NY/T 1962-2010
基本信息
标准号： NY/T 1962-2010
中文名称：马铃薯纺锤块茎类病毒检测
标准类别：农业行业标准(NY)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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标准简介
NY/T 1962-2010 马铃薯纺锤块茎类病毒检测
NY/T1962-2010
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标准内容
ICS 67.080
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 1962—2010
马铃薯纺锤块茎类病毒检测
Detcction of potato spindle tuber viroid(PSTVd)2010-12-23发布
2011-02-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准遵照GB/T1.12009给出的规则起草、木标准由中华人民共和国农业部种植业管翊司提山并1.本标准起草单位：农业部脱毒马普种警质量监替检验测试中心(哈尔滨)。NY/T1962—2010
不标滩主要起草人：吕典伙、刘尚成、邱彩玲、宿飞飞、土绍、李勇、于德才、张打、工文重、下业湖、范国权，李学湛.
1范围
马铃薯纺锤块茎类病毒检测
本标准规定了马铃善纺链块茎类病毒（PSTVa）的检测方汰。NY/T1962—2010
本标活用于马铃薯种薯、商品薯、试管苗及其根、茎、叶不同部位组织中的马铃薯纺锤块茎炎病毒的检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注口期的版本适用于本文件：凡是不注开期的引用文件，儿最新版本（包所右的修收单适用丁本这件。B/T6682分析实验案水规格和试验方法方法一聚合酶链式反应
3原理
类病毒是没有外壳蛋白,襟露的、低分子叫合环状 RNA分子,RVA分子大小在 246 nt-40I nt 之闻：马铃薯纺锤块莘类病毒(PSTVd>的序列在 3G m ~-360 m之间。根据 PSTVd序列设特异性物，进衍扩塔，扩增片段大小为359bp左右。4试剂与材料
以下所用试剂,除特别注明者外均为分析试剂,水为符合 GB/T 6682 中规定的一级水。4.1然甲烷。
4.2M-MLV反转录酶（200/L）
4.3RNA酶抑制剂(40u/μI)。
4.4TagNA聚个酶(5u/μt)
4.5焦候液二乙酯(DEPC)处理的水。在100 mL水中,加人焦碳酸二乙酯(DEPC)50 μL.室源过夜，121 ℃高压灭20 min,分到1.5mL DEPC处理过的微民管中。
4.63mol/L乙酸钠溶液（pH5.2)
称取2.酸钠-3H,0 24.6g,加水80 imL磷解.用冰2.酸调 pH至5.2,定容至100 nL。4.7水他和(pH 4.0)。
4.8溴化乙锭浴液（19m/mL）。
称取漠化乙锭200Ig?加水溶解，定容至20tmL4.91mol/L三羟基甲基氨基甲烷盐(fris-HCl)溶液（pH8.0)。称取 Tris碱121. 1 g.辫解小800ml.水中,用浓盐酸调 pH至8.,圳1水定容垒 1000 mL,121℃高压灭菌20min
4.10RVA提取缓划液。
称坡Tris碱12.12g，氯化钠5.88g，乙二胺四乙暖二钠3.75g.加水至90cmL，溶解，用浓盐酸调NY/T1962—201C
pIT至99.5，加水定容至1000mL，121℃高压火菌20min，4.110.5mol/L乙二铵四乙酸__钠溶液（pll8.0)称墩乙一铵酸二钢186.1g，溶于700mL水中，氢氧化调pTI8.0加水定容垒1000Iril。
4.125×1ris-能酸(TBE)电泳绥冲液。称1ris碱27，硼酸13.75只，量取\.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（.11)10mI，加灭菊双蒸水 400mL浴懈,定容至 500 mL
4.131×Tris硼酸(TBE)电泳缓冲液，量取5XTris-硼酸（TBE)电泳缓冲液(4.12)200mL,加水定容举1.000ml，4.14期样缓冲液。
分别称表聚虑糖25g.酚蓝0.1g二甲苯睛9.1g.加水至190mL4.155×反转录反应缓冲液。
量取1mol/T.三羟甲基蕴基甲烷盐液(Tris-HCl)溶液（4.9)5mL.0.559g氯化钾，0.029g氯化镁,0.154g二硫苏糖醇(DYTI).水定容室100 mlL.4.1610mmol/L的四种脱氨核核并酸(dATP、cCTP、dGTP、dT)混合溶液。4.1710XPCR绥冲液。
称取氯化钾3.73g.氯化镁（MgC·6H.O)0.30g，溶于70mL水中.加人」mol/二羟基甲氮基甲烷盐暖（Tris-1KCI)溶液（1.9)10mL,加水至100mL，121℃高压灭菌20min4.18TE缓冲液
量取11no1/L三羟H甲基氨基甲烷一盐酸(TrisITCI)溶液(4.9)10mL，0.5rel/I.乙二铵四乙酸二钠落液（4.11)2mL加入水定容至1000mL121℃高压灭菌20min4.19物。
PG:&'GGA TCC CTG AAG CGC I: 'ICC GAG CCG ?PH:5' CCCGGK AAA CT GGA GCG AAC TGG 预期扩增片段为359bp左右。
4.20学物缓冲液。
用TF缓冲液（4.18)分别将上述引物稀释到20umo1/L。4.21100bpDNA分子萱标准物
5仪器
5. 1 ICR仪，
5.2台式低温高速离心机（可以控制在4℃：下进行离心）。5.3中泳仪、水平电泳槽
5.4紫外凝胶成像仪。
5.5微量移液器(0.5μL～10μ,10μ100 L20μL-~200μ100μL1000μL)5.6 水浴锅、灭削锅等。
6分析步骤
设立阳性对照和阴性对照。在以下实验过程中，要设立阴阳性对照.即标准的即性样品和阴性样品要同待测样品一同进行如下操作.6.1样品RNA的提取
6.1.1RNA的抽提
NY/T1962—2010
称取0.5名样品，放于火菌冷冻的小研钵中,分别加人1mI.RNA提取缓冲（!.10),1ml.不饱和酚(4. 7)和 1 mL 二氯甲烷(4. ]).充分研磨后倒人 1. 5 ml 离心管中,于 4℃ 下 10 000 r/ min 离心15min,川移液器小心将上层水相慈入另一离心管中。6.1.2RNA的沉淀
在RA4抽提液中(6.1.1),加人3倍体积无水冷乙醇，1/10) 休积内3 mo1/1.乙酸钠荠（4.6),润匀，-20%沉淀1.5h以上。
6.1.3RNA的溶解
取山冷冻保存的RNA沉淀6.1.2)，于1℃下10000r/mit离心15mi，弃掉上清，用1mL70%之情清洗沉淀，然后离心，再用吸头衡底吸弃遗留在管中的上清液，在门然条件下干燥至核酸沉淀变成口色或透明状态，将核酸沉淀游于30 pI焦碳酸二乙(DE1\C)处理的水(4.5)中。一20℃贮存，备川。注：或者迅择市售阅品化RN4提取试剂盒·光收RNA的好取。6.2RT-PCR反应(二步法)
将待测样品的RNA溶解液（6.1.3).引物缓冲液（4.20)，四种脱氧核糖核芦峻泥合溶液（4.1G)，5×反转录反应缀冲液（4.15)在冰上溶解。6.2.1反转录第一链合成
在200μL薄髋 PCR管中依次加人引物 Pe(4.19)0.6 μL,待测释品 RNA溶解液(6.1.3)1μE-,10mmal/I.的四种脱氧该糖核酸混合溶液（4.16)1μL无菌双蒸水9.4pL，轻轻混句，将该反应管在65℃水浴中加热5min.然后浴5mi,以4000 r/min离心10。人5×反转录反应缓冲(4.15）4,0.1mmol/1.F2μl,RNA酶抑制剂(40u/)(4.3)1μ,轻轻混勾,42℃孵育2min再加人1L M MLV反转录酶(200 u/ uL)(4. 2),2℃孵脊 50 min,然启在 70℃下失活 15 min6.2.2聚合酶链式反应
另取-个290 μL辨磅 PCR管.依次加人 10×PCR缓冲液(. 17)5 μI25 mmol/T. MgCl 3 μl..iCmmnl/L.川种脱氧核辨核吾酸混合溶液(4.16)luL,物(Pc和Ph)(4,19)各1mL,TaqDNA聚合酶(5u/μ)(4.4)0.5ml,cLNA中第一链合成产物（6.2.1)2μL.灭菌双蒸水36μ,轻轻混食，恶加人约20)L石蜡油(有热量设备的PCR仪可以不石蜡汕），000T/min离心10后，将PCR管摘人YR仪中。94℃2 mi;进行 30次扩增反应循环(94℃:60 s.55C 60 s,72C 60 s);然后 72%:10min:山 PCR管，对反应产物进行电泳检测或在1下保存。注：6.2步骤达可以按照市售商业化一步R7-PCR试剂盒说明书进行操作。6.3PCR产物的电泳检测
6.3.11.0%琼脂糖凝胶板的制备
称取1,0g琼脂糖,加人1×Tris-绷酸(TTF)电缓冲液(4.3)定容至100 mI,在微波炉卵热至琼脂糖融化，待济液冷却至50℃--60℃时，加溴化乙链溶滋（4.8)5{L，摇勺，倒人电泳檀中，凝固片取小梳子，爸用。
将 20 μI.PCR产物与 2) μL.样缓冲液(1.11)滤合,取混合液10 μL 加人到琼脂糖凝胶板的加样孔中。
6.3.2加人 100 bpDNA分子量标准物(4. 21)。6.3.3电泳
在5V/m稳定电压下，电泳30 min~40 mill6.3.4观察结果
电冰胶板在紫外灯下观察,或者而紫外凝胶成像仪扫描图片存档，打穿。用ICObpDNA分子量标准物比较，判断PCR片段大小，
VY/T1962—201C
7结果判定
RT·PCR扩增产物大小应在350bp左右：如果检测结果的阴性样品和空白伴品没有特异性条带，附性样品有特异性条书时.则衣明RT-PCR反应正硫可靠：如果检测的阴性样或空白伴品山现特另性条册，或阳性样品没有特异性条带，说明在RNA样品制备或RTPCR反应中的某个坏节存在间题，需重新进行检测。
待测样品在359bp左右显现核酸带，表明样品为阿性样品，含有151Vd，若待测样品在359hp布右没有该特异性条带，表明该样品为阴性样品，不含有PSTVd方法二往复双向聚丙烯酰胺凝胶电泳法8原理
类病毒在自然条件下呈棒状，高度配对的状态，在70℃~80℃条件下将会变性，由样状变成坏状，在聚丙烯酰胺胶的迁移疼减慢。正尚电泳足在带温非变性条件下，核峻从上往下迁移，反向电泳是在第一次正向电泳结爽后：变换中极，在高温变性条件下逃行，通过两次电泳将类病毒的核酸与寄主中的共他核酸分离山来，达到检测类病毒的H的。9试剂与材料
以下所用试剂.除特别注贴者外均为分析纯试剂水为符合B/工6682中规定的一级水。9.1三氯甲烷。
9.2水饱和酚（pI4.2)。
9.3焦碳酸一乙酯(FP处理的水（同1.5)。9.43ul/L乙酸钠溶液(pH5.2)（同4.6)，9.51mol/L一羟基巾基氨基巾烷盐废(Tris-HCl)溶液（pH8.0)(同4.9)9.6RNA捉取绥冲液（同4.10)。
9.75×TTis-砸酸（TBE)中泳缓冲液（1.12）9.81×Tris-谢酸（TB)电缓冲液（同4.13)9.9加样缓冲液（同4.1.4）
9.1030%胶液，
称取内烯酰胺29 g:N,N-亚甲基双内烯酰胺」g-加水定容至100 1m[.,过滤,4℃储存9.1110%过硫酸胺溶液（现用现配）。称取3.1g过硫酸胺，加蒸馏水定容至1m.9.12四中基乙二胺（TEMED)。
9.135%聚内烯酰胺凝胶。
量取5×Tris-硼酸（TBE）电泳级冲液（9.?）9mL.30%胶液（9.10）7.6mL，四中基乙二胺(TEMEI)>(9.12)44址,10%过硫酸铵溶液（9.11)200L，加水至45ml9.14固定液。
量取尤水乙醇30ml.，冰乙酸3Tnl.，加水定容至300ml.9.15染色液。
称取硝较银0.6%，加水溶解，定容尘300ml.，9.16显色液（现配现用）。
在 300 m水中.期人氢氧化钠3g,甲醛」ml,湛个均与，9.17终山液。
称取酸钠3.7g,加水辫解.定穿至 3C0mL注：电泳中用到的丙烯胺足种经毒剂，避免接触皮肤：热作时要带手餐。10仪器设备
10.1台式低温高速离心机（可以控制在4℃下进行离心）10.2电漆仪.
10.3乖直电冰槽。
10.4紫外凝胶成像仪。
NY/T1962—2010
10.5微量移液器(0.5μL-10g10ul190μL20l200ul100μL.-1000μ)11分析步骤
11.1样品RVA的提取
11.1.1RNA的抽提
称取0.5g样品.放丁灭茵冷冻的小研体,分别加人1ml.RNA提取缓冲液（9.6）.1mI.水饱和酚(9. 2)和 1 mI. =氯甲烷(9. 1),充分研磨后倒人 1. 5 imL 离心管中,于 4℃:下 10 090 r/ Ini 离心 15 zmir;用移液器小心将上层水树穆人少一离心管中。11. 1.2RNA 的沉淀
在RNA抛提液中（6.1.1),加入3倍体积无水冷2醇,1/10体积的3mo1/L乙羧钠溶液（9,4).混匀，-20℃沉淀1.5h以上.
11.1.3RNA的溶解
取出冷冻保存的RVA沉淀（6.1.2)，J4℃下10000r/min离心15min，弃掉上清，用1mL70%乙醇清洗沉淀，然后离心，叫用吸头彻底吸弃遗留在管中的上清液，在白然条件下干燥至核酸沉淀变成色或透明状态，再将核骏沉淀溶于30μL焦碳酸二乙酯(I)EPC)处理的水(9.5)中。一20℃贮存备用。注：或者选泽市售商品化RNA提取试剂盒：完成RNA的提取。11.2电泳
11.2.1正向电泳
电泳用5%聚丙烯酰胺凝胶（9.13），1×ris-硼酸（1BE)电泳缓冲液（9.8），中泳方向从负极到正极，中流最为每厘米凝胶5mA。点样量为6mL~10μL。当二甲苯腈示踪染料迁移创凝胶板底部时停止电。
11.2.2反向电泳
将止向电泳缓冲液倒出，然后把电泳槽放到70C~80C的烘箱预加热.样品变性30rmi1同时将倒出的电泳缓冲液在微波炉中加热到80。倒人中泳槽中，变换电极进行反向中泳：当二州苯示踪染料迁移到凝胶板顶部时，停止电泳：逊行凝胶染色。11.3染色
11. 3. 1 固定
将电泳胶片放在磁有300rL核酸固定液(9.14)的穿器巾，轻缓振荡19nin后倒掉固定液。11.3.2染色
向容器中加人300rL染色液（9.15),轻缓振荡13mi后，例山l染色液。用蒸馏水冲洗胶板，反爱5
NY/T19622010
神洗四次。
11.3.3显色
加人300mL核峻显色液（9.16)，轻缓振离.直率显现清断的核带，然后用白来水冲洗，反复冲洗四次免费标准下载网bzxz
11.3.4终止
将胶板放人300仙L终山液（0.17)终止反应。12结果判定
在凝胶板下方1/4处的核酸带为类病毒核酸化，与上部寄主核酸带之问有一定距离，者可明最分开。以电泳时载人的阴阳性样品作为对照，进行结果判定。
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中华人民共和国农业行业标准
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马铃薯纺锤块茎类病毒检测
Detcction of potato spindle tuber viroid(PSTVd)2010-12-23发布
2011-02-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准遵照GB/T1.12009给出的规则起草、木标准由中华人民共和国农业部种植业管翊司提山并1.本标准起草单位：农业部脱毒马普种警质量监替检验测试中心(哈尔滨)。NY/T1962—2010
不标滩主要起草人：吕典伙、刘尚成、邱彩玲、宿飞飞、土绍、李勇、于德才、张打、工文重、下业湖、范国权，李学湛.
1范围
马铃薯纺锤块茎类病毒检测
本标准规定了马铃善纺链块茎类病毒（PSTVa）的检测方汰。NY/T1962—2010
本标活用于马铃薯种薯、商品薯、试管苗及其根、茎、叶不同部位组织中的马铃薯纺锤块茎炎病毒的检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注口期的版本适用于本文件：凡是不注开期的引用文件，儿最新版本（包所右的修收单适用丁本这件。B/T6682分析实验案水规格和试验方法方法一聚合酶链式反应
3原理
类病毒是没有外壳蛋白,襟露的、低分子叫合环状 RNA分子,RVA分子大小在 246 nt-40I nt 之闻：马铃薯纺锤块莘类病毒(PSTVd>的序列在 3G m ~-360 m之间。根据 PSTVd序列设特异性物，进衍扩塔，扩增片段大小为359bp左右。4试剂与材料
以下所用试剂,除特别注明者外均为分析试剂,水为符合 GB/T 6682 中规定的一级水。4.1然甲烷。
4.2M-MLV反转录酶（200/L）
4.3RNA酶抑制剂(40u/μI)。
4.4TagNA聚个酶(5u/μt)
4.5焦候液二乙酯(DEPC)处理的水。在100 mL水中,加人焦碳酸二乙酯(DEPC)50 μL.室源过夜，121 ℃高压灭20 min,分到1.5mL DEPC处理过的微民管中。
4.63mol/L乙酸钠溶液（pH5.2)
称取2.酸钠-3H,0 24.6g,加水80 imL磷解.用冰2.酸调 pH至5.2,定容至100 nL。4.7水他和(pH 4.0)。
4.8溴化乙锭浴液（19m/mL）。
称取漠化乙锭200Ig?加水溶解，定容至20tmL4.91mol/L三羟基甲基氨基甲烷盐(fris-HCl)溶液（pH8.0)。称取 Tris碱121. 1 g.辫解小800ml.水中,用浓盐酸调 pH至8.,圳1水定容垒 1000 mL,121℃高压灭菌20min
4.10RVA提取缓划液。
称坡Tris碱12.12g，氯化钠5.88g，乙二胺四乙暖二钠3.75g.加水至90cmL，溶解，用浓盐酸调NY/T1962—201C
pIT至99.5，加水定容至1000mL，121℃高压火菌20min，4.110.5mol/L乙二铵四乙酸__钠溶液（pll8.0)称墩乙一铵酸二钢186.1g，溶于700mL水中，氢氧化调pTI8.0加水定容垒1000Iril。
4.125×1ris-能酸(TBE)电泳绥冲液。称1ris碱27，硼酸13.75只，量取\.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（.11)10mI，加灭菊双蒸水 400mL浴懈,定容至 500 mL
4.131×Tris硼酸(TBE)电泳缓冲液，量取5XTris-硼酸（TBE)电泳缓冲液(4.12)200mL,加水定容举1.000ml，4.14期样缓冲液。
分别称表聚虑糖25g.酚蓝0.1g二甲苯睛9.1g.加水至190mL4.155×反转录反应缓冲液。
量取1mol/T.三羟甲基蕴基甲烷盐液(Tris-HCl)溶液（4.9)5mL.0.559g氯化钾，0.029g氯化镁,0.154g二硫苏糖醇(DYTI).水定容室100 mlL.4.1610mmol/L的四种脱氨核核并酸(dATP、cCTP、dGTP、dT)混合溶液。4.1710XPCR绥冲液。
称取氯化钾3.73g.氯化镁（MgC·6H.O)0.30g，溶于70mL水中.加人」mol/二羟基甲氮基甲烷盐暖（Tris-1KCI)溶液（1.9)10mL,加水至100mL，121℃高压灭菌20min4.18TE缓冲液
量取11no1/L三羟H甲基氨基甲烷一盐酸(TrisITCI)溶液(4.9)10mL，0.5rel/I.乙二铵四乙酸二钠落液（4.11)2mL加入水定容至1000mL121℃高压灭菌20min4.19物。
PG:&'GGA TCC CTG AAG CGC I: 'ICC GAG CCG ?PH:5' CCCGGK AAA CT GGA GCG AAC TGG 预期扩增片段为359bp左右。
4.20学物缓冲液。
用TF缓冲液（4.18)分别将上述引物稀释到20umo1/L。4.21100bpDNA分子萱标准物
5仪器
5. 1 ICR仪，
5.2台式低温高速离心机（可以控制在4℃：下进行离心）。5.3中泳仪、水平电泳槽
5.4紫外凝胶成像仪。
5.5微量移液器(0.5μL～10μ,10μ100 L20μL-~200μ100μL1000μL)5.6 水浴锅、灭削锅等。
6分析步骤
设立阳性对照和阴性对照。在以下实验过程中，要设立阴阳性对照.即标准的即性样品和阴性样品要同待测样品一同进行如下操作.6.1样品RNA的提取
6.1.1RNA的抽提
NY/T1962—2010
称取0.5名样品，放于火菌冷冻的小研钵中,分别加人1mI.RNA提取缓冲（!.10),1ml.不饱和酚(4. 7)和 1 mL 二氯甲烷(4. ]).充分研磨后倒人 1. 5 ml 离心管中,于 4℃ 下 10 000 r/ min 离心15min,川移液器小心将上层水相慈入另一离心管中。6.1.2RNA的沉淀
在RA4抽提液中(6.1.1),加人3倍体积无水冷乙醇，1/10) 休积内3 mo1/1.乙酸钠荠（4.6),润匀，-20%沉淀1.5h以上。
6.1.3RNA的溶解
取山冷冻保存的RNA沉淀6.1.2)，于1℃下10000r/mit离心15mi，弃掉上清，用1mL70%之情清洗沉淀，然后离心，再用吸头衡底吸弃遗留在管中的上清液，在门然条件下干燥至核酸沉淀变成口色或透明状态，将核酸沉淀游于30 pI焦碳酸二乙(DE1\C)处理的水(4.5)中。一20℃贮存，备川。注：或者迅择市售阅品化RN4提取试剂盒·光收RNA的好取。6.2RT-PCR反应(二步法)
将待测样品的RNA溶解液（6.1.3).引物缓冲液（4.20)，四种脱氧核糖核芦峻泥合溶液（4.1G)，5×反转录反应缀冲液（4.15)在冰上溶解。6.2.1反转录第一链合成
在200μL薄髋 PCR管中依次加人引物 Pe(4.19)0.6 μL,待测释品 RNA溶解液(6.1.3)1μE-,10mmal/I.的四种脱氧该糖核酸混合溶液（4.16)1μL无菌双蒸水9.4pL，轻轻混句，将该反应管在65℃水浴中加热5min.然后浴5mi,以4000 r/min离心10。人5×反转录反应缓冲(4.15）4,0.1mmol/1.F2μl,RNA酶抑制剂(40u/)(4.3)1μ,轻轻混勾,42℃孵育2min再加人1L M MLV反转录酶(200 u/ uL)(4. 2),2℃孵脊 50 min,然启在 70℃下失活 15 min6.2.2聚合酶链式反应
另取-个290 μL辨磅 PCR管.依次加人 10×PCR缓冲液(. 17)5 μI25 mmol/T. MgCl 3 μl..iCmmnl/L.川种脱氧核辨核吾酸混合溶液(4.16)luL,物(Pc和Ph)(4,19)各1mL,TaqDNA聚合酶(5u/μ)(4.4)0.5ml,cLNA中第一链合成产物（6.2.1)2μL.灭菌双蒸水36μ,轻轻混食，恶加人约20)L石蜡油(有热量设备的PCR仪可以不石蜡汕），000T/min离心10后，将PCR管摘人YR仪中。94℃2 mi;进行 30次扩增反应循环(94℃:60 s.55C 60 s,72C 60 s);然后 72%:10min:山 PCR管，对反应产物进行电泳检测或在1下保存。注：6.2步骤达可以按照市售商业化一步R7-PCR试剂盒说明书进行操作。6.3PCR产物的电泳检测
6.3.11.0%琼脂糖凝胶板的制备
称取1,0g琼脂糖,加人1×Tris-绷酸(TTF)电缓冲液(4.3)定容至100 mI,在微波炉卵热至琼脂糖融化，待济液冷却至50℃--60℃时，加溴化乙链溶滋（4.8)5{L，摇勺，倒人电泳檀中，凝固片取小梳子，爸用。
将 20 μI.PCR产物与 2) μL.样缓冲液(1.11)滤合,取混合液10 μL 加人到琼脂糖凝胶板的加样孔中。
6.3.2加人 100 bpDNA分子量标准物(4. 21)。6.3.3电泳
在5V/m稳定电压下，电泳30 min~40 mill6.3.4观察结果
电冰胶板在紫外灯下观察,或者而紫外凝胶成像仪扫描图片存档，打穿。用ICObpDNA分子量标准物比较，判断PCR片段大小，
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7结果判定
RT·PCR扩增产物大小应在350bp左右：如果检测结果的阴性样品和空白伴品没有特异性条带，附性样品有特异性条书时.则衣明RT-PCR反应正硫可靠：如果检测的阴性样或空白伴品山现特另性条册，或阳性样品没有特异性条带，说明在RNA样品制备或RTPCR反应中的某个坏节存在间题，需重新进行检测。
待测样品在359bp左右显现核酸带，表明样品为阿性样品，含有151Vd，若待测样品在359hp布右没有该特异性条带，表明该样品为阴性样品，不含有PSTVd方法二往复双向聚丙烯酰胺凝胶电泳法8原理
类病毒在自然条件下呈棒状，高度配对的状态，在70℃~80℃条件下将会变性，由样状变成坏状，在聚丙烯酰胺胶的迁移疼减慢。正尚电泳足在带温非变性条件下，核峻从上往下迁移，反向电泳是在第一次正向电泳结爽后：变换中极，在高温变性条件下逃行，通过两次电泳将类病毒的核酸与寄主中的共他核酸分离山来，达到检测类病毒的H的。9试剂与材料
以下所用试剂.除特别注贴者外均为分析纯试剂水为符合B/工6682中规定的一级水。9.1三氯甲烷。
9.2水饱和酚（pI4.2)。
9.3焦碳酸一乙酯(FP处理的水（同1.5)。9.43ul/L乙酸钠溶液(pH5.2)（同4.6)，9.51mol/L一羟基巾基氨基巾烷盐废(Tris-HCl)溶液（pH8.0)(同4.9)9.6RNA捉取绥冲液（同4.10)。
9.75×TTis-砸酸（TBE)中泳缓冲液（1.12）9.81×Tris-谢酸（TB)电缓冲液（同4.13)9.9加样缓冲液（同4.1.4）
9.1030%胶液，
称取内烯酰胺29 g:N,N-亚甲基双内烯酰胺」g-加水定容至100 1m[.,过滤,4℃储存9.1110%过硫酸胺溶液（现用现配）。称取3.1g过硫酸胺，加蒸馏水定容至1m.9.12四中基乙二胺（TEMED)。
9.135%聚内烯酰胺凝胶。
量取5×Tris-硼酸（TBE）电泳级冲液（9.?）9mL.30%胶液（9.10）7.6mL，四中基乙二胺(TEMEI)>(9.12)44址,10%过硫酸铵溶液（9.11)200L，加水至45ml9.14固定液。
量取尤水乙醇30ml.，冰乙酸3Tnl.，加水定容至300ml.9.15染色液。
称取硝较银0.6%，加水溶解，定容尘300ml.，9.16显色液（现配现用）。
在 300 m水中.期人氢氧化钠3g,甲醛」ml,湛个均与，9.17终山液。
称取酸钠3.7g,加水辫解.定穿至 3C0mL注：电泳中用到的丙烯胺足种经毒剂，避免接触皮肤：热作时要带手餐。10仪器设备
10.1台式低温高速离心机（可以控制在4℃下进行离心）10.2电漆仪.
10.3乖直电冰槽。
10.4紫外凝胶成像仪。
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10.5微量移液器(0.5μL-10g10ul190μL20l200ul100μL.-1000μ)11分析步骤
11.1样品RVA的提取
11.1.1RNA的抽提
称取0.5g样品.放丁灭茵冷冻的小研体,分别加人1ml.RNA提取缓冲液（9.6）.1mI.水饱和酚(9. 2)和 1 mI. =氯甲烷(9. 1),充分研磨后倒人 1. 5 imL 离心管中,于 4℃:下 10 090 r/ Ini 离心 15 zmir;用移液器小心将上层水树穆人少一离心管中。11. 1.2RNA 的沉淀
在RNA抛提液中（6.1.1),加入3倍体积无水冷2醇,1/10体积的3mo1/L乙羧钠溶液（9,4).混匀，-20℃沉淀1.5h以上.
11.1.3RNA的溶解
取出冷冻保存的RVA沉淀（6.1.2)，J4℃下10000r/min离心15min，弃掉上清，用1mL70%乙醇清洗沉淀，然后离心，叫用吸头彻底吸弃遗留在管中的上清液，在白然条件下干燥至核酸沉淀变成色或透明状态，再将核骏沉淀溶于30μL焦碳酸二乙酯(I)EPC)处理的水(9.5)中。一20℃贮存备用。注：或者选泽市售商品化RNA提取试剂盒：完成RNA的提取。11.2电泳
11.2.1正向电泳
电泳用5%聚丙烯酰胺凝胶（9.13），1×ris-硼酸（1BE)电泳缓冲液（9.8），中泳方向从负极到正极，中流最为每厘米凝胶5mA。点样量为6mL~10μL。当二甲苯腈示踪染料迁移创凝胶板底部时停止电。
11.2.2反向电泳
将止向电泳缓冲液倒出，然后把电泳槽放到70C~80C的烘箱预加热.样品变性30rmi1同时将倒出的电泳缓冲液在微波炉中加热到80。倒人中泳槽中，变换电极进行反向中泳：当二州苯示踪染料迁移到凝胶板顶部时，停止电泳：逊行凝胶染色。11.3染色
11. 3. 1 固定
将电泳胶片放在磁有300rL核酸固定液(9.14)的穿器巾，轻缓振荡19nin后倒掉固定液。11.3.2染色
向容器中加人300rL染色液（9.15),轻缓振荡13mi后，例山l染色液。用蒸馏水冲洗胶板，反爱5
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神洗四次。
11.3.3显色
加人300mL核峻显色液（9.16)，轻缓振离.直率显现清断的核带，然后用白来水冲洗，反复冲洗四次免费标准下载网bzxz
11.3.4终止
将胶板放人300仙L终山液（0.17)终止反应。12结果判定
在凝胶板下方1/4处的核酸带为类病毒核酸化，与上部寄主核酸带之问有一定距离，者可明最分开。以电泳时载人的阴阳性样品作为对照，进行结果判定。
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