NY/T 1847-2010 微生物肥料生产菌株质量评价通用技术要求 NY/T1847-2010 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS65.080
中华人民共和国农业行业标准
NY/T1847-2010
微生物肥料生产菌株质量评价
通用技术要求
General technical requirements for production strainquality of microhial fertilizer2010-05-20发布
2010-09-01实施
中华人民共和国农业部
本标准的附录A,附录B、附录C,和附录T)为规范唑附录。本标准开中华人民共和禹农业部种柏业管理司提出并归。NY/T1847—2010
标准起草单位：农业部微生物肥料和食用菌菌种质最监肾检验测试中心，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所。
本标滩主要起草人，关大伟、陈慧石、李俊、沈德龙、姜听、杨小红、曹凤明、冯瑞华、李力1范围
NY/T1847—2D10
微生物肥料生产菌株质量评价通用技术要求本标准规定了微生物肥料生产菌株的术语和定义、质量安求、试验方法和评价规则。本标雅适用于微牛物肥料生产中使用的菌株，2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是江日期的引用文件，仪注口期的版本适用下本文件，凡是不注日期的引片文件，其最新版本（包括所有的修政单)适用于本文件。NY882硅腋盐细菌菌种
Y1109微尘物肥料生物安全通用技术准则NY/T1713—2006微生物肥料术语NY1117水溶肥料钙、镁硫含量的测定NY/T1536—2007微生物肥料旧间试验技术规程及肥效评价指南AY/T1735根瘤菌生产菌株质量评价技术规范3术语和定义
NY/T1I13-2006.NY/T1536—2007界定的以及下列术语和定义适用于本文件，为了便于使用，以下重复列山了NY/T1I13:-2006、NY/1536—2007中的某些术讲和定义3.1
微生物肥料microbietlfertilizer含有特定微牛物活体的制品·应用厂农业尘产，通过其中所含微生物的生命活动，增川植物养分的供应量或促进值物生长.提高产量，改善农产品品质及农业生态环境，[NY/T1113--2006.定义2.1]
微生物肥料生产菌株strainformicrobialfertilizerpruduction从自然界分离筛选或经人诱变，其各微生物肥料功能，并可用于生产的菌株。以下将止简称为“菌株”。
基质substrate
措不含日的微生物或日的微牛物被火活的物料。INY/T1536-2007.定义3.7」
4质量要求
4.1基本要求
菌株通过安全性评价：符合NY1109中的规定菌株细胞、菌落形态一致，无杂菌污染，生长繁然方融；生长所需的碳源、氨源等原料易获得。一菌株遗传性状稳定，其功能利发酵性能可长期保持，存活能力强。4.2菌株功能要求
NY/T1847—201L
4.2.1提供或活化养分功能
4. 2. 1.1溶解无机磷能力
在含右难溶性无机磷培养液中，接种菌殊与未接种柑比，可溶性磷的含量增证70mg/L以上。4.2.1.2分解有机磷能力
在含有炸溶性有机磷培养液中，接种菌株与术按种相比，可溶性磷的含查增加5II/L以上：4.2. 1. 3固氮能力
4.2. 1.3. 1共生固氮菌
其有共生固氮作用的菌株质量应符合NY/T1735的规定。4.2.1.3.2自生固氮菌和联合固氮菌在盆栽试验中，接种菌株与术接种处理柑比，植株总含氮量增期最达到t检验的显著水平：4.2.1.4解钾能力
具有解钾作用的菌株压量应符合NY882的规定。4.2.1.5溶解中量元素能力
在含有炸溶性钙、镁或硫元素的培养巾，接种菊株与末接种相比，相应的可溶性元素增加量分别达到「检验的显著水平。
4.2.2产生促进作物生长活性物质能力在适立培养条件下，菌株产牛的其有促迹作物生长功能的活性物质总量应在5mg/L以上。包括赤霉素、哚乙酸、细胞分裂素等：4.2.3促进有机物料腐熟功能
4.2.3.1产纤维素酶能力
在适r的培养条件下，菌株产生纤维索酶的活力在70u/ml()以上：4.2.3.2产木聚糖酶能力
在适宜的培养条件下.菌株产生木聚精酶的活刀在7(0)1/mL(g)以上。4.2.3.3产蛋白酶能力
在适言的培养条件下，菌株产生蛋卢酶的活力在100u/mI<>以上。4.2.4．提高作物品质功能
接种菌株与基质处理相比，提高作物品质效应差异达到统计检验显著水平。4.2.5提高作物抗逆性能力
接种菌株与基质处理相比，能够减轻作物病虫害发牛（病情指数），或提高作物抗例伏、抗早、抗寒、克服作物连作障得等方面的能力，t检验达到显著水平：4.2.6改良和修复土壤功能
4.2. 6.1改良士壤功能
接种菌株与基质处理相比.能够收善土壤容重、团粒结构，养分供给、以及土壤中的微牛物种样结构与数量等，t检验达到显著水平
4.2.6.2修复土壤功能
接种菌株与基质处理相比.能够减少试验作物或「壤中的残留农药、蛋金属等有毒有害物质的含量，检验达到显著水平。
5试验方法
5.1可溶性磷
按附录A规定执行。
5.2固氮能力
接Y/T1735规定热行。
5.3解钾能力
按NY882规定执行。
5.4可溶性钙、镁或硫
按VY1117规定执行。
5.5活性物质
按NY882规定执行，
5.6纤维素酶活力
按附录B规定执行。
5.7本聚糖酶活力
按附录C规定执行.
5.8蛋白酶活力
按闭录D规定执行
5.9作物品质
按NY/T1536见定执行。
5.10作物抗逆性
按NY/T1536规定执行
5.11改良和修复土壤
按NY/T1536规定执行
6评价规则
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菌谜符合个1要求，并行合4.2要求中的任，项.评定其达到牛产菌株的要求，可作为微生物肥料生产菌株。
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A.1范围
附录A
（规范性附录）
可溶性磷的测定方法
本标准规定了用钳抗比色法测定微生物肥料生产菌株溶解难溶性能力的方法。本标滩适用于微生物肥料生产菌株溶解雄性磷能力的测定：A.2原理
在酸性条件下，磷酸盐与酸铵形成劳色锑磷针混合杂多酸络合物、在锑剂存在下，用抗坏血酸将其还原牛成蓝色络合物：弃在-定浓度范用内其颜色深浅与磷的含量成正比。因此可根据测定样品吸光度Ⅱ算可游性磷的含量.
A.3培养基
葡萄糖bZxz.net
(NTT4 SO)
MgS0, : 7H20
Fes0, 4H:0
MnS0. 4Hz0
蒸馏水
无机磷源可为Ca（PO.）AlP,成FeP）·4HOj的一种：加人量为10g！有机磷源为卵磷脂或植酸钙等，加人量为2.0g
A.4试剂与溶液
除非另有说明，在分析中仪使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或头离子水或相当纯度的水。4.4.1氢氢化钠溶液(100g/T）).称取10g氢氧化钠(Na()H)溶于100ml.水.A.4.2酸溶液（体积分数5%）：吸取5mL浓硫酸缓缓加入00mL水，冷却后圳水至100mL，A.4.3洒石锑钾溶液（5g/T).称瑕酒石酸锑钾[KSb(XH,O.1/211,())0.5g.溶于100mL水中。A.4.4钼锑贮存落液：浓硫酸（HSO）153mL缓慢倒人约400mL水中，问时搅拌，放召冷却。另称1Ug钳唆铵（NIL）MoU24HO溶丁约60%的300IL蒸留水中，冷却，将配好的硫酸溶液缓缓倒人钳酸铵熔液中，同时搅拌：随后加人5g/1.酒石峻锑铆溶液（A.4.3)100mL最后用蒸馏水稀释至1000ml。避光保存。
A.4.5铅锑抗显色剂：称取1.50g抗坏血酸（C,11.0，左凝，旋光度121～+22)切入到100mL.组镜妤存液（A，4.4)中。此液须随配随用。4.4.6二硝基酚指示剂：称取9.2g2.6二硝基酚或是2,4-二硝基酚CIIs(HNO.）溶于100ml,水中.4
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A.4.7磷标准贮备溶液(100mg/L):0.4390g磷酸二氢钾(KH,PO.,105℃烘2h)溶于100 ml蒸馏水中，加人5ml.液酸，定容至1000mL。A.4.8磷标准溶液（5mg/)：吸取磷标催备辫液（A.4.7)10mL于200mL容量瓶中，定容。此溶液不宜久存。
A.5仪器与设备
A.5.1分析天平：感量0.0001g
A.5.2摇床。
A.5.3离心机。
A.5.4分光光度计：能检测350nm800nm的吸光度范围，A.6测定
A.6.1待测菌株发酵培养
将活化好的待测菌株按-定比例接种到培养基中（A.3>，在适宜的条件下培养一定时间，即获得待测菌株的发醇产物。同时以加人等量的无菌水的发酵液做究白对照。A.6.2标准曲线绘制
分别吸取磷标准溶液（A.1.8)0mL、1.00mL、2.00mL.3.00mL、7.00ml、5.00mL、6.00mL分别于50mI.容量瓶中，加蒸馏水稀释尘约30tL，加二硝基酚指小剂（A.1.6）2滴，用氢氧化钠溶液(A.4.1)或稀硫酸溶液(A.4.2)调节pII至溶刚呈微黄色。然后加入钳锑抗最色剂(A.4.5)5mL，拥句，定容.即得0.0 mg/L0.1rng/L、0.2mg/L、0.3mg/L0.4mg/1.,0.5mg/L0.6mg/L标准系列溶液。在室温高下15%的条件下放置30mim后，在分光光度计上用波长700mm比色，读取吸光度。以吸光度为纵坐标，磷浓度为横坐标,绘制标准出线或建立回归方程。A.6.3样品测定
将样品（A.6.1)4000r/min离心20min后，吸取上消液5mL-~10mL（含磷5ugr~25g，如超过此范用可适当稀释）」50mL容量瓶中，加水释至约301n，加二硝基酚指示剂（A.1.6)2滴，而氢氧化钠溶液（A.4.1)或稀硫俊溶液（A.4.2)调节TI至溶液刚呈微黄色。然后加入铅铆抗显色剂(A4.5)5mL，匀，定容。在室温尚厂15的条件下放置3)min后，以空白试验溶液作参比调零点，与标准落液察列同条件品色、比色，读瑕吸光度。从工作世戟上否出所测吸光度对应磷的量浓度（P）：A.7结果计算
按照下式计算磷的合量：
PXV×K
式中：
X一培养液中的含量(mg/L)；
P—工作线查得磷的质量浓度（mg/L)：V,—显色液体积(nL)；
K—称释倍数；
V一吸取上清液体积(mL)
A.8重复性
每个试样取两份乎行样选行分析测定，所得结果相对误差不超过10浴，测定结果匝二者算术平均值表示，5
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B.1范围
附录B
【规范性附录】
纤维素酶活力的测定方法滤纸法本标准规是了以滤纸为底物，用还原糖比色法测定微牛物肥料牛产菌株产纤维素海活力的方法。本标准适用汀微生物肥料生产菌株产纤维素活的测定。B.2原理
纤维索醛水解滤纸产生的纤维二瓣、葡菊糖等还原糖能将碱性条件的3，二硝基水杨酸还原，生成标红色的氮基化介物，在540nm被长处有最大吸收：在·定范留内酶解产生的还原辨的量与反应液的吸光度成正比
B.3单位定义
在5%vH5.5条件下，1g(mL)样品1min降解滤纸产尘！橘萄糖为1个嗨活单亿，以u/g(ml表示。
B.4试剂和溶液
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂利蒸水或去商子水或相当纯度的水：B.4.1氢氧化钠溶液（200g/1)：称取氢氧化钠(NaOH)20.0名，加人J00mL水溶解B.4.2柠蒙俊溶液（0.11ol/L)：称胺柠檬酸(C元TI.)·H2()2.13，加水溶解定容至100)mL。B.4.3柠機酸钠溶液(0.tmol/L)：称取柠檬酸钠(NasCH.O，·21I.0))2.91g，水溶解定容至1C0Iml.
B.4.4柠檬酸扑缓冲液（0.05mo1/IpH5.5)：称取檬酸（CTIg.，HgO)10.5g，加t入气氧化钠(Nat)II)5.0g.再加800tmL水溶解，用柠檬酸溶液（B.4.2)或柠檬峻钠溶被（B.4.3)调节pH5.5再加水定容至1000
B.4.5葡萄糖标准溶液（1C.0mg/mL）：将葡萄糖在恒源下燥箱中105℃下干燥至恒重，称取1g精确至0.0001毫，加柠蒙酸盘缓洲液（B.4.4)溶解，定容至100ml。B.4.63.5-二硝基水杨酸溶液（DNS)称取3.5二硝基水杨峻3.15g，加水500ml.搅拌溶解、水浴至45℃，然后逐步加人NaO11溶液（B.4.1)100m，同时不断搅拌，丘至完全解.逐步加人四水酒有酸钾钠(C[1KNa.11I2(0)91.0g、米酚（CHO)2.50g、无水亚硫酸钠(XaS)）2.50g，不断搅拌，直列物质完全溶解，冷却到室温后，定容垒1000mL。过滤，将滤液存于棕色瓶中，避光保存。室温波菌7民后使用，有效期6个月。
B.4.7新华1号滤纸：将待滤纸效人十焕器中平衡24h，平衡后的滤纸制成1.0cm×6.0cm。B.5仪器与设备
B.5.1分析天平:感量为 0.000 1多。B.5. 2 pl1计:精确至 0. 01。
B.5.3分光光度订：能检测350m800nm的吸光度范围.B.5.4离心机。
B.5.5恒温水浴锅：精度+0.2%.
B.5.6摇床。
B.5.7磁力搅拌器：刚加热功能。B.5.8电磁报激器。
B.6测定
B.6.待测菌株的发酵培养
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将活化好的待测菌株按一定比例接种到最造发酵培养基巾，作适宜的条件下培养一定时间，即获得待测菌株的发醇产物。
B.6.2纤维麦酶液的制备
称取发酵产物（B.6.1)5.00多或5.00mL十三角瓶中，根据需要人一定体积柠檬酸盐缓冲液（B.4.4）,200r/min摇床振荡30mim片，于5000r/rmin离心10min.上清液即为得测酶波，再用柠檬险盐缓神液（B.4.4)做适当稀释雅荐浓度范围为酶活力7L/mL32u/mL)。B.6.3标准曲线的绘制
B.6.3.1分别吸取葡萄糖标准溶液(B.4.5)0.00tnl2.00mI.3.00mL4.00mL、6.00mL8.00ml10.00ml,分别用柠檬酸缓冲液（B.4.1)定容至50ml配成浓度为0g/mlL.400/m、600g/mL.800/g/ml、1200g/ml、1500g/ml和2000gg/ml的葡萄精系例标准落液：B.6.3.2分别吸取葡萄糖标雅液(R.6.3.1)各1.00mL于25mL具塞比色管中，各加2.00mL水和2.00 rl.NS试剂(B.4.6)，沸水浴5tnin。冷却至室温，用水定穿至25mL。在540mm波长下,以0/mI葡萄糖标准落液为空凹对照调零点，分别测定各浓度标推溶蔽的吸光度。以吸光度为横坐标，标准带萄糖溶液浓度为纵坐标，列山直线回归方程，每次新配制DNS试剂均需要更新绘制标准曲线。B.6.4样品测定
B.6.4.1吸取10.0nL经过适当释的酶液(H.6.2),50水浴平衡10min。B.6.4.2在25mL其案比色管加入滤纸条（B.1.7)—滤纸条须对称剪成32片并全部放入，加1.0mL柠檬酸盐缓冲液（T3.4.个)没润滤纸片,50℃水溶平衡10min，F依次如人2.00m.TNS试剂(B.4.6).0.5rml.酶液（B.6.4.1).51mL水.电滋娠荡3s-~5s.50%)水溶中保温60min,然后在沸水浴中煮沸5min.冷却至宽温，用水定容签25n：以0g/mL筒药糖标准溶液为空片对照调零点，在540nm波长处测定吸光度A.。
B.6.4.3在25ml.具案比色管中加人滤纸条（B.41.7)-一滤纸条须对称剪成32片并全部放人，加1.0ml.柠酸盐缓冲液(B.4.4)浸润滤纸片，50℃水浴平衡10min，再依次加人0.5mL酶液（B.6.4.1)租5mL水，电滋振荡3s~5,50℃水浴中保温60min.加人2.00nlT>NS剂B.7试样酶活力的计算
按照下式计算样品的滤纸纤维素酶活性：X[(A:A×K| XD
X-样品纤维素酶活力u/（m)
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A嗨空自样的吸光度：
A一酶反应液的吸光度；
K一标谁曲线的斜率，
6标准曲线的截距
刀—试样的总稀释倍数
t一反应时河(min)。
B.8重复性
每个试样最两份平行样进行分析测定，所得结果相对误差不超过20%，测定结果用二者算术平均值表示。
C.1范围
附景C
【规范性附录】
木聚糖酶活力的测定方法
本标准规定了用分光光度法测定微生物肥料上产菌株产术聚糖酶活,力的方法。本标准适用于微生物肥料生产菌株产术聚糖酶活力的测定，C.2原理
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木聚糖酶能将木聚糖降解成享糖和单糖。还原性穿糖和单糖在沸水浴条件下可以与3,5--硝基水杨酸（DVS)试剂发生显色反应。反应颜危的深度与醉解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反成液中木聚糖的活力成正比。岗此通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中木聚糖酶的活力。
C.3酶活单位定义
在50℃plT5.5条件下，1g（m)样品布1min内水解本案底物，生相当」1木糖的还原糖的酶量为1个嗨活力单位，以u/g(mL)表示。C.4试剂和溶液
除非另有说明，在分析中仪使用确认为分析纯的试剂和蒸镐水或去离子水或相当纯度的水。C.4.1氢乳化钠液（200g/L)：称取氢氧化钠(NaO1I)20.0g：加100nI水溶解。C4.2乙酸液(0.1红ml/nL)：吸胶冰乙酸(CH,()0.60mL,加水溶解，定至100ml.C.4.3乙酸钠溶液（0./mol/mL）：称取一水乙酸钠（C2TTgNaC02·3Hz()1.36g.加水溶解，定容至100mL。
C.4.42—乙钠缓冲滋(0.1inol/mL,pIT5.50)：称取三水艺酸钠(CeHaNaO·3H())28.14g加人冰乙酸(IL0)1.70m，加水溶解，定窄至200OmL测定溶液的H，如果pJI偏离5.，序用之酸溶液(C.4.2)或乙酸钠(C4.3)调节至PH5.50。C.4.5木糖溶液（10.0mg/mL)：称取无水木糖（C.Hc）1.000%：用2.酸-乙酸钠缓冲液（(4.4)辫解后定穿至100mL。
C.4.6本聚糖溶液：称取木聚糖(SigmaX0627)1.00g，加人0.32g氢氧化销（NaO1I),加人90m水，磁力搅拌，同时缓慢加热直至完全溶解：然后停止加热：继续搅拌30min后，加人0.mL冰乙酸（CH（））、继续磁搅拌，测定其pH，如果PH为5.50，用乙酸一之酸钠冲液（C.4.1)定容至100nL，如果偏离5.50.再用乙酸溶液（C.4.2)或2酸钠（C.4.3)调节至5.50后，用乙酸乙酸钠缓冲液(C.4.4)定容至100ml。4℃避光保存，有效期12h。C.4.73,5二硝基水杨凌溶液(LNS)：见B.4.6。C.5仪器与设备
见B5。
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C.6测定
C.6.1待测菌株的发酵培养
将活化好的待测菌株按·定比例接种到最适发酵培养基中，在适宜的条件下培养一定时间.即获得待测菌株的发醇产物
C.6.2待测酶液的制备
称取发酵产物（C.6.1)5.00或5.00mL于一角瓶中，根据需要加人·定体积的2酸一乙酸钠较冲液（C.4.），200r/min择床振荡30irnit后，5000r/min离心0min，上清澈即为待测酶液，再用z酸--乙酸缓冲液(C.4.4)做适当稀释（推荐浓度范用为酶活力6u/tmL15u/ml.)。C.6.3标准曲线绘制
C.6.3.1吸取乙酸一乙酸钠缓冲液（C.4.4)4.0mL加入DNS试剂(C4.7)5.0mL.沸水浴加热5mil1：用白来水冷却全室温，用水定容至25.0m，制成标准空白样。C. 6. 3. 2分别吸取不糖溶液(C. 4. 5)1. 00nL、2. 00 ml..3. 00 mL、≤. 00 mL.、5. 00 mL、6. 00)ml 和7. 00L，分别用乙酸乙酸钠缓冲液（(.4.4）定容至1.00mL，配制成浓度为100/mI.200g/mL30g/ml.400g/mL.50 μg/imL、600μ度/mL和700μg/ml.木糖标准溶液。C6.3.3分别吸取上述浓度系列的木糖标准溶液各2.0mI（做个平行）.分别加人到其塞比色管中，再分别加人2.0mT.2酸乙骏钠缓冲液(C.4.4)和5.0mI.DNS试剂(C.4.7)。电磁振荡3s~5s,沸水浴加热5min.用自来水冷却笔案温，用水定容至25mL。以标准空白样(C6.3.1)为对照调零，在MOnnm处测定吸光度A。以木糖浓度为纵坐标，吸光度A为横坐标，绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需斑重薪绘制标准南线。C.6.4样品测定
C.6.4.1吸取10.0n木聚糖溶液（C.4.6）.0℃平衡20mn.吸取10.0ml.经适当释的待测液(c.6.2),50c乎衡20 min。
C.6.4.2吸取2.0mL.待测酶波（C.6.4.1).加人到具塞比色管，再加人INS试剂（C.4.7)5.mI电磁振荡3s-~5s。加入2.0mL木聚糖溶液（C4.6).50%保温30min沸水浴加热5min。用白米水冷却全室温，用水定容至25.0mL，中磁振荡3s~5，以标准空凹样（C.6.3.1)为对照谢零，在5401m处测定吸光度Al。
C.6.4.3吸取2.0mL待测酶液（C.6.4.1).加人到具塞比色管小1，再加入2.0ml.木案糖溶液(C.G.4.1),电磁振荡3sr58,50℃保温30min。加人LNS试剂(<.4.7)5.0mL,电磁振3s-s.以终山酶解反应。沸水浴加热5nit1。用自米水冷却至室温，用水定容至25.mI，电磁振荡3~5s。以标准空H样（c.6.3.1)为对照调零，在540nm处测亲吸光度Az。C.7 酶活力计算
按照下式计算样品的术素糖悔的活力：X=[(A-A)XK+bXD
武中：
X——样品本聚糖酶活方_u/g(ml)A:—酶空自样的吸光度；
A,—嗨反应液的吸光度；
K标准曲线的斜率；
标准出线的截距：
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