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NY/T 1903-2010

基本信息

标准号: NY/T 1903-2010

中文名称:牛胚胎性别鉴定技术方法 PCR法

标准类别:农业行业标准(NY)

标准状态:现行

出版语种:简体中文

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相关标签: 胚胎 鉴定 技术 方法 PCR

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标准内容

ICS 65.020.30
中华人民共和国农业行业标准
NY/T1903-2010
牛胚胎性别鉴定技术方法
PCR法
Proccdures for sex identification of bovine embryos-PCR technigues2010-07-08 发布
2010-09-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标雅遵照GH/T1.1-2009给出的现则起草。本标准由中华人民共和国农业部畜牧业司提出.本标推由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TYC274)归11本标准起草单位:全国畜救总站。NY/T1903—2010
本标准主要起草人:正志刚、刘生、于福清、赵俊金、邱小口、史建民、孟飞韩旭。1范围
牛胚胎性别鉴定技术方法
PCR法
本标症规定了聚合酶链式反应(PCR)方法鉴定胚胎性别的操作方法本标准适用普通牛(Bosuurtr)胚胎性别整定。2规范性引用文件
NY/T1903-—2010
下列文件对于本义件的应用是必不可少的:凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于小文件:凡是不法日期的引用义件,其最新版本(包括所有的修改单)适用丁本文件。GA/T383法庭科学DNA实验室检验规范SN/T1119进门动物源性饲料巾牛羊源性成分检测方法PCR方法SN/T1193基因检验实验室技术要求3原理
从被检胚暗中取出部分纫跑,提取DVA,利用Y染色体上的特异列设计引物进行扩增和检测,根扩增结果鉴定性别。
4取样
4.1胚胎预处理
冷冻胚胎在家温下停留10,然后32℃温育20s,用肝胚胎清洗液将附若在肝胎周围的细胞与碎片彻底洗除,待用;新鲜胚胎直按用胚脸清洗液将附着在环阶周围的细胞与碎片御底除,待用。4.2胚胎细胞取样
4.2.1显微分制法
成用显微操作仪切开透明带,最叫4个~8个胚胎细胞。4.2.2徒手分割法
先用0.1%~~0.2%链霉蛋白酶软化透明带.在实体显微镜下,用切割针切割胚胎.取出4个~8个细施胚胎细胞:
5鉴定
5.1试剂和仪器设备
试剂和仪器签见附录A。
5.2鉴定过程
5.2.1DNA提取
5.2.1.1蛋白酶K消化法
将胚胎绑胞移人PCR管中,人2Coul,~500uL胚胎裂解液,55℃消化15min~30min,95℃~98%灭活蛋自酶K5min~.10min,10000×g离心30s~-45s,取上清液作为PCR反应模板。5.2.1.2加热释出法
将胚胎细胞移入PCR管中,加人200uL~590μut灭菌双蒸水,100℃煮沸10nin1000×g离心30s~-45$取上清液作为为PCR反应模板。1
NY/T1903—2010
5. 2. 1. 3液氮反复冻融法
将胚胎细胞移人PCR管中,加入2001~500μL火菌双蒸水,川液氮反复冻融几次,i0000×g离心 30 g-~45 s,取上清液作为 FCR反应模板。5.2.2目的基因片段PCR扩增
5.2.2. 1 引物制备
引物1序列(牛Y染色体蛋复序列引物):引物IF5GAT,CAC.TAT,ACA,TAC,ACC,ACT-3:I物IR5-GCT.ATG,CTA.ACA,CAA,ATT,IG3引物2序列(牛特异性DNA序列的引物):引物2F5G,AAG,CAA,AGA,ACC,CCG,CI3引物 2R'-TCG,TCA,GAA,ACO,GA,CAC,TG-3*将个成的物瞬时离心,加入火菌双蒸水,室温游懈3)min,分装,20%冷冻保存。其中,加人火菌超纯水的体积V(uL),按式(I)计算:武:Www.bzxZ.net
MW-引物分子量;
V 33 X() X i06
DNA260Tm吸收的光密度。
5.2.2.2ICR反应体系
PCR反应体系泌表 1.
表 1 PCR 反应体系
分及浓度
icXuuffer
MgCl, (2h uunol/ L)
UNTPs(25 mrual/1)
引1(10 ptnol/,)
场 2(10 rmo./ pL)
DNA模饭
Tag NA 聚合酶GU/μt.)
5.2.2.3PCR反应条件
使用显
C. 9 μrL--1. 5 pμL
C. 9 ,μL---1. 2 μL
0. 15 μL--0. 75 ,μL
0. 15 μ1-~. 7n μ1.
3. 75 1~-\. 0 U
加盆15止
94C预变性min,然后进行10个~15个循坏的扩增反应,每个循环包括94℃变性20s~30s,52%~58℃退火305~45s,72℃聚个30%~~158;再进行20个~25个循坏的扩增反应,每个环包括94℃变性20830s,52%--58退火30s458,72℃聚合30s45s;72℃延伸10mi12℃保存。首先加入引物1,扩增10个15个话环后再加入引物2。5.2.3结果判定
将扩增产物电泳检测,产生141bp和216bp两条,判定该胎为摊性;产尘216bp条带,判定该腔胎为非性
5.2.4 实验对照
阳性对照为公牛样品,阴性对照为盘样品,空H刘照为抑等量双蒸水,2
结果表述
XXX坏胎的性别为烘性(或维性):防污染措施
按 SN/T 1193,SN/T 1119和GA/T 383力法热行.NY/T1903—2010
NY/T 1903—2010
A.1试剂
A.1.1胚胎清洗液
附录A
[资料性附录]
试剂和仪器
含1mg/ml.聚2醇的杜氏磷酸盐缓冲液(PBS液)。A.1.2胚胎解液
含蛋凹K的1×PCR缓冲液(500mmol/LKCl,100mmol/LTris-IIClμH9.0,1%TritonX-100)(蓝白酶K现用现加)。
A.1.3电泳缓冲液
1XTris Z酸(TAE):0.04 rioi/LTris2酸.0.0lmol/LEDTA0.5XTrix-硼酸(TEE):0.M5mol/LTris-硼酸.0.01mol/L.EDTA。A.1.4溴化乙锭溶液(EB10mg/ml.)川少员双蒸水溶解1溴化乙锭,磁力搅拌数小时以确保其完全溶解,定容牵100m,然后转移创棕色或铝箔包裹容器中,室温保存A. 1.5 6× 上样缓冲液
0.05%浪酚蓝,0.05%二甲米声F°.40%(W/V)熊沸溶波或9.05%澳蓝,0.03%二甲苯背FF30%甘油溶液
4. 1. 6 蛋白酶 K(20 mg/ mL):分析纯A. 1. 7 Tan DNA 聚合酶
NTPs:dATP,dCTP、dGTP 和 dTIPDNA Marker
A.2仪器设备
A.2.1疑胶成像分析系统
A.2.2体视显微镜
A. 2.3 CR 扩增仪
A.2.4离心机
A.2.5涡旋震荡器
A.2.6可调移液器
A.2.7稳压稳流电泳仪
A.2.8水平电泳槽
A.2.9超纯水器
A.2.10高压灭菌器
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