NY/T 1902-2010
基本信息
标准号： NY/T 1902-2010
中文名称：饲料中单核细胞增生李斯特氏菌的微生物学检验
标准类别：农业行业标准(NY)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准简介
NY/T 1902-2010 饲料中单核细胞增生李斯特氏菌的微生物学检验
NY/T1902-2010
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标准内容
TCS65.120
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 1902--2010
饲料中单核细胞增生
李斯特氏菌的微生物学检验
Microbiological examination of Listeria monocytogenes in feeds2010-07-08发布www.bzxz.net
2010-09-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准遵照GB/T1.12009给山的规则起草：本标准出业部畜教业司提出。
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归山。言
NY/T 1902—2010
本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国家饲料质量监督检验中心(北京）1。
本标起草人：饶正华、李丽格。1范围
NY/T1902—2010
饲料中单核细胞增生季斯特氏菌的微生物学检验不标准规定了单核细胞增生李斯特氏菌的微牛物学检验方法..本标准适用于对饲料中单核细胞增生车斯特氏菌的分离、鉴定：2规范性引用文件
下列文件对丁木文件的应用是必不可少的：凡足注日期的引用文件：仅注口期的版本适用于不文件，凡是不注口期的引用文件，其最新版不（包括所有的修计单)适用于本文件。GB/T4699.1何料采样（ISO6497，Aninmalfeecingstufs-Sampling，ilT)3仪器与设备
除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1冰箱、
3.2恒温培养箱：30℃+1℃、36℃_1℃。3.3均质器。
3.4显微镜：日镜10×，物镜10×~-100×，3.5电子天平，感量0.1g。
3.6辑形瓶：100mL500 nL。
3.7平：直径90。
3.8试管：16mmX160mm。
3. 9吸管：1mL(具0. 01 mL刻度）,10mL(具0. 1 mL刻度）：4培养基和材料
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水成符合一级用水的规定。4.1增菌肉汤(L.BI、LB)：见附录A第A.1章。4.2PAIAM琼脂：地附录A第A.2章，4.3OXA琼脂：见附录A第A.3章，4.4科玛嘉李斯特氏菌鼎色琼脂。注：由法国科玛嘉公可提供的产品的商品名。给出这信息是为了方便本标准的使和，并不农示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效某，则可莅用这些等效的产品。4. 5食（.6%臀母没膏的胰陈人立琼脂(TSA-YE)：见附录A第A.1章。4.6毕兰氏染色液：见附录A第A.5章4.7SIM动力培养：附录A第A.6章4.8羊血琼脂：见附录A第A.7章，4.9含0.6%酵母浸肾的胰酪陈大豆肉汤(1SBYF):见附录A第A.8章。4.10缓冲葡萄糖蛋白陈水(MR和VP试验用）：见附录A第A.9章。4.11糖发酵培养基：见附录A第A.J0章，1
NY/T 19Q2—2010
4. 12 过氧化氢酶试验;见附录 A第 A. 11章，4.13单核细胞增生季斯特氏菌和阴批对照标准株，如英站克李斯特氏菌(inucu)和供[李斯特菌(L.ivanov)。
4.14API李渐特氏菌鉴定系统。
准：此法国牛物梅型埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对核产品的认川。如果其他等效产品具有相同的效果,则可使月这些等效的产品，5采样
采样数量利方式按（GB/T14699.1执行（采样工具必须是火菌的），包装为袋、瓶和罐装的样品，应从完整的术开时的包装中采取。固休样品应边取边混和；液态样品应逼过振探混勾，采集的试样密封后，应尽快送到微生物检验室，一般应不超过3h。如米时间过长，可将试样于0℃-~5℃中保存。6试样的制备
超过1Imm孔径筛的样品需要研磨，研体必须办先灭菌。制各的试样要在密闭低温保存。饲料试样若不能及时检验，应置于4℃冰箱保存，在241之内检验，7操作步骤
7.1 增菌
以无菌操作称取试样25（或25m)加人到含有225rnl.1.B增菌液的均质容器中，在均质器上连绞均质1min~2min.于30℃+1℃培养24，移取0.1ml.转接于10ml，LB增菌液内：十3℃11培养 18 h~24 h。
7.2分离
取LB：增菌液分别划线分离丁PALCAM琼脂平板、()XA琼脂平板或科玛嘉显色培养上，于36℃土1%培养21h~48h，观察各个平板上生长的菌落，在PALCAM玩脂平极工，单核细胞增生李期特氏菌典型菌落为小的圆形灰绿色菌落，周雷有黑色沉淀形成的晕圈：在OX人平板上，典型菌落量现浅棕色，在其用围形成黑色晕网，培养48h后，茵落颜色加深，黑色晕圈的范困扩大。在科玛嘉显色平板上，典型菌落空规刚蓝色菌落形平有白色晕环。7.3纯化
白选择性掠脂半板上分别挑取5个以上可疑闲落，分别在TSA-YE平板上划绒纯化，36C:土IC培养 24 h。
7.4鉴定
7.4.1染色镜检：李斯特氏菌为吊兰氏防性短杆茵用牛理盐水制成菌悬液，在油镜或树差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动7.4.2动力试验：李斯特低菌有动力.垦今状生长或月牙状生长。7.4.3生化淤定：挑取7.3中纯化的单个可疑菌落，进行过氧化氢酶试验，过氧化氢悔阳性反应闪菌辫继续进行发酵试验和MR-VP试验：单核细跑增生李斯特低菌的主要生化特征见表1.表1单核细胞增生李斯特氏菌生化特征与其他李斯特氏菌的区别荫种
单核细脑增牛本斯特氏菌
.. mamarytngenes
游而反症典型运葡萄糖麦芽糖
鼠李结
格民李斯特氏菊
(L.gruyi)
斯氏李斯特低荫
(t. seeligeri)
藏氏季斯特氏菌
(Luesher)
伊民李斯待菌
(I. irawowt)
滞克李斯特氏菌
..maca)
济血反应
典型运础
表１(续）
谢萄糖
是芽糖
H器醇
注1:+阳性：一阴性；V反应小定。注2:六种今斯特菌过氯化签酶、革兰氏染色、动力试验，MR·VP试验均为阳性。NY/T 1902—2010
鼠李籍
七叶苔
7.4.4溶鼠试验：将羊血凉脂平板底面划分为20个-25个小格，挑取7.3中纯化的单个可疑菌落刺种到而平板工，每格种一个菌落，并刺种阳性对照菌（单核细胞增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌）和阴性对照菌（英诺克李斯特氏菌），穿刺时尽量接近底部，但不要触到底面，间时避免录脂彼裂，36℃十1℃增养24~48h，明亮处观察。单核细胞增工李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菊在刺种点周围生获小的透明溶拍环，英诺克李斯特氏菌无游血环，伊氏李斯特菌产生大的透溶血环.7.4.5协同落而试验(CAMP)：在羊血琼脂乎板上平行线接种：金黄色葡衡球菌（Staphgrluccocusatre）ATCC4914/和马红球菌（Rhodococcusen）ATC:6939，挑瑕7.3中纯化的单个可疑菌落垂直划线接种于平行线之间，垂直线两端不婴触及平行线，于30℃:1℃培养241~48h：单核纫胞增牛李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌的接种溶血增强，斯氏李斯特氏菌溶血也增强，而妍氏李斯特氏菌在靠近马红球菌的接种端溶血增亟。可用AP1李斯特氏菌鉴定系统代替本试验。7.5质控实验
每次检验均需用标准附性菌株利防性菌株进行质量控制。在6试样制备的同时，在·个作为空白对照的LB增菌液中加入新鲜配制的每毫升含有19个~-100个单核细胞增生李斯特菊的阳性标准茵株培养物稀释液1rmL和阴性菌株培养物：按检验程序避行同步检验，8结果报告
如果7.4.1~7.4.5的试验结果符合单核细胞增生李斯特氏菌的特征，报告25（25m）试样中检山单核纫跑增牛李斯特氏菌。如果不符个，报代25g（减25mL)试样中未检山单核绚胞增生车斯特氏菌。
9小鼠毒力试验
需逆一步鉴定其致病，可做小鼠毒力试验(附录B)，NY/T1902-—2010
A1李氏增菌肉汤(LB,TB2)
A1.1成分
多价陈
酵母膏
氯化钠
磷酸二氢钾
磷酸氢二钠
七三苷
蒸馏水
A.1.2配制
(规范性附录）
培养基、试验溶液的配制和试验方法5.0g
I 009 ml.
将上述成分热溶解，调pH至7.2~7.4，分装，121高压灭菌15mi，备用。4. 1.2. 1李氏T液(LB )225 mL. 中加人：1%啶酮峻（用C.05mol/L.氯氧化钠溶液配制)1%吖啶黄(用无菌蒸馏水配制）
A. 1.2.2李氏 II额(LBz)200 mL. 中期人：1%萘啶削酸
1%吖啶黄
. b m.
经无菊操作分装于适当容帮中，每份10 mL。A.2PALCAM 琼脂
A.2.1成分
酵母膏
葡萄糖
七叶苷
柠檬酸铁铵
甘露醇
氯化锂
酪蛋白胰酶消化物
心胰酶消化物
卡米淀粉
肉胃消化物
氯化钠
蒸馏水
A.2.2配制
1000 mL
将上述成分加热溶解，调pH垒7.2-~7.4分装，121℃商压灭菌15mi.备用，A.2.2.1PAICAM选择性添加剂
多黏菌素
盐酸吖啶黄
头孢他啶
无菌蒸馏水
A.2.2.2配制
NY/T 1902—2010
将PALCAM基础培养基溶化后冷却至50%℃圳人2mLPALCAM选择性添加剂，混与后佩倒在无菌的平匪，备用。
A.3牛津琼脂(X4)
A.3.1成分
蛋白陈
氯化钠
柠檬酸钦铵
氯化锂
蒸馏水
吖啶黄素
头孢双硫唑巾氧
放线菌
硫酸盐黏菌素
A.3.2配制
1 000 mL
除吖啶黄素、头孢双硫唑甲氧、放线菌虱、硫酸盐黏菌素，磷奔素和琼脂外，将其他成分加热煮沸溶解冷却后，调pH垒7.0~-7.1，再加人琼脂，21℃高压灭案15min，冷却至50无菌操作，加人用5ml乙厚和5ml，无菌水溶解的吖啶黄素、头孢双硫唑甲氧、放线菌酮、硫俊盐黏菌素和磷霉素，拯勺，倾注平板。
A.4含0.6%酵母膏胰酪藤大豆琼脂（TSA-YE）A.4.1成分
多价乐
醉母膏
氧化钠
磷酸氢二钾
葡萄糖
NY/T19022010
蒸馏水
A.4.2配制
1 000 ml.
将上述各成分加热搅拌辫解，调pH率7.2~7.，分装，121%高压火菌15mim，备用。A5草兰氏染色液
A.5.1结晶紫染色液
A.5.1.1成分
结晶紫
95%乙醇
1罩酸铵水溶液
A.5.1.2配制
20. 0 ml.
将结品紫完全溶解丁乙醇！,然后与草酸铵溶液泥台：A.5.2革兰氏碘液
A.5.2.1成分
蒸馏水
A.5.2.2配制
将碘与碘化钟先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振探，待完全溶解后，加蒸馏水至300mL：A.5.3沙黄复染液
A.5.3.1成分
95%乙醇
蒸馅水
A.5.3.2配制
将沙黄榕解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。A.5.4染色法
A.5.4.1将纯培养的.单个疑菌落涂片，在火焰上固定，满加结品紫染色液，染色1min，水洗A.5.4.2滴加革兰氏碘液，作用1trirz,水洗。1.5.4.3滴加95%乙醇脱色，15s~30，直至染色羧被洗掉，不要过分脱色，水洗。A.5.4.4滴如复染被.复染 1 min,水洗,待干,镜检。A.5.5染色结果
董兰氏阳性菌紫色，毕兰氏阴性菌呈红色。A.6SIM动力试验
1.6.1成分
多价陈
硫酸铁铵
硫代硫酸钠
蒸馏水
A.6.2配制
将上述务成分加热混匀，调pH7.2,分装小试管，121℃尚压灭菌15min，备用。A.6.3试验方法
NY/T 1902—2010
挑取纯培养的单个可疑菌游穿刺接和到STM墙养基中，丁30℃培养24h~18h.观密结果.A.7羊血琼脂
A.7.1成分
牛肉膏
氮化钠
蒸馅水
脱纤维羊血
A.7.2配制
100 mL
5 mL---10 mL
除新鲜脱纤维血外，血热溶化上述各组分，121℃高压灭菌15min，冷垒50℃，以无菌操作册人新鲜脱纤维羊血，藩勾，倾注平板。A.8含0.6%醇母膏的胰酪陈大豆肉汤(TSB-YE)A.8.1成分
多价陈
熟化钠
磷酸氨二钾
葡莅糖
蒸馏水
A.8.2配制
1000ml
将上述各成分加热搅拌溶解，调至pH7.2~.7.1，分装，121℃灭菌15min，各用。A. 9 MR-VP试验
A.9.1缓冲葡萄糖蛋白陈水(MIK和YI试验用）A.9.1.1成分
磷酸氢二钾，
多价陈
葡萄糖
蒸馏水
A 9. 1. 2配制
1000mL
溶化后校正pH7.0,分装试管：每管1mL,121℃高压灭菌15minA.9.1.3试验方法
将可新保落接种至此培养基中，35℃二1℃培养48hA.9.2甲基红（MR）试剂
NY/T1902—2010
A.9.2.1成分
州基经
95%艺醇
A. 9. 2. 2 配制
甲基红溶丁95%乙醇中，然后加人蒸馏水，混勾A.9.2.3试验方法
培养之d-~5寸,滴加甲基红试剂一滴，立即观察结果。鲜红色为阳性，黄色为阴性。A. 9. 3 V-P试验试剂
A. 9. 3. 1 肌酸溶液
A. 9. 3. 1. 1、成分
肌酸单水化合物
蒸馏水
A. 9. 3. 1. 2 配制
将肌峻单水化合物潜丁水中,备用。A.9.3.2w-酚乙醇溶液
A.9.3.2. 1成分
96%乙醇
A. 9. 3. 2. 2 配制
蒋α-藜酚溶丁乙醇溶液中。
4.9.3.340%氢氧化钾溶液
A. 9. 3. 3. 1 成分
氨氧化钾
蒸馅水
A. 9. 3. 3. 2配制
将氢氰化溶于水中。
A.9.3.4试验方法
培养2d~-4d后，加入6%α-案酚-乙醇溶液0.5mL和40%氢氧化钾溶液(.2mI加人2滴肌酸溶液，充分振操试管，观察结果。性反成立刻或丁0.5内山现粉红色至葡萄酒红色；如为阴性，应放在36%1%1下培养4h再行观察。
A.10糖发酵管
A10.1成分
牛肉膏
蛋白膝
氯化钠
磷酸氢钠(NaHPO4·12H.0)
0.2为溴香草酚蓝溶液
蒸馏水
A.10.2配制
NY/T 1902—2010
A.10.2.1葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0.5%加人葡萄糖：分装「有一个倒胃小管的小试管内，121℃高压灭菌15mi1，备用。4.10.2.2其他各种糖发撑管可接上述成分配好后，分装每瓶1001mL，121℃高压灭菌15min：丹将各种糖类分别配好10%落液，同时高压灭菌。将5m糖溶液加人100m山培养某内，以无菊操作分装小试管。
A.10.3试验方法
取适量纯培养物接种丁糖发酵管，丁36℃工1℃培养21h-.8h，观察结果．蓝色为阴性，黄色为附A.11过氧化氢酶试验
A.11.1试剂
3%过氧化氢溶液：临川时配制
A.11.2试验方法
挑取固体培养基上菌落一接种环，涂抹丁无菌玻片或心菌培养而中，然后滴加3%过氧化氢辫液，观察结果。
A.11.3结果
于半分钟内发生气泡者为阳性，不发望气泡者为阴性。NX/11902—2010
(资料性附录）
小鼠毒力试验
将符合带核纫胞增牛李斯特氏菌特性的纯培养物接种于TSBYE肉荡中，于30℃土1%培养24h.4000r/min离心5min.分上洁液，用无菌生理盐水制备成浓度为！0（FU/ml的菌悬液。取此菌悬液进行小鼠腹腔注射3只~5只，每只0.5mL，观察小鼠死亡情况。致病株于2α~5d内死亡，试验时：川用凹知菌做对照。单核细胞增生李期斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌对小鼠有致病性。们
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中华人民共和国农业行业标准
NY/T 1902--2010
饲料中单核细胞增生
李斯特氏菌的微生物学检验
Microbiological examination of Listeria monocytogenes in feeds2010-07-08发布www.bzxz.net
2010-09-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准遵照GB/T1.12009给山的规则起草：本标准出业部畜教业司提出。
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归山。言
NY/T 1902—2010
本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国家饲料质量监督检验中心(北京）1。
本标起草人：饶正华、李丽格。1范围
NY/T1902—2010
饲料中单核细胞增生季斯特氏菌的微生物学检验不标准规定了单核细胞增生李斯特氏菌的微牛物学检验方法..本标准适用于对饲料中单核细胞增生车斯特氏菌的分离、鉴定：2规范性引用文件
下列文件对丁木文件的应用是必不可少的：凡足注日期的引用文件：仅注口期的版本适用于不文件，凡是不注口期的引用文件，其最新版不（包括所有的修计单)适用于本文件。GB/T4699.1何料采样（ISO6497，Aninmalfeecingstufs-Sampling，ilT)3仪器与设备
除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1冰箱、
3.2恒温培养箱：30℃+1℃、36℃_1℃。3.3均质器。
3.4显微镜：日镜10×，物镜10×~-100×，3.5电子天平，感量0.1g。
3.6辑形瓶：100mL500 nL。
3.7平：直径90。
3.8试管：16mmX160mm。
3. 9吸管：1mL(具0. 01 mL刻度）,10mL(具0. 1 mL刻度）：4培养基和材料
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水成符合一级用水的规定。4.1增菌肉汤(L.BI、LB)：见附录A第A.1章。4.2PAIAM琼脂：地附录A第A.2章，4.3OXA琼脂：见附录A第A.3章，4.4科玛嘉李斯特氏菌鼎色琼脂。注：由法国科玛嘉公可提供的产品的商品名。给出这信息是为了方便本标准的使和，并不农示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效某，则可莅用这些等效的产品。4. 5食（.6%臀母没膏的胰陈人立琼脂(TSA-YE)：见附录A第A.1章。4.6毕兰氏染色液：见附录A第A.5章4.7SIM动力培养：附录A第A.6章4.8羊血琼脂：见附录A第A.7章，4.9含0.6%酵母浸肾的胰酪陈大豆肉汤(1SBYF):见附录A第A.8章。4.10缓冲葡萄糖蛋白陈水(MR和VP试验用）：见附录A第A.9章。4.11糖发酵培养基：见附录A第A.J0章，1
NY/T 19Q2—2010
4. 12 过氧化氢酶试验;见附录 A第 A. 11章，4.13单核细胞增生季斯特氏菌和阴批对照标准株，如英站克李斯特氏菌(inucu)和供[李斯特菌(L.ivanov)。
4.14API李渐特氏菌鉴定系统。
准：此法国牛物梅型埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对核产品的认川。如果其他等效产品具有相同的效果,则可使月这些等效的产品，5采样
采样数量利方式按（GB/T14699.1执行（采样工具必须是火菌的），包装为袋、瓶和罐装的样品，应从完整的术开时的包装中采取。固休样品应边取边混和；液态样品应逼过振探混勾，采集的试样密封后，应尽快送到微生物检验室，一般应不超过3h。如米时间过长，可将试样于0℃-~5℃中保存。6试样的制备
超过1Imm孔径筛的样品需要研磨，研体必须办先灭菌。制各的试样要在密闭低温保存。饲料试样若不能及时检验，应置于4℃冰箱保存，在241之内检验，7操作步骤
7.1 增菌
以无菌操作称取试样25（或25m)加人到含有225rnl.1.B增菌液的均质容器中，在均质器上连绞均质1min~2min.于30℃+1℃培养24，移取0.1ml.转接于10ml，LB增菌液内：十3℃11培养 18 h~24 h。
7.2分离
取LB：增菌液分别划线分离丁PALCAM琼脂平板、()XA琼脂平板或科玛嘉显色培养上，于36℃土1%培养21h~48h，观察各个平板上生长的菌落，在PALCAM玩脂平极工，单核细胞增生李期特氏菌典型菌落为小的圆形灰绿色菌落，周雷有黑色沉淀形成的晕圈：在OX人平板上，典型菌落量现浅棕色，在其用围形成黑色晕网，培养48h后，茵落颜色加深，黑色晕圈的范困扩大。在科玛嘉显色平板上，典型菌落空规刚蓝色菌落形平有白色晕环。7.3纯化
白选择性掠脂半板上分别挑取5个以上可疑闲落，分别在TSA-YE平板上划绒纯化，36C:土IC培养 24 h。
7.4鉴定
7.4.1染色镜检：李斯特氏菌为吊兰氏防性短杆茵用牛理盐水制成菌悬液，在油镜或树差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动7.4.2动力试验：李斯特低菌有动力.垦今状生长或月牙状生长。7.4.3生化淤定：挑取7.3中纯化的单个可疑菌落，进行过氧化氢酶试验，过氧化氢悔阳性反应闪菌辫继续进行发酵试验和MR-VP试验：单核细跑增生李斯特低菌的主要生化特征见表1.表1单核细胞增生李斯特氏菌生化特征与其他李斯特氏菌的区别荫种
单核细脑增牛本斯特氏菌
.. mamarytngenes
游而反症典型运葡萄糖麦芽糖
鼠李结
格民李斯特氏菊
(L.gruyi)
斯氏李斯特低荫
(t. seeligeri)
藏氏季斯特氏菌
(Luesher)
伊民李斯待菌
(I. irawowt)
滞克李斯特氏菌
..maca)
济血反应
典型运础
表１(续）
谢萄糖
是芽糖
H器醇
注1:+阳性：一阴性；V反应小定。注2:六种今斯特菌过氯化签酶、革兰氏染色、动力试验，MR·VP试验均为阳性。NY/T 1902—2010
鼠李籍
七叶苔
7.4.4溶鼠试验：将羊血凉脂平板底面划分为20个-25个小格，挑取7.3中纯化的单个可疑菌落刺种到而平板工，每格种一个菌落，并刺种阳性对照菌（单核细胞增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌）和阴性对照菌（英诺克李斯特氏菌），穿刺时尽量接近底部，但不要触到底面，间时避免录脂彼裂，36℃十1℃增养24~48h，明亮处观察。单核细胞增工李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菊在刺种点周围生获小的透明溶拍环，英诺克李斯特氏菌无游血环，伊氏李斯特菌产生大的透溶血环.7.4.5协同落而试验(CAMP)：在羊血琼脂乎板上平行线接种：金黄色葡衡球菌（Staphgrluccocusatre）ATCC4914/和马红球菌（Rhodococcusen）ATC:6939，挑瑕7.3中纯化的单个可疑菌落垂直划线接种于平行线之间，垂直线两端不婴触及平行线，于30℃:1℃培养241~48h：单核纫胞增牛李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌的接种溶血增强，斯氏李斯特氏菌溶血也增强，而妍氏李斯特氏菌在靠近马红球菌的接种端溶血增亟。可用AP1李斯特氏菌鉴定系统代替本试验。7.5质控实验
每次检验均需用标准附性菌株利防性菌株进行质量控制。在6试样制备的同时，在·个作为空白对照的LB增菌液中加入新鲜配制的每毫升含有19个~-100个单核细胞增生李斯特菊的阳性标准茵株培养物稀释液1rmL和阴性菌株培养物：按检验程序避行同步检验，8结果报告
如果7.4.1~7.4.5的试验结果符合单核细胞增生李斯特氏菌的特征，报告25（25m）试样中检山单核纫跑增牛李斯特氏菌。如果不符个，报代25g（减25mL)试样中未检山单核绚胞增生车斯特氏菌。
9小鼠毒力试验
需逆一步鉴定其致病，可做小鼠毒力试验(附录B)，NY/T1902-—2010
A1李氏增菌肉汤(LB,TB2)
A1.1成分
多价陈
酵母膏
氯化钠
磷酸二氢钾
磷酸氢二钠
七三苷
蒸馏水
A.1.2配制
(规范性附录）
培养基、试验溶液的配制和试验方法5.0g
I 009 ml.
将上述成分热溶解，调pH至7.2~7.4，分装，121高压灭菌15mi，备用。4. 1.2. 1李氏T液(LB )225 mL. 中加人：1%啶酮峻（用C.05mol/L.氯氧化钠溶液配制)1%吖啶黄(用无菌蒸馏水配制）
A. 1.2.2李氏 II额(LBz)200 mL. 中期人：1%萘啶削酸
1%吖啶黄
. b m.
经无菊操作分装于适当容帮中，每份10 mL。A.2PALCAM 琼脂
A.2.1成分
酵母膏
葡萄糖
七叶苷
柠檬酸铁铵
甘露醇
氯化锂
酪蛋白胰酶消化物
心胰酶消化物
卡米淀粉
肉胃消化物
氯化钠
蒸馏水
A.2.2配制
1000 mL
将上述成分加热溶解，调pH垒7.2-~7.4分装，121℃商压灭菌15mi.备用，A.2.2.1PAICAM选择性添加剂
多黏菌素
盐酸吖啶黄
头孢他啶
无菌蒸馏水
A.2.2.2配制
NY/T 1902—2010
将PALCAM基础培养基溶化后冷却至50%℃圳人2mLPALCAM选择性添加剂，混与后佩倒在无菌的平匪，备用。
A.3牛津琼脂(X4)
A.3.1成分
蛋白陈
氯化钠
柠檬酸钦铵
氯化锂
蒸馏水
吖啶黄素
头孢双硫唑巾氧
放线菌
硫酸盐黏菌素
A.3.2配制
1 000 mL
除吖啶黄素、头孢双硫唑甲氧、放线菌虱、硫酸盐黏菌素，磷奔素和琼脂外，将其他成分加热煮沸溶解冷却后，调pH垒7.0~-7.1，再加人琼脂，21℃高压灭案15min，冷却至50无菌操作，加人用5ml乙厚和5ml，无菌水溶解的吖啶黄素、头孢双硫唑甲氧、放线菌酮、硫俊盐黏菌素和磷霉素，拯勺，倾注平板。
A.4含0.6%酵母膏胰酪藤大豆琼脂（TSA-YE）A.4.1成分
多价乐
醉母膏
氧化钠
磷酸氢二钾
葡萄糖
NY/T19022010
蒸馏水
A.4.2配制
1 000 ml.
将上述各成分加热搅拌辫解，调pH率7.2~7.，分装，121%高压火菌15mim，备用。A5草兰氏染色液
A.5.1结晶紫染色液
A.5.1.1成分
结晶紫
95%乙醇
1罩酸铵水溶液
A.5.1.2配制
20. 0 ml.
将结品紫完全溶解丁乙醇！,然后与草酸铵溶液泥台：A.5.2革兰氏碘液
A.5.2.1成分
蒸馏水
A.5.2.2配制
将碘与碘化钟先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振探，待完全溶解后，加蒸馏水至300mL：A.5.3沙黄复染液
A.5.3.1成分
95%乙醇
蒸馅水
A.5.3.2配制
将沙黄榕解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。A.5.4染色法
A.5.4.1将纯培养的.单个疑菌落涂片，在火焰上固定，满加结品紫染色液，染色1min，水洗A.5.4.2滴加革兰氏碘液，作用1trirz,水洗。1.5.4.3滴加95%乙醇脱色，15s~30，直至染色羧被洗掉，不要过分脱色，水洗。A.5.4.4滴如复染被.复染 1 min,水洗,待干,镜检。A.5.5染色结果
董兰氏阳性菌紫色，毕兰氏阴性菌呈红色。A.6SIM动力试验
1.6.1成分
多价陈
硫酸铁铵
硫代硫酸钠
蒸馏水
A.6.2配制
将上述务成分加热混匀，调pH7.2,分装小试管，121℃尚压灭菌15min，备用。A.6.3试验方法
NY/T 1902—2010
挑取纯培养的单个可疑菌游穿刺接和到STM墙养基中，丁30℃培养24h~18h.观密结果.A.7羊血琼脂
A.7.1成分
牛肉膏
氮化钠
蒸馅水
脱纤维羊血
A.7.2配制
100 mL
5 mL---10 mL
除新鲜脱纤维血外，血热溶化上述各组分，121℃高压灭菌15min，冷垒50℃，以无菌操作册人新鲜脱纤维羊血，藩勾，倾注平板。A.8含0.6%醇母膏的胰酪陈大豆肉汤(TSB-YE)A.8.1成分
多价陈
熟化钠
磷酸氨二钾
葡莅糖
蒸馏水
A.8.2配制
1000ml
将上述各成分加热搅拌溶解，调至pH7.2~.7.1，分装，121℃灭菌15min，各用。A. 9 MR-VP试验
A.9.1缓冲葡萄糖蛋白陈水(MIK和YI试验用）A.9.1.1成分
磷酸氢二钾，
多价陈
葡萄糖
蒸馏水
A 9. 1. 2配制
1000mL
溶化后校正pH7.0,分装试管：每管1mL,121℃高压灭菌15minA.9.1.3试验方法
将可新保落接种至此培养基中，35℃二1℃培养48hA.9.2甲基红（MR）试剂
NY/T1902—2010
A.9.2.1成分
州基经
95%艺醇
A. 9. 2. 2 配制
甲基红溶丁95%乙醇中，然后加人蒸馏水，混勾A.9.2.3试验方法
培养之d-~5寸,滴加甲基红试剂一滴，立即观察结果。鲜红色为阳性，黄色为阴性。A. 9. 3 V-P试验试剂
A. 9. 3. 1 肌酸溶液
A. 9. 3. 1. 1、成分
肌酸单水化合物
蒸馏水
A. 9. 3. 1. 2 配制
将肌峻单水化合物潜丁水中,备用。A.9.3.2w-酚乙醇溶液
A.9.3.2. 1成分
96%乙醇
A. 9. 3. 2. 2 配制
蒋α-藜酚溶丁乙醇溶液中。
4.9.3.340%氢氧化钾溶液
A. 9. 3. 3. 1 成分
氨氧化钾
蒸馅水
A. 9. 3. 3. 2配制
将氢氰化溶于水中。
A.9.3.4试验方法
培养2d~-4d后，加入6%α-案酚-乙醇溶液0.5mL和40%氢氧化钾溶液(.2mI加人2滴肌酸溶液，充分振操试管，观察结果。性反成立刻或丁0.5内山现粉红色至葡萄酒红色；如为阴性，应放在36%1%1下培养4h再行观察。
A.10糖发酵管
A10.1成分
牛肉膏
蛋白膝
氯化钠
磷酸氢钠(NaHPO4·12H.0)
0.2为溴香草酚蓝溶液
蒸馏水
A.10.2配制
NY/T 1902—2010
A.10.2.1葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0.5%加人葡萄糖：分装「有一个倒胃小管的小试管内，121℃高压灭菌15mi1，备用。4.10.2.2其他各种糖发撑管可接上述成分配好后，分装每瓶1001mL，121℃高压灭菌15min：丹将各种糖类分别配好10%落液，同时高压灭菌。将5m糖溶液加人100m山培养某内，以无菊操作分装小试管。
A.10.3试验方法
取适量纯培养物接种丁糖发酵管，丁36℃工1℃培养21h-.8h，观察结果．蓝色为阴性，黄色为附A.11过氧化氢酶试验
A.11.1试剂
3%过氧化氢溶液：临川时配制
A.11.2试验方法
挑取固体培养基上菌落一接种环，涂抹丁无菌玻片或心菌培养而中，然后滴加3%过氧化氢辫液，观察结果。
A.11.3结果
于半分钟内发生气泡者为阳性，不发望气泡者为阴性。NX/11902—2010
(资料性附录）
小鼠毒力试验
将符合带核纫胞增牛李斯特氏菌特性的纯培养物接种于TSBYE肉荡中，于30℃土1%培养24h.4000r/min离心5min.分上洁液，用无菌生理盐水制备成浓度为！0（FU/ml的菌悬液。取此菌悬液进行小鼠腹腔注射3只~5只，每只0.5mL，观察小鼠死亡情况。致病株于2α~5d内死亡，试验时：川用凹知菌做对照。单核细胞增生李期斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌对小鼠有致病性。们
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