家食品药品监警笃理局北大医疗器械质量监督检验中心负责起草。本部分土要起草人，林红、李盛林、付嘉、王衣祥，郝。本部分于2001年首次发布。于2009年第一次修订。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：·YY 0127.10—2001.
1范围
口腔医疗器械生物学评价
第2单元：试验方法
鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验(Ames 试验）
YY/T 0127.10—2009
YY/T0127的本部分规定了口腔医疗器械鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验方法。本试验用于测定可引起沙门氏杆菌兼因置换和/或移码突变的口腔材料所诱发的依赖于组氨酸(his一)的菌株产生不依赖于组氨酸(his十）的基因突变。为检测口腔医疗器械的诱变性试验之。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过YY/T0127的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的客方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注期的引用文件，其最新版本适用于本部分。
GB79191987化妆品安全性评价程序和方法GB15193.4—2003鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验GB/T16886.12医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品（GB/T16886.12—2005,IS0 10993.12.2002,1DT)
3仪器
3.1实验室常用设备。
3.2洁净工作台，恒温培养箱，恒温水浴，低温高速离心机，低温冰箱（一80)或液氮罐等。4培养基和试剂的制备
培养基和试剂的制备见附录 A。5菡株准备、鉴定和藏
5.1菡株
采用组氮酸营养缺陷型鼠伤寒门氏菌共四株-—--TA97、TA98,TA100,TA102。5.2菌株贮存
菌株贮存在加有二甲基亚砜的(光谱纯)新鲜细菌培养液中,其体积比为 0.091,混合后分装了小试管或菌种管内，经T冰丙酮液（—75℃）或液氮（—196)速冻，在一80℃冰箱或—196℃液氮中长期贮存。
5.3增菌培养
从冷冻贮存菌株管中刮取细菌置5mL营养肉汤培养基中，经37℃振荡(100次/min)培养10h~12h，活菌数应达10°/mL(OD6000.4）。细菌培养液从37℃取出后，应立即放入4℃中备用。试验需用当天孵育好的新鲜纳菌。
YY/T0127.10—2009
5.4茵株鉴定
5.4.1组氨酸需求(his-）试验
凡组氨酸营养缺陷型试验菌株只能在补充组氨酸的培养基上生长，而在缺乏组氨酸的培养基上不能生长。
鉴定方法：在底层培养基平血表面加入0.5mmol/LL-组氨酸0.1ml和0.5mmol/LD生物素0.1mL。用L棒铺开。对照平Ⅲ只加生物素不加组氨酸。用白金耳浸细菌培养液，在对照平血和含有组氨酸/生物素的平皿表面分别平行划线。四株细菌可划在同一个平皿上，经37℃孵育24h后，观察细菌生长情况。试验菌株在含组氮酸平血上生长，在对照平Ⅲ上不应生长。5.4.2脂多糖屏障缺陷鉴定（rla突变）粗糙型突变的微生物，其细胞表面一层脂多糖屏障已经破坏，因此一些大分子物质能穿过菌膜进人菌体内而抑制其生长。野生型菌株或含缺失的菌株则不受影响。鉴定方法：分别将每种细菌培养液0.1mL加到45℃2mL顶层培养基试管内，混匀后倾倒于营养琼脂培养基平Ⅲ表面，使其均小布。待固化后，取直径为6mm无茵滤纸圆片浸1mg/mL结晶紫溶（℃孵育84h后，围绕圆纸片出现透明的抑菌环（直径大约14mm），说明液10，放到平Ⅲ中央。
TA97、TA98.TA100、TA102均有抑菌环。野生型鼠伤寒杆菌无抑菌环。此菌存在深粗型（rfa）美变。
5.4.3对紧外线敏感性鉴定（uvrB修复缺陷型的监定具有uvrB修复赢陷型的试验菌株，在紫外线照射后仍能照常生长，借此证明uvrB突变的存在。鉴定方法：用自金耳浸细菌培养液，在营养琼脂培养基平血表面平行划线，四株细菌可划在同平Ⅱ上。用黑纸覆盖m一半，在距离33cm处用15W紫外线系菌灯照射平Ⅲ8s经37℃孵育24h后观察结果。对紫外线被感的菌株（TA97TA98TA100）只在未照射过的一半平血生长。而具有坐平血）后仍能生长。
株（TA102)在紫外线照射（未盖黑纸的另uvrB修复缺陷型的
5.4.4抗氨青等素（PKM101）试验（菌株R因子丢失鉴定）含R因子的试验菌株对氨芋青得素具有抗性。良因子不稳定容易丢失，从而使试验菌株丧失R因子的特性，故需鉴定R因子是否存在鉴定方法1：用全于浸细菌培养液，在含氨芋青霉素平皿表面平行划线，四株细菌可划在同一平血上。还应选用
菌株不应生长。
个无抗性因子的菌株，以测定氢苦霉素的效应。经37℃孵育24h后，无抗性因了鉴定方法2：用白金日浸细菌培养波：在营养球脂培养基平血表首平行划线，四株细菌可划在同一平Ⅲ上。将沾有氨芋青得素容液的滤纸条与划线交叉放置，37℃孵育241。如滤纸条周围细菌生长正常，说明试验菊株具有R因子
5.4.5四环素（PAQI抗性的鉴定
鉴定方法1：用白金耳浸细菌培养液，在含氧卡青霉素/环素平皿表面平行划线，四株细菌可划在同一平m上。经37℃育24h后，对四环素有抗性的TA102菌能生长，对四环素无抗性的菌株不生长。
鉴定方法2：用白金耳浸细菌培养液，在营养琼脂培养基平血表面平行划线，四株细菌可划在同一平Ⅱ上。待T后，吸取四环素（8mg/mL）溶液与菌株划线处交叉划线，37℃孵育24h。对四环素有抗性的TA102菌株能生长，其他菌株不生长。5.4.6自发回变数（his+）的测定在小试管中加入融化的顶层培养基2mL，分别加入待测菌株的菌液0.1mL，迅速在高速液体混合器上混匀，倾倒在已固化的底层培养基平Ⅲ上，使其均匀分布。待固化后，经37℃孵育48h，计数全部菌落数。一个菌株应做2～3个平皿，以便计算平均菌落数。必要时可重复试验，以保证回变菌落数值在一个恒定的范围。各试验菌株的自发回变数分别为：TA97（97-180）；TA98（15~60）：TA100（75~200）；TA102(240~360）。加过S-9的菌株，自发回变数稍有增加。2
5.4.7对阳性突变剂的敏感性鉴定使用已知阳性对照剂，检查试验菌株的敏感性是否降低，其方法同7。6代谢活化剂[大鼠肝微粒体酶(S-9)]的诱导和制备6.1大鼠肝微粒体酶（S-9）的诱导YY/T0127.10—2009
选用体重150g~200g的健康雄性S-D大白鼠或体重110g~150g的Wistar大鼠。将苯巴比妥与3-甲基胆葱或与β萘黄酮溶于玉米油中。可用下述三种方法之一进行诱导：苯巴比妥作诱导剂时，大鼠的剂量为80m/kg；小鼠的剂量为160mg/kg。ip，QD，连续5d。a)
末次注射后24h处死。处死前不必禁食。b）3-甲基胆蕙：大鼠为20mg/kg；小鼠为40mg/kg，ip，QD，连续3d最后一次注射后24h处死。处死前不必禁食
联合诱导：经口或腹腔注射80mg/kg苯巴比妥钠和80mg/kgβ券黄酮，连续3d。处死前16h停止饮食，但可自由饮水。
6.2切取肝脏
处死的大鼠经过无菌处理，打开腔腔，用20mmL0.15mol/L氯化钾溶液（4℃）进行肝门静脉灌注后，小心分离并将肝脏完整取出，整个过程应在无菌室中进行。离体以后的肝脏始终保持4℃以下无菌操作。
6.3S-9的制备
制备S-9的
肝脏称重后
器血均应消毒，全部操作在冰水浴中进行0.15mol/L氯化钾溶液中洗涤数遍，每克重肝脏加0.15mol/L氯化钾溶液3mL。用剪刀剪碎肝胎L版人组织匀浆机中，以4c001/min勾浆naing将匀浆液放人低温0℃4℃高速离心机上，以9000g
心10min，其上层液即S-9。
6.4S9吃存
吸取2mL上层液分装于小试管或安中。在密封的条件下，用干冰丙酮液速冻后，贮存于一80℃冰箱或液氮容器中①保存期不超过1a。6.5S-9鉴定
S-9制备后，应进行下列测定
a）无菌检查
蛋白含量测是wry法）；每毫升蛋白含量应不超过40mg；b）
细胞色素P-450测
S-9活力以标准致瘤物违行测定。6.6S-9的剂量选择
首先使用标准浓度的S-9混合液，测定其对已知阳性致癌物的生物活性，确定最适用量。如果是阴性结果，还应使用高浓度的S-9混合液重新试验。6.7S-9混合液制备：见附录A中的第A.8章。7受试样品的制备和剂量选择
7.1试样制备可选用生理盐水、二甲基亚砜（DMSO)或其他溶剂（毒性剂量以下），无论选用何种溶剂，均应无诱变性。将材料制备成溶液、混悬液或浸提液。浸提液制备按GB/T16886.12规定的方法进行。对于固化类材料，考材料在固化状态的诱变性时，建议采用固化后24h士2h的试样进行试验。即试样制备后放于室温下，密封保存24h士2h。也可根据其使用特点选择何时进行试验，但在报告中应以注明。7.2受试样品剂量选择预试验用菌株TA100进行预试验（操作程序应与正式试验一致），以了解受试样品对细菌的毒性。
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决定受试样品的最高剂量的标准是细胞毒性和溶解度。细胞毒性表现是：平血中回复突变菌落数减少，背景菌苔变清晰，40倍显微镜下背景菌苔稀蔬，体积增大等。毒性大的受试样品，选择有轻微毒性的剂量作为试验的最高剂量。毒性小,溶解度高的受试样品，最高剂量溶获 50 mg/mL,混悬液100mg/ml。对了无法制备成溶液或混悬液的材料，制备成凌提液。最高剂量浸提液浓度不低于400mg/mL.
7.3受试样品正式试验剂量分组每种受试样品至少设三个剂量组。分为最高剂量组、1/2最高剂量组和1/4最高剂量组。
8诱变试验方法
一次试验最少设三个受试样品剂量组（见7.3）及阴性（溶媒）对照组和阳性对照组，代谢活化和非代谢活化两种测试过程应同时进行。试验结果在有背景菌苔存在情况下，计算每个平血的回变菌落数，并需重复试验1～2次。
8.1预培养法
分别取 0.1mL受试样品液,0.5mL S-9混合液(需代谢活化时加：不需代谢活化时加 0.5mL不含S-9的磷酸缓冲液）,0. 1mL细菌培养液。将三者移入无菌小试管内混合，在37℃振荡培养20 min，再加入2mL顶层培养基，混勾后倾倒在底层培养基平瓜上，使之均勾分布。待固化后，将平血翻转，经37℃孵育48h观察结果。
8.2平板搭入法
将含0.5mmol/L组氨酸尘物索的顶层培养基2mL分装于小试管中，45℃恒温水浴中保温，每管再依次加人0.1mL受试样品液、0.1mL细菌培养液和0.5mLS-9混合液（需代谢活化时加。不需代谢活化时加0.5mL不含S-9的磷酸缓冲减），混勾后倾倒在底层培养基半血上并使之均匀分布。待固化后，将半匠翻转，经37脖育48h观结果。9结果评定
记录试验组和对照组的每一平皿的回变菌落数，每个试验组的回变菌落数以平均值和标准差（土SD)表示。
受试样品的回变菌落数高于阴性对照回变菌落数的二倍以上，并有剂量-效应关系或某一个或某凡个剂量点的可重复性，并有统计学意义的阳性友应，则判为诱变阳性。4
A，1顶层培剂
氯化钠
蒸馏水
200 mL
附录A
（规范性附录）
培养基和试剂的制备
YY/T 0127.10—2009
加热溶化后,加人 0. 5 m mol/L组氨酸-生物素溶液 20 mL。121 ℃ 104 kPa 20 min高压灭菌。A.2底层培养基
蒸馏水
121 104 kPa 20 rnin高压消毒后,趋热(80 ℃)在其内依次加入 50X(V-B)培养基 E 10 mL 和40%葡糖溶液25mL，混勾，按每血30mL倒平皿冷凝固化后倒置于37℃培养箱中21h~18h，A.3Vogel-Bnniner(V-B)培养基 E(50x)硫酸镁(MgS0·7H,0)
枸橡酸(C.H.O,HzO)
磷酸氢二钾(K,HPO,)
磷酸氢铵钠(NaNH,HPO,·4H2O)
加蒸馏水至100ml
先将后-种溶解后,再加入硫酸镁，待完全溶解斥，分装于锥形瓶里，121℃104kPa20min高压消毒。
A.440%葡萄糖溶液
称取 40 g 葡萄糖,加人蒸水至 100 mL,115 ℃ 69 kPa 20 min高压消毒。4 ℃保存。A.5营养肉汤培养基
牛肉膏
胶陈(或混合蛋白陈）
氯化钠
磷酸氨二钾
蒸馏水
加热溶解，调pH至7.4,121℃104kPa20min高压消毒。4℃保存。A.6营养肉汤琼脂培养基
琼脂粉
肉汤培养基
加热溶化或，调PH至7.4，121℃104kPa20min高压消毒后，倒斜面或平匪。用于菌株鉴定、细菌活力鉴定或常规试验用菌株保存。5
YY/T 0127.10—2009
A, 70. 5 m mol/L 组氨酸~生物素溶液D-生物素（相对分子质量244.3)L.-组氨酸盐（相对分子质量191.7)加蒸馏水至
250 mL
121℃104kPa20min高压消毒。4C保存。A. 8S-9 混合液配制
按每毫升S-9混合液计算，见表A.1表A. 1
1S-9 混合液配制
太鼠肝 S
0, 4 mol/L MgCl +1. 65 mol/L KCl 盐游液0, 2 rmnol/L G-磷酸葡萄糖
0. 2 mal/I. 辅酶 Ⅱ
(0. 2 mnl/L.磷酸盐缓冲液(PH7. 4)无菌蒸水
注，上述各成分按比例混句，置冰浴中待用，标准银度
500μL
A.9MgCl2-KCI盐溶液(1.65mol/LKCI+0.4mol/LMgCl)氯化钾(KCI)
氯化镁(MgCl，·6H.0)
蒸馏水加至
121 ℃ 104 kPa 20 min高压消毒。A, 100. 2 moL/L 辅酶 I (NADP)溶液NADP（相对分子质量765.4)
蒸馏水(无菌）
无菌条件下配制·分装于EP管中，一20保存。A, 110. 2 mol/L 6-磷酸葡萄糖(G-6-P)溶液G-6-P钠盐（相对分子质量304.1）蒸馏水（无菌）
无菌条件下配制，分装于EP管中，一20它保存。A.120.2mol/L磷酸盐缓冲液（pE7.4)磷酸二氢钠(NaH,PO4·2H,0)(31.2g/L)磷酸氢二钠(Na2HPO,·12H,0)(71.6g/L)121℃104kPa20min高压消毒4℃保存。A.130.15mol/I.氯化钾溶液
120 mL
高救度
100 μL
20 μL
25 μL
500μL
335 pL
精确称取氮化钾11.18名：用蒸水稀释至1000ml，121℃104kPa30min高压消毒，冷却后冰箱6
保存，用子S-9制备。
A.14氨芙宵霉素溶液（8mg/mL)
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称取三羟氨青露素80mg，加入0.02mol/L氢氧化钠溶液10ml。无菌配制，4℃保存。A.150.1%结晶紫溶液
称取结晶紫 10 mg,加 10 ml.无菌水,4℃保存。A,16四环素溶液(8 mg/mL)
称取四环素40mg，加人0.02mol/L盐酸溶液5mL，用于四环素抗性试验。无菌配制，4℃保存。YY/T 0127. 10-2009
中华人民共和国医药
行业标准
口腔医疗器械生物学评价
第 2 单元;试验方法
鼠伤寒沙门氏籽菌回突变试验bzxz.net
(Ames试验）
YY/T 0127. 10—2009
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印张 0. 75
字数16千学
2009 年 12 月第一版
2009年12月第一次印
书：1550662-20057定价16,00
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