NY/T 1903-2010
基本信息
标准号： NY/T 1903-2010
中文名称：牛胚胎性别鉴定技术方法 PCR法
标准类别：农业行业标准(NY)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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标准简介
NY/T 1903-2010 牛胚胎性别鉴定技术方法 PCR法
NY/T1903-2010
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标准内容
ICS 65.020.30
中华人民共和国农业行业标准
NY/T1903-2010
牛胚胎性别鉴定技术方法
PCR法
Proccdures for sex identification of bovine embryos-PCR technigues2010-07-08 发布
2010-09-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标雅遵照GH/T1.1-2009给出的现则起草。本标准由中华人民共和国农业部畜牧业司提出.本标推由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TYC274)归11本标准起草单位：全国畜救总站。NY/T1903—2010
本标准主要起草人：正志刚、刘生、于福清、赵俊金、邱小口、史建民、孟飞韩旭。1范围
牛胚胎性别鉴定技术方法
PCR法
本标症规定了聚合酶链式反应(PCR)方法鉴定胚胎性别的操作方法本标准适用普通牛（Bosuurtr）胚胎性别整定。2规范性引用文件
NY/T1903-—2010
下列文件对于本义件的应用是必不可少的：凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于小文件：凡是不法日期的引用义件，其最新版本(包括所有的修改单)适用丁本文件。GA/T383法庭科学DNA实验室检验规范SN/T1119进门动物源性饲料巾牛羊源性成分检测方法PCR方法SN/T1193基因检验实验室技术要求3原理
从被检胚暗中取出部分纫跑，提取DVA，利用Y染色体上的特异列设计引物进行扩增和检测，根扩增结果鉴定性别。
4取样
4.1胚胎预处理
冷冻胚胎在家温下停留10，然后32℃温育20s，用肝胚胎清洗液将附若在肝胎周围的细胞与碎片彻底洗除，待用；新鲜胚胎直按用胚脸清洗液将附着在环阶周围的细胞与碎片御底除，待用。4.2胚胎细胞取样
4.2.1显微分制法
成用显微操作仪切开透明带，最叫4个~8个胚胎细胞。4.2.2徒手分割法
先用0.1%~~0.2%链霉蛋白酶软化透明带.在实体显微镜下，用切割针切割胚胎.取出4个~8个细施胚胎细胞：
5鉴定
5.1试剂和仪器设备
试剂和仪器签见附录A。
5.2鉴定过程
5.2.1DNA提取
5.2.1.1蛋白酶K消化法
将胚胎绑胞移人PCR管中，人2Coul,~500uL胚胎裂解液，55℃消化15min~30min,95℃~98%灭活蛋自酶K5min~.10min,10000×g离心30s~-45s，取上清液作为PCR反应模板。5.2.1.2加热释出法
将胚胎细胞移入PCR管中，加人200uL~590μut灭菌双蒸水，100℃煮沸10nin1000×g离心30s~-45$取上清液作为为PCR反应模板。1
NY/T1903—2010
5. 2. 1. 3液氮反复冻融法
将胚胎细胞移人PCR管中，加入2001~500μL火菌双蒸水，川液氮反复冻融几次，i0000×g离心 30 g-~45 s,取上清液作为 FCR反应模板。5.2.2目的基因片段PCR扩增
5.2.2. 1 引物制备
引物1序列（牛Y染色体蛋复序列引物)：引物IF5GAT,CAC.TAT,ACA,TAC,ACC,ACT-3：I物IR5-GCT.ATG,CTA.ACA,CAA,ATT,IG3引物2序列(牛特异性DNA序列的引物)：引物2F5G,AAG,CAA,AGA,ACC,CCG,CI3引物 2R'-TCG,TCA,GAA,ACO,GA,CAC,TG-3*将个成的物瞬时离心，加入火菌双蒸水，室温游懈3）min，分装，20%冷冻保存。其中，加人火菌超纯水的体积V(uL)，按式(I)计算：武：
MW-引物分子量;
V 33 X() X i06
DNA260Tm吸收的光密度。
5.2.2.2ICR反应体系
PCR反应体系泌表 1.
表 1 PCR 反应体系
分及浓度
icXuuffer
MgCl, (2h uunol/ L)
UNTPs(25 mrual/1)
引1(10 ptnol/,)
场 2(10 rmo./ pL)
DNA模饭
Tag NA 聚合酶GU/μt.)
5.2.2.3PCR反应条件
使用显
C. 9 μrL--1. 5 pμL
C. 9 ,μL---1. 2 μL
0. 15 μL--0. 75 ,μL
0. 15 μ1-~. 7n μ1.
3. 75 1~-\. 0 U
加盆15止
94C预变性min，然后进行10个~15个循坏的扩增反应，每个循环包括94℃变性20s~30s，52%~58℃退火305~45s，72℃聚个30%~~158；再进行20个~25个循坏的扩增反应，每个环包括94℃变性20830s,52%--58退火30s458，72℃聚合30s45s;72℃延伸10mi12℃保存。首先加入引物1，扩增10个15个话环后再加入引物2。5.2.3结果判定
将扩增产物电泳检测，产生141bp和216bp两条，判定该胎为摊性；产尘216bp条带，判定该腔胎为非性
5.2.4 实验对照
阳性对照为公牛样品，阴性对照为盘样品，空H刘照为抑等量双蒸水，2
结果表述
XXX坏胎的性别为烘性(或维性)：防污染措施
按 SN/T 1193,SN/T 1119和GA/T 383力法热行.NY/T1903—2010
NY/T 1903—2010
A.1试剂
A.1.1胚胎清洗液
附录A
[资料性附录]
试剂和仪器
含1mg/ml.聚2醇的杜氏磷酸盐缓冲液（PBS液）。A.1.2胚胎解液
含蛋凹K的1×PCR缓冲液(500mmol/LKCl,100mmol/LTris-IIClμH9.0,1%TritonX-100)(蓝白酶K现用现加)。
A.1.3电泳缓冲液
1XTris Z酸(TAE):0.04 rioi/LTris2酸.0.0lmol/LEDTA0.5XTrix-硼酸(TEE)：0.M5mol/LTris-硼酸.0.01mol/L.EDTA。A.1.4溴化乙锭溶液(EB10mg/ml.)川少员双蒸水溶解1溴化乙锭，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，定容牵100m，然后转移创棕色或铝箔包裹容器中，室温保存A. 1.5 6× 上样缓冲液
0.05%浪酚蓝，0.05%二甲米声F°.40%（W/V）熊沸溶波或9.05%澳蓝，0.03%二甲苯背FF30%甘油溶液wwW.bzxz.Net
4. 1. 6 蛋白酶 K(20 mg/ mL):分析纯A. 1. 7 Tan DNA 聚合酶
NTPs:dATP,dCTP、dGTP 和 dTIPDNA Marker
A.2仪器设备
A.2.1疑胶成像分析系统
A.2.2体视显微镜
A. 2.3 CR 扩增仪
A.2.4离心机
A.2.5涡旋震荡器
A.2.6可调移液器
A.2.7稳压稳流电泳仪
A.2.8水平电泳槽
A.2.9超纯水器
A.2.10高压灭菌器
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中华人民共和国农业行业标准
NY/T1903-2010
牛胚胎性别鉴定技术方法
PCR法
Proccdures for sex identification of bovine embryos-PCR technigues2010-07-08 发布
2010-09-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标雅遵照GH/T1.1-2009给出的现则起草。本标准由中华人民共和国农业部畜牧业司提出.本标推由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TYC274)归11本标准起草单位：全国畜救总站。NY/T1903—2010
本标准主要起草人：正志刚、刘生、于福清、赵俊金、邱小口、史建民、孟飞韩旭。1范围
牛胚胎性别鉴定技术方法
PCR法
本标症规定了聚合酶链式反应(PCR)方法鉴定胚胎性别的操作方法本标准适用普通牛（Bosuurtr）胚胎性别整定。2规范性引用文件
NY/T1903-—2010
下列文件对于本义件的应用是必不可少的：凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于小文件：凡是不法日期的引用义件，其最新版本(包括所有的修改单)适用丁本文件。GA/T383法庭科学DNA实验室检验规范SN/T1119进门动物源性饲料巾牛羊源性成分检测方法PCR方法SN/T1193基因检验实验室技术要求3原理
从被检胚暗中取出部分纫跑，提取DVA，利用Y染色体上的特异列设计引物进行扩增和检测，根扩增结果鉴定性别。
4取样
4.1胚胎预处理
冷冻胚胎在家温下停留10，然后32℃温育20s，用肝胚胎清洗液将附若在肝胎周围的细胞与碎片彻底洗除，待用；新鲜胚胎直按用胚脸清洗液将附着在环阶周围的细胞与碎片御底除，待用。4.2胚胎细胞取样
4.2.1显微分制法
成用显微操作仪切开透明带，最叫4个~8个胚胎细胞。4.2.2徒手分割法
先用0.1%~~0.2%链霉蛋白酶软化透明带.在实体显微镜下，用切割针切割胚胎.取出4个~8个细施胚胎细胞：
5鉴定
5.1试剂和仪器设备
试剂和仪器签见附录A。
5.2鉴定过程
5.2.1DNA提取
5.2.1.1蛋白酶K消化法
将胚胎绑胞移人PCR管中，人2Coul,~500uL胚胎裂解液，55℃消化15min~30min,95℃~98%灭活蛋自酶K5min~.10min,10000×g离心30s~-45s，取上清液作为PCR反应模板。5.2.1.2加热释出法
将胚胎细胞移入PCR管中，加人200uL~590μut灭菌双蒸水，100℃煮沸10nin1000×g离心30s~-45$取上清液作为为PCR反应模板。1
NY/T1903—2010
5. 2. 1. 3液氮反复冻融法
将胚胎细胞移人PCR管中，加入2001~500μL火菌双蒸水，川液氮反复冻融几次，i0000×g离心 30 g-~45 s,取上清液作为 FCR反应模板。5.2.2目的基因片段PCR扩增
5.2.2. 1 引物制备
引物1序列（牛Y染色体蛋复序列引物)：引物IF5GAT,CAC.TAT,ACA,TAC,ACC,ACT-3：I物IR5-GCT.ATG,CTA.ACA,CAA,ATT,IG3引物2序列(牛特异性DNA序列的引物)：引物2F5G,AAG,CAA,AGA,ACC,CCG,CI3引物 2R'-TCG,TCA,GAA,ACO,GA,CAC,TG-3*将个成的物瞬时离心，加入火菌双蒸水，室温游懈3）min，分装，20%冷冻保存。其中，加人火菌超纯水的体积V(uL)，按式(I)计算：武：
MW-引物分子量;
V 33 X() X i06
DNA260Tm吸收的光密度。
5.2.2.2ICR反应体系
PCR反应体系泌表 1.
表 1 PCR 反应体系
分及浓度
icXuuffer
MgCl, (2h uunol/ L)
UNTPs(25 mrual/1)
引1(10 ptnol/,)
场 2(10 rmo./ pL)
DNA模饭
Tag NA 聚合酶GU/μt.)
5.2.2.3PCR反应条件
使用显
C. 9 μrL--1. 5 pμL
C. 9 ,μL---1. 2 μL
0. 15 μL--0. 75 ,μL
0. 15 μ1-~. 7n μ1.
3. 75 1~-\. 0 U
加盆15止
94C预变性min，然后进行10个~15个循坏的扩增反应，每个循环包括94℃变性20s~30s，52%~58℃退火305~45s，72℃聚个30%~~158；再进行20个~25个循坏的扩增反应，每个环包括94℃变性20830s,52%--58退火30s458，72℃聚合30s45s;72℃延伸10mi12℃保存。首先加入引物1，扩增10个15个话环后再加入引物2。5.2.3结果判定
将扩增产物电泳检测，产生141bp和216bp两条，判定该胎为摊性；产尘216bp条带，判定该腔胎为非性
5.2.4 实验对照
阳性对照为公牛样品，阴性对照为盘样品，空H刘照为抑等量双蒸水，2
结果表述
XXX坏胎的性别为烘性(或维性)：防污染措施
按 SN/T 1193,SN/T 1119和GA/T 383力法热行.NY/T1903—2010
NY/T 1903—2010
A.1试剂
A.1.1胚胎清洗液
附录A
[资料性附录]
试剂和仪器
含1mg/ml.聚2醇的杜氏磷酸盐缓冲液（PBS液）。A.1.2胚胎解液
含蛋凹K的1×PCR缓冲液(500mmol/LKCl,100mmol/LTris-IIClμH9.0,1%TritonX-100)(蓝白酶K现用现加)。
A.1.3电泳缓冲液
1XTris Z酸(TAE):0.04 rioi/LTris2酸.0.0lmol/LEDTA0.5XTrix-硼酸(TEE)：0.M5mol/LTris-硼酸.0.01mol/L.EDTA。A.1.4溴化乙锭溶液(EB10mg/ml.)川少员双蒸水溶解1溴化乙锭，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，定容牵100m，然后转移创棕色或铝箔包裹容器中，室温保存A. 1.5 6× 上样缓冲液
0.05%浪酚蓝，0.05%二甲米声F°.40%（W/V）熊沸溶波或9.05%澳蓝，0.03%二甲苯背FF30%甘油溶液wwW.bzxz.Net
4. 1. 6 蛋白酶 K(20 mg/ mL):分析纯A. 1. 7 Tan DNA 聚合酶
NTPs:dATP,dCTP、dGTP 和 dTIPDNA Marker
A.2仪器设备
A.2.1疑胶成像分析系统
A.2.2体视显微镜
A. 2.3 CR 扩增仪
A.2.4离心机
A.2.5涡旋震荡器
A.2.6可调移液器
A.2.7稳压稳流电泳仪
A.2.8水平电泳槽
A.2.9超纯水器
A.2.10高压灭菌器
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