NY/T 1951-2010
基本信息
标准号： NY/T 1951-2010
中文名称：蜜蜂幼虫腐臭病诊断技术规范
标准类别：农业行业标准(NY)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准简介
NY/T 1951-2010 蜜蜂幼虫腐臭病诊断技术规范
NY/T1951-2010
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标准内容
ICS 11.220
中华人民共和国农业行业标准
NY/T1951—2010
蜜蜂幼虫腐臭病诊断技术规范
Protocol of diagnosis for foulbrood disease2010-09-21发布
2010-12-01实施
中华人民共和国农业部
本标滩遵照GB/T1.12009给山的规则起卓。本标游出中华人民共和国农业部提出，言
本标推由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。本标准起草单位：中国农业科学院蜜蜂研究所。本标准士要起草人：周婷、王独、代平礼、段俊民、李秀玲、习青云、姜秋玲NY/T 1951--2010
1范围
蜜蜂幼虫腐臭病诊断技术规范
本标准规定了蜜蜂美洲幼虫腐臭病及蜜蜂欧洲幼业腐臭病的诊断方法本标准适用于密蜂美洲幼虫腐臭病及密蜂欧洲幼出腐臭病的诊断和检疫。2蜜蜂美洲幼虫腐臭病诊断方法
2.1原理
NY/T1951—2010
蜜蜂关洲幼虫腐臭病Amcricanfoulhmvoddiscase）是山幼虫沫孢杆菌（Paenibucilustaruaeler(teWhite)引起蜜蜂幼虫和蛹的急性和毁灭性细菌性病害：主要侵害西方蜜蜂2.2试剂，设备和材料
2.2.1材料和试剂
2.2. 1. 1无菌平-m
2.2.1.2载玻片。
2. 2. 1.3 试管(10 mL),
2.2.1.4微量移液器。
2.2. 1.5小离心管(1.5mL)。
2. 2. 1. 6 PCR管(20) μL)。
2.2.1.7胡萝卜酵厚培养基些，
2.2.1.8百醇培养基。
2.2.1.9酵母漫膏培养基。
2. 2. 1. 10
牛肉膏琼脂平板。
2.2. 1. 11
5环孔雀绿水溶液。
2. 2. 1. 12
0.5%沙黄水溶液。
2.2.1.13碱性关蓝（又称骆美临)染色液。2.2.1.142%石炭腋复红染液。
5%的醋酸。
2. 2. 1. 15
2. 2. 1. 16
无菌生理盐水。
2. 2. 1. 17
无菌蒸馏水．
2. 2. 1. 18
R物，
2. 2. 1. 19
Tay聚合酶。
2. 2. 1. 20
10XPCR缓冲液。
2.2. 1.21
2. 2. 1. 22
0.8%琼脂糖凝胶。bZxz.net
2. 2. 1. 23
TAE电泳绥冲液（地表7)。
NY/T 1951—2010
缀冲藏
TZ较(TAF)
表 1 TAE电泳缓冲液参数
使用液
IX :0. C4 1nol/L Tris Z段
3.001mo./L FTYTA
2.2.1.24琼脂糖凝胶利凝胶加样缓冲液。最贮存液（每升）
b0x,22 g Trs碱
57. 1 ml. 冰乙酸
100 mL 0. 5 rol/L EDIA(pH8. 0)0.8为琼脂糖凝胶配置：2.g琼脂糖，加入200mLTAE电泳缓冲液，加热溶解后，用TAE电泳缓冲液定容垒300mL.,咯冷后加人15uL澳化乙啶（F3>济液，混勾。样缓冲液配制见表2.
表2加样缓冲液配置
0.25元说酚嘴
40%(W/V)熊糖水辫液
2.2.2设备
2.2.2.1普通光学显微镜
2.2.2.2恒温培养箱。
2.2.2.3温水浴箱。
2.2.2.4高速离心机。
2.2.2.5PCR仪（热环仪）
2.2.2.6惊胎糖避胶电泳仪。
2.2.2.7紫外凝胶成像系统。
2.3方法及判定
2.3.1症状诊断法
幼虫的契房盖变潮湿、下翁，颜色发瞻并显汕光，大部分穿孔；封盖幼虫死亡，死广的蛹的曦常从腐烂虫户前端穿出，形如伸山的舌状，若揭开房盖，用根火柴朴播入虫休再拉出来，可拉山2ctI~3cm长的胶休状细丝。病死幼出的尸休大约一个月后干枯成片难以剥落的痴皮，贴在房壁土。2.3.2微生物学诊断法
2.3.2.1取备捡幼虫样品1只~-2只置于组织研磨器内，加1mL~2ml.灭菌生理盐水制成悬浮液。2.3.2.2将上述悬浮液（也可将悬浮激在80%水浴中10min，以杀死不形成芽孢的纫菌再接种）按种于胡蕊卜酵母琼脂（参见A.1)平板培养基或马铃薯培养基（参见A.2）酵母没膏（参见A3)培养基上。量十杭温培养籍中，在30%~32℃条件下培养24h--48h。2.3.2.3挑取单个可凝菌落，于上述培养条件下培养24h~48h。挑取纯培养后的菌落做涂片，进行孔雀绒、沙黄劳拖染色或右炭酸复红和碱性美蓝染色。2.3.2.4孔绿沙黄芽泡染色法：将2.3.2.3制备的涂片经火焰固定后，加5%孔雀绿水溶液（参见B.1)于载玻片上，加热汽腾3min~-min，用蒸留水剂选后，加0.5%沙莫水溶液（参见B.2)复染1nin蒸馏水冲洗.用滤纸吸干，在普通光学微镜(1000×）下检查。结果判定：如发现镜下观察划的隔休显蓝色，芽孢旱红色，即可初步判定非欧洲幼重魔病病原引起的感梁。但进一步诊断还需进行生化诊断法。2.3.2.5石炭峻复红和碱性美蓝染色法。将上述制备的涂片经火焰固定片.加稀释石炭酸复红液（参见B.3)于载玻片上，加热汽腾2min~5mim，用蒸馅水冲洗后，川5%酷酸褪色，率淡红色为让（约10s），2
NY/T1951--2010
以骆氏关蓝液（参见B.4）复染0.5mi，用蒸馏水冲洗，吸下或烘T，布普通光学显微镜（1000×）下检杏。
结果判定：如发现镜下观察到的菌体呈蓝色，芽孢呈红色，即可初步判定非欧洲幼出腐泉病病原起的感染。但进-·步诊断还需逊行牛化诊断法，2.3.3生化诊断法
美洲幼虫腐见病芽孢什菌能分解葡萄糖、半乳糖、果糖，产酸不产气，不分解乳糖、熊糖、甘露醇、卫矛醇；不水解淀粉；不产生靛法质，缓慢液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸垫，2.3.4牛乳诊断法
取新鲜奶2mL~3ml.置试管中，同时加人被检的样品或经纯化的菌落少许，充分湿匀：置于恒温培养箱中，在30℃~32℃条件下培养1h2h。结果判定：若发现牛奶发生凝集，随后又发生水解的现象，为牛乳实验阳性。结合症状和微生物学诊断，结果即可判定被检幼虫样品为美洲动虫离臭病。为进一步确诊，川参考PCR诊断法。2.3.5PCR诊断法
2.3.5.1DNA模版制备
取两只被俭的幼业，罩于小离心管中，加人1InL无菌蒸增水后充分滤勾，制成悬浮被。上述尽浮液100ul.，加人900ul.光菌蒸馏水稀释.混勾后，取100，稀释的悬浮液，95℃水济15nim，在5000I/min条件下离心5min，即成为LNA模版，用于PCR反应也可先将被检幼出制成悬浮液用胡萝卜酵母培养基行分离路养，再将可疑菌落在上述培养基上进行纯培养，培养条件：37%，3d～4d；利用显微镜1500倍进行镜检，当观察到人量杆状细菊时，用1ml灭菌水将菌片悬浮，感浮液浓度约为1.0×10clu/mL，将菌激在1000g，离心5min.将收集的菌液用灭菌纯水洗涤一次，再用100ul.火菌纯水悬浮：将上述菌液进行水落处，95℃15min.在10000g，离心2min,取10μL上清液作为PCR反应的模版DNA。2.3.5.2PCR反应条件
30CR反应体系：50mol正尚和反向引物（引物序列见1)，脱氧核苷二磷酸混合物（各2.5mnol/L),5L的10xPCRBurfer(Mg2+Plus)及1.5U的Tan聚合酶表3引物序列的信息
预变性
30个循环
5'-CTT GIY TTT CTTT CGG GAG AXI CCA 36'- TCT TAG AGT GU CAC LIC TGCT - 3'表4检测美洲幼虫腐臭病PCR反应条件95
PCR产物人小
110%hp
2.3.5.3用0.7%琼脂糖凝胶电泳及溴化乙锭染色初步测定PCR产物片般的大小取PCR反应后的样本10L，浓度0.8%的琼脂糖凝胶，见上2.2、1.23和2.2.1.24.电压100V，TAE电泳缓冲液进行电泳检验，用案外凝胶成像系统进行观察。结果别定：在阴性对照无条带，阳性对照在1106bp有清晰条带时，如被测样品在1106bp有清晰条带（图1）,则可判定样品为PCI阳性。3
NY/T 1951-2010
道1空回对照
2测样站1
泳道3:检测样品2
泳道：
3欧洲幼虫腐臭病诊断方法
3.1原理
1000bp
泳道 F:1c0 5p ladder Marker
图1检测样品PCR产物电泳结果
蜜欧洲幼虫腐负病（Eurpeanfoulbrooddiscasce）足rl蜂房蜜蜂球菌（Mclissococcuspluton）引起的蜜摔幼出的种细菌性传染病，主要径害东方蜜峰，3.2试剂、设备和材料
3.2.1试剂和材料
3.2.1.1无菌平血：
3.2.1.2载玻片，
3.2.1.3试管（10mL)。
3.2.1.4微量移液器。
3. 2. 1. 5 小离心管(1. 3 mL)。3.2. 1. 6PCR 管(20) μI).
3.2.1.72%石腹复红溶液。碱性复红4g，溶丁95%乙醇100ml中，再取此液10m，加入5%石炭陵水溶液90m.混勾即。
3.2. 1. 8 无菌牛盐水。
3.2.1.9牛肉膏惊脂平板。
3.2.1.10无菌蒸馅水。
3. 2. 1. 11 PCR 引物。
3. 2. 1. 12
Tan 聚合酶。
3. 2. 1. 13
8XPCR缓冲液。
3. 2. 1. 14dNTP.
3.2.1.150.8%琼脂糖凝胶
6TAE电泳缓冲液，见上2.2.1.23。3.2.117凝胶加样缓冲液，见2.2、1.24。3.2.2设备
3.2.2.1普通光学品微镜
3.2.2.2培养箱。
3.2.2.3恒温水浴箱.
3.2.2.4商速离心机。
3.2.2.5PCR仪（热循坏仪）。
3.2.2.6琼脂糖凝胶电泳仪。
3.2.2.7紫外凝胶成像系统。
3.3方法与判定
3.3.1症状诊断
NY/T 195j--2010
该病通常使2～4d未封盖幼虫死亡。同时，患病幼虫又可随的被工蜂清除，形成卵、幼出，穿房相间的“蒲花了肿”。临床上，发现死亡幼虫呈黄白或暗褐色，并有酸臭气味，尤黏性，未腐烂幼虫可透过表皮清晰见到皮下气管系统，即可疑为欧洲幼虫腐兒病。3.3.2微生物学诊断法
3.3.2.1取备检幼虫样品1只～2只罩于纠织研磨幂内，加1L~2mL火菌理盐水制成悬浮液。3.3.2.2用接种环取上述忌浮激.以划线法接种于牛肉育谅脂平板（参见A1)，置于5%C培养箱中，在35℃37℃条件下24h~8h
3.3.2.3挑取单个可菌落，接种于牛肉育琼脂平板，置于5%心)培养箱中，在35℃～37℃条件下纯培养24h~~48h
3.3.2.4经过分离纯化的菌落，即可用接种坏挑取菌落，放在干净的载玻片上加1滴2滴牛理盐水，涂勺后风下或干燥。
3.3.2.5用2%不炭酸复红溶液染色1.5min~2min，水洗，用滤纸吸干。在普通光学显微镜下(100×~1500×）检含。
结果判定：发现0.5m×10um大小成单个或成串或头尾相接成对或成短链状或成簇状排列的短披计形球菌时，可初步判定样品受蜜择欧洲动虫腐觉病病原感染。3.3.3PCR诊断法
3.3.3.1DNA模版制备
取两只被检的幼虫，置」小离心管巾，加人1mL无菌蒸馏水后充分混勾，制成悬浮液。取上述悬浮液100l加入900uL无菌蒸罐水烯释。混匀后，身取100μl.稀释的悬浮液，95℃水浴15min，在5000r/min条件下离心5rin，即成为DNA模版，用于PCR反应：3.3. 3.2PCR 反应条件
ICR反成引物根据蜂房蜜蜂球菌15SrRNA基因片段设计，灵敏度高，特异性强。其序列如下：MPI8SF5＇GAAGAGGAGTTAAAAGGCGC 3'MPI16SR5'-TTATCTCAAGGXTTCAAAGG-350LPCR反应体系510XPCR缓冲液、1.251:Tag聚合酶两引物各50pmol、200jumol/L.CVTP及1ul.制备的TNA模版（l.无菌蒸馏水做阴性对照，1uI.已知患病幼出提取物为阳性对照）：表5检测欧洲动虫腐臭病PCR反应条件预变性：
39循环：
延神：
3.3.3.3取PCR反应店的样本10ul.淤度0.8必的琼胎糖凝胶，电乐100V,TAE中泳缓冲液，行电泳俭验，川紫外凝胶成像系统进行观察。绪果判定：在阴性对照光条，阳性对照在82p有清晰条费时，则可到定为欧洲幼出滴臭病PCR阴性，
NY/T 1951—2010
A1胡萝卜酵母琼脂培养基
附录A
（资料性附录）
培养基的制备
蕨白陈10g，无水磷酸氢二钾0.5g，琼胎3%，胡尊卜没出液200mL（将100g洗净的胡要下磨碎，加人250mI.水，静置3Cmin，过滤成，酵母浸山液3g蒸馏水1000mL，pH6.8。将上述多种成分加热溶解（胡萝下没出液在溶解后加人滤寸），在0.105Mla的压力下，高温求菌20minA.2马铃薯培养基
将去皮马铃薯200g切成片，加水1000mL.煮沸30min~40mi1过滤，将20g右旋葡需铺和20g琼脂趁热加人溶化，调节pH至7.0,在0.105MPa的压力下：高温灭菌15min..A.3酵母浸离培养基
酵母没山液」g.葡萄糖1无水磷酸氢二钟1.36g，琼脂2蒸馏水100mIpTI6.6，将以上各种成分混合溶解，在0.068MPa的压力下.高温火菌20 rin。A.4牛肉琼脂平板
牛肉齐1g强向陈1：鼠化钠0.5g，惊脂2g蒸水100mlpH7.0,将上述各种成分合：加热溶解,衣 0.105 MPil的压力下,灭菌 15 min5
B.15%孔鲨绿水溶液
附录B
(资料性附录）
染色液的制备
NY/T 1951--2010
取5g孔笨绿，先将孔雀绿研细.加适量95%酒精溶液溶解，加蒸馏水定容至100mL..R.20.5%沙黄水溶液
取0.5g沙黄，先将沙黄研细，加适量95%酒精溶液落解，再加蒸馏水定穿至100mL；B.32%石炭酸复红染液
取3%复红酒精溶液10ml，加入5%石炭酸水液90mL，融合过滤，然后小用蒸馅水作10倍稀B.4碱性美蓝（又称骆氏美蓝)染色液美蓝绝和酒精溶液30ml.灿人0.01%氢氧化钾水溶液100m，混合即成，
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中华人民共和国农业行业标准
NY/T1951—2010
蜜蜂幼虫腐臭病诊断技术规范
Protocol of diagnosis for foulbrood disease2010-09-21发布
2010-12-01实施
中华人民共和国农业部
本标滩遵照GB/T1.12009给山的规则起卓。本标游出中华人民共和国农业部提出，言
本标推由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。本标准起草单位：中国农业科学院蜜蜂研究所。本标准士要起草人：周婷、王独、代平礼、段俊民、李秀玲、习青云、姜秋玲NY/T 1951--2010
1范围
蜜蜂幼虫腐臭病诊断技术规范
本标准规定了蜜蜂美洲幼虫腐臭病及蜜蜂欧洲幼业腐臭病的诊断方法本标准适用于密蜂美洲幼虫腐臭病及密蜂欧洲幼出腐臭病的诊断和检疫。2蜜蜂美洲幼虫腐臭病诊断方法
2.1原理
NY/T1951—2010
蜜蜂关洲幼虫腐臭病Amcricanfoulhmvoddiscase）是山幼虫沫孢杆菌（Paenibucilustaruaeler(teWhite)引起蜜蜂幼虫和蛹的急性和毁灭性细菌性病害：主要侵害西方蜜蜂2.2试剂，设备和材料
2.2.1材料和试剂
2.2. 1. 1无菌平-m
2.2.1.2载玻片。
2. 2. 1.3 试管(10 mL),
2.2.1.4微量移液器。
2.2. 1.5小离心管(1.5mL)。
2. 2. 1. 6 PCR管(20) μL)。
2.2.1.7胡萝卜酵厚培养基些，
2.2.1.8百醇培养基。
2.2.1.9酵母漫膏培养基。
2. 2. 1. 10
牛肉膏琼脂平板。
2.2. 1. 11
5环孔雀绿水溶液。
2. 2. 1. 12
0.5%沙黄水溶液。
2.2.1.13碱性关蓝（又称骆美临)染色液。2.2.1.142%石炭腋复红染液。
5%的醋酸。
2. 2. 1. 15
2. 2. 1. 16
无菌生理盐水。
2. 2. 1. 17
无菌蒸馏水．
2. 2. 1. 18
R物，
2. 2. 1. 19
Tay聚合酶。
2. 2. 1. 20
10XPCR缓冲液。
2.2. 1.21
2. 2. 1. 22
0.8%琼脂糖凝胶。bZxz.net
2. 2. 1. 23
TAE电泳绥冲液（地表7)。
NY/T 1951—2010
缀冲藏
TZ较(TAF)
表 1 TAE电泳缓冲液参数
使用液
IX :0. C4 1nol/L Tris Z段
3.001mo./L FTYTA
2.2.1.24琼脂糖凝胶利凝胶加样缓冲液。最贮存液（每升）
b0x,22 g Trs碱
57. 1 ml. 冰乙酸
100 mL 0. 5 rol/L EDIA(pH8. 0)0.8为琼脂糖凝胶配置：2.g琼脂糖，加入200mLTAE电泳缓冲液，加热溶解后，用TAE电泳缓冲液定容垒300mL.,咯冷后加人15uL澳化乙啶（F3>济液，混勾。样缓冲液配制见表2.
表2加样缓冲液配置
0.25元说酚嘴
40%(W/V)熊糖水辫液
2.2.2设备
2.2.2.1普通光学显微镜
2.2.2.2恒温培养箱。
2.2.2.3温水浴箱。
2.2.2.4高速离心机。
2.2.2.5PCR仪（热环仪）
2.2.2.6惊胎糖避胶电泳仪。
2.2.2.7紫外凝胶成像系统。
2.3方法及判定
2.3.1症状诊断法
幼虫的契房盖变潮湿、下翁，颜色发瞻并显汕光，大部分穿孔；封盖幼虫死亡，死广的蛹的曦常从腐烂虫户前端穿出，形如伸山的舌状，若揭开房盖，用根火柴朴播入虫休再拉出来，可拉山2ctI~3cm长的胶休状细丝。病死幼出的尸休大约一个月后干枯成片难以剥落的痴皮，贴在房壁土。2.3.2微生物学诊断法
2.3.2.1取备捡幼虫样品1只~-2只置于组织研磨器内，加1mL~2ml.灭菌生理盐水制成悬浮液。2.3.2.2将上述悬浮液（也可将悬浮激在80%水浴中10min，以杀死不形成芽孢的纫菌再接种）按种于胡蕊卜酵母琼脂（参见A.1)平板培养基或马铃薯培养基（参见A.2）酵母没膏（参见A3)培养基上。量十杭温培养籍中，在30%~32℃条件下培养24h--48h。2.3.2.3挑取单个可凝菌落，于上述培养条件下培养24h~48h。挑取纯培养后的菌落做涂片，进行孔雀绒、沙黄劳拖染色或右炭酸复红和碱性美蓝染色。2.3.2.4孔绿沙黄芽泡染色法：将2.3.2.3制备的涂片经火焰固定后，加5%孔雀绿水溶液（参见B.1)于载玻片上，加热汽腾3min~-min，用蒸留水剂选后，加0.5%沙莫水溶液（参见B.2)复染1nin蒸馏水冲洗.用滤纸吸干，在普通光学微镜(1000×）下检查。结果判定：如发现镜下观察划的隔休显蓝色，芽孢旱红色，即可初步判定非欧洲幼重魔病病原引起的感梁。但进一步诊断还需进行生化诊断法。2.3.2.5石炭峻复红和碱性美蓝染色法。将上述制备的涂片经火焰固定片.加稀释石炭酸复红液（参见B.3)于载玻片上，加热汽腾2min~5mim，用蒸馅水冲洗后，川5%酷酸褪色，率淡红色为让（约10s），2
NY/T1951--2010
以骆氏关蓝液（参见B.4）复染0.5mi，用蒸馏水冲洗，吸下或烘T，布普通光学显微镜（1000×）下检杏。
结果判定：如发现镜下观察到的菌体呈蓝色，芽孢呈红色，即可初步判定非欧洲幼出腐泉病病原起的感染。但进-·步诊断还需逊行牛化诊断法，2.3.3生化诊断法
美洲幼虫腐见病芽孢什菌能分解葡萄糖、半乳糖、果糖，产酸不产气，不分解乳糖、熊糖、甘露醇、卫矛醇；不水解淀粉；不产生靛法质，缓慢液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸垫，2.3.4牛乳诊断法
取新鲜奶2mL~3ml.置试管中，同时加人被检的样品或经纯化的菌落少许，充分湿匀：置于恒温培养箱中，在30℃~32℃条件下培养1h2h。结果判定：若发现牛奶发生凝集，随后又发生水解的现象，为牛乳实验阳性。结合症状和微生物学诊断，结果即可判定被检幼虫样品为美洲动虫离臭病。为进一步确诊，川参考PCR诊断法。2.3.5PCR诊断法
2.3.5.1DNA模版制备
取两只被俭的幼业，罩于小离心管中，加人1InL无菌蒸增水后充分滤勾，制成悬浮被。上述尽浮液100ul.，加人900ul.光菌蒸馏水稀释.混勾后，取100，稀释的悬浮液，95℃水济15nim，在5000I/min条件下离心5min，即成为LNA模版，用于PCR反应也可先将被检幼出制成悬浮液用胡萝卜酵母培养基行分离路养，再将可疑菌落在上述培养基上进行纯培养，培养条件：37%，3d～4d；利用显微镜1500倍进行镜检，当观察到人量杆状细菊时，用1ml灭菌水将菌片悬浮，感浮液浓度约为1.0×10clu/mL，将菌激在1000g，离心5min.将收集的菌液用灭菌纯水洗涤一次，再用100ul.火菌纯水悬浮：将上述菌液进行水落处，95℃15min.在10000g，离心2min,取10μL上清液作为PCR反应的模版DNA。2.3.5.2PCR反应条件
30CR反应体系：50mol正尚和反向引物（引物序列见1)，脱氧核苷二磷酸混合物（各2.5mnol/L),5L的10xPCRBurfer(Mg2+Plus)及1.5U的Tan聚合酶表3引物序列的信息
预变性
30个循环
5'-CTT GIY TTT CTTT CGG GAG AXI CCA 36'- TCT TAG AGT GU CAC LIC TGCT - 3'表4检测美洲幼虫腐臭病PCR反应条件95
PCR产物人小
110%hp
2.3.5.3用0.7%琼脂糖凝胶电泳及溴化乙锭染色初步测定PCR产物片般的大小取PCR反应后的样本10L，浓度0.8%的琼脂糖凝胶，见上2.2、1.23和2.2.1.24.电压100V，TAE电泳缓冲液进行电泳检验，用案外凝胶成像系统进行观察。结果别定：在阴性对照无条带，阳性对照在1106bp有清晰条带时，如被测样品在1106bp有清晰条带（图1）,则可判定样品为PCI阳性。3
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道1空回对照
2测样站1
泳道3:检测样品2
泳道：
3欧洲幼虫腐臭病诊断方法
3.1原理
1000bp
泳道 F:1c0 5p ladder Marker
图1检测样品PCR产物电泳结果
蜜欧洲幼虫腐负病（Eurpeanfoulbrooddiscasce）足rl蜂房蜜蜂球菌（Mclissococcuspluton）引起的蜜摔幼出的种细菌性传染病，主要径害东方蜜峰，3.2试剂、设备和材料
3.2.1试剂和材料
3.2.1.1无菌平血：
3.2.1.2载玻片，
3.2.1.3试管（10mL)。
3.2.1.4微量移液器。
3. 2. 1. 5 小离心管(1. 3 mL)。3.2. 1. 6PCR 管(20) μI).
3.2.1.72%石腹复红溶液。碱性复红4g，溶丁95%乙醇100ml中，再取此液10m，加入5%石炭陵水溶液90m.混勾即。
3.2. 1. 8 无菌牛盐水。
3.2.1.9牛肉膏惊脂平板。
3.2.1.10无菌蒸馅水。
3. 2. 1. 11 PCR 引物。
3. 2. 1. 12
Tan 聚合酶。
3. 2. 1. 13
8XPCR缓冲液。
3. 2. 1. 14dNTP.
3.2.1.150.8%琼脂糖凝胶
6TAE电泳缓冲液，见上2.2.1.23。3.2.117凝胶加样缓冲液，见2.2、1.24。3.2.2设备
3.2.2.1普通光学品微镜
3.2.2.2培养箱。
3.2.2.3恒温水浴箱.
3.2.2.4商速离心机。
3.2.2.5PCR仪（热循坏仪）。
3.2.2.6琼脂糖凝胶电泳仪。
3.2.2.7紫外凝胶成像系统。
3.3方法与判定
3.3.1症状诊断
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该病通常使2～4d未封盖幼虫死亡。同时，患病幼虫又可随的被工蜂清除，形成卵、幼出，穿房相间的“蒲花了肿”。临床上，发现死亡幼虫呈黄白或暗褐色，并有酸臭气味，尤黏性，未腐烂幼虫可透过表皮清晰见到皮下气管系统，即可疑为欧洲幼虫腐兒病。3.3.2微生物学诊断法
3.3.2.1取备检幼虫样品1只～2只罩于纠织研磨幂内，加1L~2mL火菌理盐水制成悬浮液。3.3.2.2用接种环取上述忌浮激.以划线法接种于牛肉育谅脂平板（参见A1)，置于5%C培养箱中，在35℃37℃条件下24h~8h
3.3.2.3挑取单个可菌落，接种于牛肉育琼脂平板，置于5%心)培养箱中，在35℃～37℃条件下纯培养24h~~48h
3.3.2.4经过分离纯化的菌落，即可用接种坏挑取菌落，放在干净的载玻片上加1滴2滴牛理盐水，涂勺后风下或干燥。
3.3.2.5用2%不炭酸复红溶液染色1.5min~2min，水洗，用滤纸吸干。在普通光学显微镜下(100×~1500×）检含。
结果判定：发现0.5m×10um大小成单个或成串或头尾相接成对或成短链状或成簇状排列的短披计形球菌时，可初步判定样品受蜜择欧洲动虫腐觉病病原感染。3.3.3PCR诊断法
3.3.3.1DNA模版制备
取两只被检的幼虫，置」小离心管巾，加人1mL无菌蒸馏水后充分混勾，制成悬浮液。取上述悬浮液100l加入900uL无菌蒸罐水烯释。混匀后，身取100μl.稀释的悬浮液，95℃水浴15min，在5000r/min条件下离心5rin，即成为DNA模版，用于PCR反应：3.3. 3.2PCR 反应条件
ICR反成引物根据蜂房蜜蜂球菌15SrRNA基因片段设计，灵敏度高，特异性强。其序列如下：MPI8SF5＇GAAGAGGAGTTAAAAGGCGC 3'MPI16SR5'-TTATCTCAAGGXTTCAAAGG-350LPCR反应体系510XPCR缓冲液、1.251:Tag聚合酶两引物各50pmol、200jumol/L.CVTP及1ul.制备的TNA模版（l.无菌蒸馏水做阴性对照，1uI.已知患病幼出提取物为阳性对照）：表5检测欧洲动虫腐臭病PCR反应条件预变性：
39循环：
延神：
3.3.3.3取PCR反应店的样本10ul.淤度0.8必的琼胎糖凝胶，电乐100V,TAE中泳缓冲液，行电泳俭验，川紫外凝胶成像系统进行观察。绪果判定：在阴性对照光条，阳性对照在82p有清晰条费时，则可到定为欧洲幼出滴臭病PCR阴性，
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A1胡萝卜酵母琼脂培养基
附录A
（资料性附录）
培养基的制备
蕨白陈10g，无水磷酸氢二钾0.5g，琼胎3%，胡尊卜没出液200mL（将100g洗净的胡要下磨碎，加人250mI.水，静置3Cmin，过滤成，酵母浸山液3g蒸馏水1000mL，pH6.8。将上述多种成分加热溶解（胡萝下没出液在溶解后加人滤寸），在0.105Mla的压力下，高温求菌20minA.2马铃薯培养基
将去皮马铃薯200g切成片，加水1000mL.煮沸30min~40mi1过滤，将20g右旋葡需铺和20g琼脂趁热加人溶化，调节pH至7.0,在0.105MPa的压力下：高温灭菌15min..A.3酵母浸离培养基
酵母没山液」g.葡萄糖1无水磷酸氢二钟1.36g，琼脂2蒸馏水100mIpTI6.6，将以上各种成分混合溶解，在0.068MPa的压力下.高温火菌20 rin。A.4牛肉琼脂平板
牛肉齐1g强向陈1：鼠化钠0.5g，惊脂2g蒸水100mlpH7.0,将上述各种成分合：加热溶解,衣 0.105 MPil的压力下,灭菌 15 min5
B.15%孔鲨绿水溶液
附录B
(资料性附录）
染色液的制备
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取5g孔笨绿，先将孔雀绿研细.加适量95%酒精溶液溶解，加蒸馏水定容至100mL..R.20.5%沙黄水溶液
取0.5g沙黄，先将沙黄研细，加适量95%酒精溶液落解，再加蒸馏水定穿至100mL；B.32%石炭酸复红染液
取3%复红酒精溶液10ml，加入5%石炭酸水液90mL，融合过滤，然后小用蒸馅水作10倍稀B.4碱性美蓝（又称骆氏美蓝)染色液美蓝绝和酒精溶液30ml.灿人0.01%氢氧化钾水溶液100m，混合即成，
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