GB/T 27518-2011 西尼罗病毒病检测方法 GB/T27518-2011 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

ICS11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T 27518—2011
西尼罗病毒病检测方法
Diagnostic of west nile virus infections2011-11-21发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2012-03-01实施
本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草本标准由中华人民共和国农业部提出本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。GB/T 27518—2011
本标游起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局、北京自欧赛地生物工程技术开发中心本标推拦雯起草人:杨秀娟、孙循军、丁著恩、用茵、田睿、土飞、杨静。1
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1范围
西尼罗病毒病检测方法
GB/T 27518—2011
本标准规定了西尼罗病斑的反转录聚合酶链反应（Rcvcrae TransrrirtionPolymerasc Chain Rc-act.ion,RT-PCR)、蚀斑试少中和试验(Plaque Reduction Neutralization Tcs1,PRNT)和西尼罗病毒的分离方法：
本标推适用于易感动物的西尼罗病建病的检测2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注口期的引用文件，仅注口期的版李适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修政单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
ABTSdixmmoniun2,2'-azinn-bis(3-ethylbezothiazpline-6-sullonate):2,2'-连基-双-(3-Z基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸）二铵盐
AMV:鸟类成髓细胞白血病病毒(avian myeloblastosis virus）BSA，牛清白蛋白(bovine sertm albumin)CPE：细胞病变效应(cytopathiceffect)cDNA:互补 DNA(complementary DNA)DEPC：焦碳酸乙二(diethylpyrocarhanate)DNA deoxyribonucleic acid脱氧核糖核酸dH,O.双蒸水(double distillcd water)dNTP.脱氧核苷酸=磷酸(dcoxy-rihonueleosidiriphasphate)含有dCTP.dGTP,dATP,dTTP四种脱氧核糖核旨
EDTA:乙二胺西乙酸(ethylenc diatninctetraacctic acid)6-FAM.6-羧基荧光素(6-carboxylluorescein)HEPES：轻乙基哪嗪乙硫磺酸（N-2-hydruxyothylpiperazine-N-ethanc-sulphonicacid)MEM：基础培养基（minimaessentialmedium)OliO dT:多案 T再邨上一小段随机碱基(凡个碱基)构戒的引物,用于RT-PCRPBS.磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate belanced solution)PFU:蚀斑形成单位（plaque forming units）PRNT：蚀斑减少中和试验(plaquereduction ncutralization test）RNA：核糖核酸(ribonucleic acid)RNasin：核酸酶抑制剂(RNAen2yminhibitor)TAE: 醋酸盐 EDTA(tris-acetate-EDrA Tris)1
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GB/T 27518—2011
Taq酶：耐热DNA桑合酶（thermus aquaticuspolymerase)TAMRA：四甲基罗丹明（carboxytctramethylrhodaminc）TRIzol：一种新型总RNA抽提试剂（1rizol reagcnt），可以直接从细胞或组织中提取总RNAVero细胞：非洲绿猴肾细胞
WNV西尼罗病幸（west nile virus）4试剂
4.1水：符合GB/T 6682中一级水的规格，用DEPC处理以除掉RNA酶。4. 2TRIzol 试剂或其他等效的商品化 RNA 抽提试剂。4.3AMV逆转录酶：20U/uL，一20C保存，不要反复冻融或温度剧烈变化，4. 45XAMV Buffer:AMV 逆转录酶的缓冲液。4.5RNain：20U/u，一20C保存，不要反复冻融或温度剧烈变化4.60
Oligo4.710× Tag Buffer;Taa酶的缓冲液。4. 8Taq 酶：一20 :保存,不要反复炼融或温度刷烈变化，4. 9dNTF =酸脱氧核糖核苷,含 dCTP,dGIP,dATP.dTTP 各 10 mmoL/L4. 10
琼脂糖：电泳级。
三氯甲烷:分析纯，
异丙分析纯,使用前颅冷到一20 ℃。4.1375%乙醇。
FBS:121商玉15 min后，无菌加入肯和链每紊至1000 U/mE。TAE:24. 2 名 Tris 碱.5. 7 lg 冻Z酸,0. 5 mal/L EDTA(pH8. 0)10 mL,加水定容至 100 tnL,使4.15
用前作50倍稀释,用盐酸调节pH值至7.5~7.6WNV标准毒、WNV阳性对照与WNV阴性对照。4. 16
MEM细胞培养基
4.18 Vero细胞.
胎牛血清。
4.20 细胞维持液:含 2%~3为胎牛血清、青霉素和链得素分别为 100 U/mL 的无菌 MEM。4.21中性红水济液：中性红粉0.1g+用去离子水定容至100ml..pH7.4.高压除菌或0.22μm滤膜过滤,无菌分装手竭色瓶内,4 ℃保存裔用。4.222 倍浓度不含中性红 MEM液:10 倍浓度不含酚红的 MEM 20 mL,胎牛血清 4 mL,青霉素和链薄素各 10 C00 U(μg),去离水定容至 100 mI.,0.22 μm 滤膜过滤,pH7. 2~-7.4,1 ℃C保存备用。4.23不含中性红的营养琼脂：使用前配制20g/L琼脂糖水浴融化后保持在43℃~~45℃+加人等垦已加温至 43 ～~45 亡的 2 宿浓度不含中性红 MEM液,充分混合均匀,保存在 43 ℃ ~15 ℃水浴中备用。
4.24：2倍浓度含中性红MEM液：10倍浓度不含酚红的MEM20mL胎牛血清4mL，青霉素和链霉素各10000U(μg),中性红水溶液6ml.,去离子水定容至100mL,0.22μm滤膜过滤，pH7.2~-7.4,4℃保存备用。
4.25含中性红的营养球脂：使用前配制20g/L琼脂糖水浴融化后保持在43～45℃，加人等量已加温至 43 C~~15 ℃C的 2 倍浓度含中性红 MEM液:充分混合均匀,保存在 43 ℃~45 ℃水浴中备用。4.260.1为过氧化氧氢。
4.27BSA：一般是在购置FCR试剂中带的，尽在反应时保持酶活性的。不是必须的。不用自已配置。2
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也可不人反应中
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4.280.5mal/LPH9.6的碳酸盐缓冲液：碳酸钠0.32g，碳酸氢钢0.586g，加水潜解，定容至200 mL.
4.29抗马 IgM。
5%脱脂奶粉.5的脱脂奶粉溶于100mL的PBS缓冲腋中，0.05%tween-20：吐温—20.
辣根过氧化物酶结合的抗黄病毒单克隆抗体。Rnase:RNA 酶(RNA Palymerase).5器材和设备
24孔细胞培养板。
96孔细胞培养板。
二氧化碳培养箱。
普通冰箱和超低温冰箱：规格2℃～8℃，-20℃，-80℃5.4
研磨器/研钵。
离心机（规格≥15000g）
荧光RT-PCR检测仪。
PCR权。
可调移液器，
电泳仪。
细胞瓶，
微型滤器：装有 0.22 μm滤膜,121℃高压15min。5%脱脂乳封板。
6WNV的分离
实验室生物安全要求
实验室生物安全要求按照录A执行。6.2样本采集
疑似死于西尼罗病毒病的动物可考虑采集血液，血清、脑脊液或织，其中组织样品可优先采取脑组织和神经组织其次可采集肾，脾和肝组织，进行血样采集时避免使用阻碍PCR反应的肝素，可用抗凝剂FDTA采血。6.3样本运输与储存
血清样本应冷藏，24h内运送至实验室（血清标本可在4℃存放1周，长期保存置一20℃或以F）。其他样本送至实验室后，病睾分离样本应尽快进行接种分离，18h内进行接种的可罩于4亡保存，如未能接种成趾了℃或以下保存，避免反复冻融。6.4样本处理
取感染摔本送专业实验室检測,样本的储存和运输应保持在低于一70℃中，组织样本取1~2g在无菌研磨器或研钵中加5mL--10mL含10%胎牛清的IBS溶液,磨3
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GB/T 2751B--201t
碎，冻融2次一3次，3000g离心10min，上清液用微型滤器过滤后备用。血液样本直接冻融2次3次，用含10%胎牛血清的FBS溶液稀释10倍，3000g离心10min，上清液用微型滤器过滤后备用。
脑脊液样本用含10%胎牛血清的PBS溶液稀释5倍～10倍，3000g离心10min，上潜液用微裂滤器过滤后备用。
6.5病毒分
处理好的样本悬液接种至已 80%~90%满度单层 Vero 细胞,24 孔细胞培养板每孔加 0,2 mL~0. 3 mL,I00 mL 细胞瓶每瓶加 1 ml.～~2 mL,5%二氧化碳培养箱中 37 ℃吸附1 h~2 h,倾去病理材料悬液,加入细胞维持液,5%二氧化碳培养籍中 37 C吸附 3 d~5 d,连续观察细胞病变(CFE),如出现典型CPE，可用RT-PCR、PRNT进行病原鉴定；盲传3代后如未观察到CPE，判为病毒分离阴性。7WNV 的检测
7. 1 引物与荧光探针
7. 1. 1 荧光 RT-PCR E基因扩增引物与探针引物 1:5'ICA GCG ATC TCT CCA CCA AAG-3'(NT1160)。引物 2:5'-GGG TCA GCA GT TTG TCA TTG3'(NT1229)TaMan探针：5'-TGCCCGACCATGGGAGAAGCTC-3'(NT1186).5'端标记FAM,3'端标记TAMRA.
7.1.2光RT-PCRNSI基因扩增引物与探针引物1:5'-GGCAGTTCTGGGTGAAGTCAA-3'(NT3tII).[物 2:5'-CTC CGA TTG TGA TTG CTT CGT-3'(NT3239).TaqMan探针:5'-TGT ACG TGC CCT GAG ACG CAT ACC TTG T-3'(NT3I36),5'端标记FAM,3端标记TAMRA。
7.1.3套式RT-PCR外源引物
引物1:5'-TTGTGTTGGCTCTCTTGGCGTTCTT-3'(NT233-257)，引物2:5'-CAGCCGACAGCACTGGACATTCATA-3(NT616-640)，扩增片段大小：107bp。
7.1.4妾式RT-PCR内源引物
可物 I:5'-CAG TGC TGG ATC GAT GGA GAG G-3'(NT287-308)。引物2.5'-CCGCCGATTGATAGCACGGT-3'(NT370-390)扩增片段大小:103 bp。
7.2模板RNA提取
血清，血液、脑脊液等液体样品直接取200μL于1.5mL离心管中编号备用，组织样品取2g于无菌研钵中磨碎，加入10mLPBS混匀，4C中3000g离心15min，取200μL上清于1.5mL离心管中编号备用。
在1.5mL离心管中加人被检样品、期性对照,阳性对照各200μL,加人TR1zul试剂600μL.再加4
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GB/T275182011
人三氯甲烷200μL，混匀，4℃中12000g离心15min，取上清加入一20℃预冷的异丙醇100μL，混匀，4中12000g离心15min.轻轻倾去上清液，加人75%乙醇600L洗涤，4中12000g离心15min，轻轻倾去上清液，室温于碟5min~10min.加人DEPC水20L溶解RNA.冰上保存备用。提取的RNA最好在2h内进行RT-PCR扩增，若需长期保存，应放置一70它冰箱。7.3反转录
在 PCR 管中依欲加人 3× AMV Buffer 1 μL,dNTP(各 I0 ntuol/L)2 μL,RNasc 20 U,lign(dT)30pmol.AMV逆转录酶10URNA模板5μL.DEPC水至20μL，瞬问离心，43℃反转录1h后，立即迅速冷却至4℃，瞬间离心·分装，立即用于荧光PCR或套式PCR，或于一80C保存备用。7.4荧光 PCR
采25μL反应体系，在PCR毛细笋或PCR反应管巾依次加10×TaaBuffer2.5μL,dNTP（名2.5 nmol/L)3 zL,氯化镁(MgCl )(25 mmol/L)5.5 μL.引物(7.t. 1或7.1.2)(20 μmol/I.)名0.5L，TayMan探针(在费光PCR引物中已标出)(10mol/L)1μL.TagDNA案合酶0.25μLBSA(5 μ/μL)1 μL、cDNA(逆转录后的产物)5 μL,dH,0 至 25 μL。 瞬间离心所于定量 PCR 仪进行 FCR扩踏。扩增条件：95℃预变性5min后.95℃15s.60℃1min，45个循环，每次循环结束后检测每管扩增的荧光值。
7.5套式PCH
在PCR管中依次加人10×TagBufcr5μL、dNTP（各2.5mmol/L)4I、氟化镁（MgCl）(25 mmol/L) 4 μL,外源引物(7. 1. 3,20 μmol/L)各 0. 5 μl.、TarDNA 聚合酶 0,25 μI,cDNA 或外源引物扩增产物5μL.dH.O至50μL。瞬间离心后进行PCR扩增。扩增条件：95它预变性5min后94℃45s、56℃45s.721min，35个循环，72延伸10min取15μL扩增产物用16g/L琼脂糖电泳观察结果：如果观察到特异性扩增条带.扩增产物用超纯水稀释至100倍～1000倍后用，作为内源引物扩增模板，如果未观赛到待异性扩增条带，扩增产物直接作为内源引物扩增模板，内源引物扩增的反应体系配制方法参照外源引物扩增反应体系进行，扩增条件：95℃预变性5mit后，94℃455.58C45572℃1min,25个循坏72℃延伸5min。取15μL扩增产物用20g/L琼脂糖电泳规察结果。
7.6结果判定
7.6.1荧光 PCR
阴性对照无Ct值（每个反成管内的荧光信号达到设定的阅值时所经历的循环数），并且无护增曲线；阳性对照Ct值应小于30.0,并出现典型扩增曲线，否则，试验结果无效。在试验结果成立的前提下如果样品的 Ct 值小于 37,且出现典型扩增由线为阳性,Ct值 3745 为可疑，无C1值且无扩增曲线为阴性，7.6.2套式PCR
阳性对照的PCR产物电泳后，[现·条特异性条带；阴性对照PCR产物电泳后没有条带，试验缩果成立；香则，结果不成立。
在试验结果成立的前提下如果样品PCR书增产物经过电泳检测后，出现特异性日的片段者为阳性;无特异性扩增片段者为阴性。7.6.3样品结果判定
7.6.3.F样品同时用E基因和NSI基因进行荧光PCR后，结果均为性者判定为含有西尼罗病毒核酸。
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7.6.3.2样品同时用E基固和NSI基因进行荧光PCR后，结果均为阴性者判定为不含有西尼罗病击核酸。
7.6.3.3样品同时用E基因和NS1基因进行荧光PCR后.其中之-结果均为阴性者.用套式PCR再次进行检测，绪果为阳性者判定为含有西尼罗病毒核酸，结果为阴性者判定为不含有西尼罗病毒核酸。7.6.4荧光PCR和套式PCR的外源引物扩增可采用等效的一步法RT-PCR试剂盒进行检测，其操作和结果判定根据试剂盒的说明书进行，但成优化引物和TaqMan探针浓度，确保检避的特异性和灵敏度与本标准的方法等效。
7.6.5应用荧光PCR和套式PCR检测西尼罗病毒核酸结果为阳性者·必要时应对扩增产物进行核酸序刘分析验证。
白蚀斑减少中和试验(PRVT)
8.1操作程序
8. 1. 1病毒培养
WNV标准毒株接种至处于对数生长期80%～90%满度非洲绿猴肾（Vcro）细胞，37℃吸附1h后,弃去病毒液加人细胞维持液%二氧化碳培养箱中37培养3d～1d,待70%～80为细胞出现CPE，一20 C冻融2次.分装，一80陈存备用。B. 1. 2 PFU 测定
保存病毒用MEM连续10倍稀释.接种于80为~90%满度单层Vero细胞的96孔板，每个磷释度接种8孔，100mL/孔同时设8孔细胞对照，每孔加人MEM100μL，5%二氧化碳培养箱中37C孵育1h～2h，弃去孔内病毒液,加人不含中性红的营养琼脂100μL/孔.5%二氧化碳培养箱中37路养4.5d，加人含中性红的背养琼脂100L/孔.5%二氧化碳培养箱中37℃避光培养，12h后观察CPE，计算病毒的PFU。
8.1.3斑减少中和试验
待检血清，标准阳性血清和标准阴性血清用MEM做连续2倍帮释后，加入等体积50μL含有100PFU的病毒恶液，充分混勾，37℃C作用1h后，将血清与病毒混合液接种至80为～90为满度单层Vero细跑的96孔板，每个希释度接种8孔，100μL/孔。同时将稀释好的50μL中100PFU的病牵感液做10倍，100倍、1000倍稀释，接种80%～90%满度单层Vero细胞的96孔板，每个稀释度接种4孔~8孔,100 μL/孔,作为病毒回归对照。稀释好的 50 μL 中 100 PFU 的病毒忌液接种 4 孔 ～8 孔:I00 μL/孔,作为病毒对照。MEM 接种 4 孔～各孔,IC0 μL/孔,作为细胞对照。所有处理好的细胞于5%二氧化碳培养箱中37℃孵育1h~2h弃去孔内被体，加入不含中性红的营养琼脂100μL/孔，5%二氧化磁培养箱中37℃培养4.5d，加人含中性红的营养琼脂100μL/孔，%二氧化碳培养箱中37℃避光培养，I2h后观察CPE，按Recr-Muench方法计算血清的中和效价。8.2结果判定
8.2.1归对照的病毒浓度为每50μL30PFC--300PFU范围内，并且标准阴阳性对照血清的抗体效价在1个度误差范围内，试验成立，试验结果成立的条件下方能判定样品的结果，否则，试验结果不成，查找原因，并重做试验。
8.2.2待检样品中和效价大于等下1*10者判为阳性。6
9IgM捕获ELISA
9.1实验步跟
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0.5mo1/LPH9.6的碳酸盐缓冲液稀释抗马IgM作为捕获抗体包被平底96孔ELISA板每孔100μL：包被扳在4℃凝盒中孵育过夜。使用前，用含有0.05%吐温一20的0.01MpH7.2PBS洗板两次，每孔用200μL～300μL，用PBS新配制的5脱脂奶粉封板，每孔加300L，并在室温中孵育60rniI，游育后移去封闭液，并用PBS洗板3次：被检和对照血清用PBS作1：100稀释（脑脊髓液作1！2稀释），每份样品加双排孔（每份样品共加4个孔），每孔50=L，包括用和样品同样方法制备的对照阳性和阴性血清，盖上板，并在37℃湿盒中孵育75miI;移去血清，并用PRS洗板3次；用PBS稀释病毒和正常抗原，加50μL病毒抗原到每份被检血清和对照血清一排孔中-并加50L正常抗原到每份被检血清和对照血消的第二排孔中；盖上板，并在4C湿盒中孵育过夜：移去孔中抗原，并用PBS洗板3次：用PBS稀释辣根过氧化物酶结合的杭黄病声单克隆抗体，每孔加50μL：盖.上板，并在37C孵育60min：移去结合物，并PBS洗板6次，每孔加50μL新配制的ABrS底物和过氧化氢（0.1%）.在室温中孵育 30 min。
9.2结果判定
在405nm测光密度值，如果含有病声抗原的被检样品孔的光密度至少是含病囊抗原的阴性血清对照孔的光密度的两倍，并至少是含有对照抗原的被检样品平行试验孔的光密度的两借，该被检样品被认为是阳性。
结果判定
10.1组织，血、脑脊液或其他体液中分离到西尼罗病毒，说明动物感染了WVV。10.2组织、血、脑节液或其他体液中用RT-PCR检谢到西尼彩病毒基遇，判定为西尼罗病毒RT-PCR检测结果阳性、或判定为西尼岁病荐基因检测结果阳性。说明动物感染了WVV。10.3IgM拖捉EIISA检测到西尼罗病毒lgM抗体，判定为西尼罗病链IgM捕捉ELISA结果阳性，说明动物感染了WNV。
10.4IgM捕捉EIISA结果判定为可疑，并用蚀斑减少和试验检测到西尼罗中和抗体，判定为西尼罗病毒抗体检测结果阳性。说明动物感染了WNV。GB/T 27518—2011
附录A
（规范性附录）
实验童生物安全要求
A,1PRNT：所有操作在BSL-3实验室中进行，操作人员防护、所有使用物品和废弃物按BS1.-3安求进行。
A.2病毒分离：所有操作在BSL-3实验室中进行，操作人员防护、所有使用物品和废齐物按BSL-3要求进行。
A.3PCR：前期所有操作在BSC(生物安全)内进行，病毒裂解液入后可转移至生物安全2级(BSL-2)实验室进行操作
A，4动物户体解剖：所有操作在BSL-3实验室中进行，操作人员防护、所有使用物品和废弃物按BSL-3要求进行。
A,5其他有关西尼罗病毒的操作：前期所有操作在BSC内进行,能有效火活病毒的去垢剂或病毒裂解液加人后，方可转移至BSL-2实验室进行操作。注：BSL-3：生物安全3级实验室，HS1-2;生物安全2级实验室，HSC：生物安全柜
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