NY/T 2174-2012
基本信息
标准号： NY/T 2174-2012
中文名称：主要热带作物品种AFLP分子鉴定技术规程
标准类别：农业行业标准(NY)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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标准简介
NY/T 2174-2012 主要热带作物品种AFLP分子鉴定技术规程
NY/T2174-2012
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标准内容
ICS07.080
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 2174—2012
主要热带作物品种AFLP分子
鉴定技术规程
Technical code for identifying main tropical crops varieties withAFLP molecular markers
2012-06-06发布
2012-09-01实施
中华人民共和国农业部
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部农垦局提出。言
本标滩中农业部热帮作物及制品标准化技术委员会归口。NY/T2174—2012
本标准起草单位：中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，中国热带农业科学院热带牛物技术研究所、中国热带农业科学院南亚热带作物研究所、中国热带农业科学院橡胶研究所。本标准主要起草人：邹冬梅、蒋耳顺、灵坤鑫、雷新涛、曾霞。1范围
NY/T2174—2012
主要热带作物品种AFLP分子鉴定技术规程本标准规定了主要热带作物品种AFLI分子鉴定的术语和定义、试剂和材料、仪器和设备、鉴定步骤、结果计算和鉴定规则。
本标准适用于橡胶（Hewa brusitiensis Muell-Arg）芒果（Mangifera indiczIinn.）荔枝（Litchzchinensis Sonn.)龙眼(Dimocurpus tongana Lour.香蕉(Musa nana Lour.)木薯(Murihut escutenlaCrants）、柱花草（StytosanthesSW.）的品种AFLP分子鉴定；也可作为其他热带作物品种AFLP分子鉴定参考。
2规范性引用文件
下列文件对丁本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注口期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义
下列术和定义适用丁本文件。
遗传相似性genetic similarity供检品种与真实品种间在DNA分子遗传上的一致性程度，用遗传相似系数表示。4原理
根据不同热带作物品种基因组DNA存在差异，基因组DNA经限制性内切酶双酶切后分别连上特定的接头，再进行预护增和选择性扩增；出于选择性基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性，贝只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才训以被扩增；扩增产物经聚丙烯酰腰凝胶电泳分离，然后根据凝胶I:INA指纹的有无求鉴定品种间的差异。5试剂与材料
除非另有说明外，在分析中仪使用确认为分析纯试剂。水为GB/T6682规定的无菌双蒸水或纯度与之相当的水。
5.1样品DNA提取试剂
5.1.1三羟甲基氨基甲烷(Tris,NHC(CH:OH),CAS:77-86 1)。5. 1.2氯化氢(HC1,CAS:7647-01-0)。5.1.3乙二胺四乙酸_钠(EDTA Na·21O,CnHraNNazO:+2H2O,CAS:638192 6)5.1.4
氢氧化钠（NaOII,CAS:1310-73-2)。5.1.5
氯仿(CTICI,CAS:67-66-3)。
异戊醇(C,I,O,CAS:123-51 3)。5.1.7
十烷基三甲基漠化铵(CTABCH（CHa）,NBr,CAS：57-09-0)。氯化钠(NaC1,CAS:7647-115)。
NY/T2174—2012
5. 1. 93 巯基乙醇(β-Mercaptocthaiiol,C,H.OS,CAS:60-24 2)。(CTI,O,CAS:108952)
5. 1. 11异两醇(C,H:O,CAS:67-63 -0)。醋酸钠(CHI,O0Na,CAS:127-Q9-3)5. 1.12
Z较(CHO2,CAS:64- 1 -7).
5. 1. 141mol/1. Tris-II(l(pII8. 0):在80 ml.无菌双蒸水中溶解12.11 g Tris(5.1. 1)加人 1. 2 ml,浓HCl(5.1.2)调节pH牵8.0(溶液冷至室温后，最后调定II)，用光菌双蒸水定容至100mL5.1.150.5mol/IEDTA（pH8.0)：在80ml.无菌双蒸水中加入18.61g乙一胺四乙酸钠（5.1.3)，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用氢氧化钠(5.1.4)调节溶液的pII至8.0（约需2氢氧化钠）然后用无菌双蒸水定容至100mL。
5.1.16氯仿：异戊醇（24：1)：先加960mL氯仿（5.1.5），再圳40ml异戊醇（5.1.6），混合均匀，保在探色坡璃瓶中，4℃保存。
5. 1. 17CTAB提取缓冲液：称取4g CTAB(5.1. 7)和 16. 361g NaCI(5. 1. 8),量取1 mol/L Tris-HCl（5.1.14)20mL和0.5mol/LEDTA(5.1.15)8mL.先用70mL无菌双热水溶解，再定容至200mL火菌、冷却后，加人0.2%β统基乙醇（5.J.9)400u1.和氯仿：异戊醇（5.1.16）：100mL，摇勾即可。5.1.18苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1)：将饱和举酚（5.1.10)与等体积的氯伤：戊醇（24：1）(5.1.16)混合均勺，保存在棕色玻璃瓶中，4℃保存5. 1. 191XTE缓冲液:量取1 mol/T. Tris-HCl 缓冲液(5. 1. 14)5 mI. 和 0. 5 mol/ I. EDTA(5. 1. 15)1mL溶液]-500mL烧杯中，向烧杯中加人400m光菌双蒸水均匀混合，用无菌双蒸水定容到500mL后,高温高压成菌，室温保存
5.1.2050×TAE电泳缓冲液：称取242gTris碱(5.1.1),量取57.1ml乙酸（5.1.13)，量取1n0mL0.5 mol/L FDTA(5.1. 15),用无菌双蒸水楚容至垒 11.。5.1.211×TAE电泳缓冲液：取50×TAE电冰缓冲液（5.1.20）20mL，用无菌双蒸水定容至1L5.1.22琼脂瓣，电泳级
5.1.230.8%琼脂糖：称取0.8g琼脂糖到三角瓶中，加人1×TAE电泳缓冲液(5.1.21)100ml.,加热牟完全溶解。
5.2生化试剂
5. 2. 1RNA 酶
限制性内划酶EcoRI.
限制性内切酶MseI。
MsI接头序列.5＇GAXGAIGAGTCCTGAG3',3'-TACICAGGACICAT-5';EcRI接头5.2.4
F列:5'-CTCGTAGACTGXGTACC3',3'-CATCTGACGCATGGTTAA 5'5.2.5T4 DNA连接酶。
引物：顶扩增引物选择性扩增引物(参见附录A)。5.2.7
Tan DNA 聚合酶。
脱试核芒三磷酸（dNTP=）。
DL2000;DNA标准分子量，
小分厂量pUC19DNA/MspI:DNA标准分子量。5. 2. 10
5.2.1110×PCR反应缓冲液：500mmol/LKCl.100tmmol/LTris·Cl,在25℃下，p9.0,1.0%Triuon X l0o.
5.3点样及制胶试剂
甲酰胺(CHNO.CAS：75-12-7)。
甲苯苯胺(CHzN,NA0S,CAS:265017 -1)。溴蓝(CHμBr:(0,S,CAS:115 39 -9)。硼酸(H,BO;.CAS: 10043 -35-3)。丙烯酰胺(CH,=CHCONHI2:CAS:79 -06 -1)双丙烯酰胺（V.N°亚甲基双丙烯酰胺，C,HlcNzO,CAS:110269）。过硫酸铵[(NH,),SO,CAS:7727-54:0]。尿素[CO(NH,)2,CAS:5713-6],超级纯,NY/T2174—2012
N,N,N,N*-四甲基乙-胺_TEMED,(CH,)2NCH,CH,N(CI1,),CAS:51 - 672]。2XAFIP上样缓冲液：敢980μL甲酰胺(5.3.1).2μL0.5mol/LEDTA(5.1.15),0.1μL—甲苯苯胺(5.3.2),0.1mg漠酚蓝(5.3.3),用无菌双蒸水定容1mL。5.3. 1110XTBE:称取108g Tris碱(5. 1. 1)和 55翻酸(5.3. 4),加人 0.5mol/1. FDTA(pII8. 0)40 mL,用无菌双蒸水定容至1L
5.3.1240%丙烯酰胺：分别称取内烯酰胺(5.3.5)76g和双丙烯酰胺（5.3.6)4.0g.加150mL无双蒸水，37℃溶解后，定容至200ml，5.3.1310%过硫酸铵：1g过硫酸铵(5.3.7),加无菌双蒸水定窄至10tnL-4℃条件下避光保存。5.3.146%聚丙烯酰胺凝胶：称取42g尿索（5.3.8）.加人30ml.无菌双蒸水.加热溶解并置于冰浴中，加人11ml.的10×TBE（5.3.11),15mL的40%丙烯酰胺（5.3.12),1.33ml.的10%过硫酸铵(5.3.13)混勾后用无菌双蒸水定窄至100ml-。该游液在4℃条件下，可保存数周。5.4处理玻璃板试剂
反硅烷化试剂。
亲和硅烷。
无水乙醇(CH,0,CAS,64 17 5)a
银染试剂
醇(CII,OII,CAS: 67 - 56 - 1)。硝酸银（AgNO.CAS：7761-88-8)5.5.3甲醛(CH20,CAS;50 00 0).5.5.4
碳酸钠(NazCO,CAS;497198)。
硫代硫酸钠(NazSO，CAS:7772-987)。5.5.6
固定溶液：量取200ml,单醇（5.4.1)和100mL乙酸（5.1.13),用无菌双蒸水定穿至1L。染色液：1g硝酸银（5.5.2），37%甲醛（5.5.3)1.5ml.，用无菌双蒸水定窄至1L品影液：称取60碳酸钠（5.5.4），溶解于2l.无菌双蒸水，使用前加人37为甲醛3.0mL，10g/1.硫代硫酸钠（5.5.5)溶液400L6仪器和设备
梯度PCR扩增仪。Www.bzxZ.net
紫外分光光度计。
多功能电泳仪。
DNA序列分析电泳槽。
NY/T2174—2012
高冷冻离心机。
6.6移液枪。
高压灭菌锅。
鉴定步骤
样品DNA提取
采集0.4g~0.5g新鲜嫩叶，在液氮中研磨成细粉洙。将研磨后的细粉沫转至2ml.的离心管中。加人600μl.65℃预热的（FAB提取缓冲液（5.1.17），混匀。在65℃水浴中温育1h～2h。分别用600μ1.的酚：氯仿：异戊醇（5.1.18)和氯仿：异戊醇（5.1.16>抛提。离心收集上清液到光菌的离心管中。用等体积的异丙醇（5.1.11)和1/10体积的3mal/L醋酸钠（pI[5.2)(5.1.12)沉淀DNA。离心收集LNA，并在室温下晾干。用70%的酒精洗盐。加入10CμI.TE缓冲液（5.1.19），完全济解DNA。加入10μI.RVA酶(10ag/μL)(5.2.1)并于37℃水浴中温育1h。用紫外分光光度度计(6.2)测定DNA的浓度，在0.8%的琼脂糖胶（5.1.23)上电泳，检测DNA的质量。DNA保存在一20℃冰箱。7.2AFIP反应
鉴定所沙及的接头和引物参见附录A。7.2.1模板DNA的双酶切
每个DNA样品按照12 μl.的DNA(25ng/μL)、0.5μL的Eco RI(20 U/μL)<5.2.2)、0. 5 μL的Mse1(10U/μL)(5.2.3）、2.5uL的10×EcR1酶切缓冲液、9.5L的无菌双蒸水组分混合，总休积为25。进行EcoR1和MseI的双酶切，37℃保温酶切2h，70℃保温15min以终止反应，冰上放置，短暂离心收集于管底并保存在一20℃冰箱。7.2.2DNA片段和接头的连接
酶切完全后的DNA片段与EcoRI和MseT接头（5.2.4)迹行连接反应，并按10uL的DNA双酶切反应液、5μI的EcoRI接头(10μmol/L)、5μl.的MseI接头(10rol/L)、2.5μ.的10×连接缓冲液、1μL的T4DNA连接悔（5.2.5）、1.5ul.的无菌双蒸水组分泥合，每个样品反应的总体积为25μL于16℃条件下过夜(15h）连接。取连接产物10μL.按1：5的比例用1×TF缓冲液（5.1.19)稀释后用片预扩增反应。其余连接反应液保存在一20℃冰箱。7.2.3AFI,P预扩增反应
按2.5ul.的1*5稀释的连接反应液、1uI.的预扩增引物E(100g/μL）、1μL的预扩增引物M(100ng/μL）、0.2μL的TagDNA聚个酶（5.2.7)（5L/μL）、4pL的氯化镁（25mmol/L),2.5μL的10×PCR反成缓冲液（5.2.11)、2l的dNTPs(5.2.8)（2.5mmol/1.）、11.8μL的无菌双蒸水组分混合，反应体积为25叫l反应件：94℃预变性5min：94℃变性30s，56℃退火60s.72℃延伸60s，共25个循环。预扩增反应后，取51I.预扩增产物进行0.8%的琼脂糖（5.1.23)电泳，检测预扩增效果。另取3μ.反成产物按1：50比例用1×TE缓冲液（5.1.19)稀释作为选择性扩增反应模板。其余产物保存在—20%冰箱
7.2.4AFLP选择性扩增反应
取经150比例稀释的预扩增物5μ.作为选择性扩增的DNA模板，加人1=I的选择性引物(5.2.6)E(100 ng/L),1μl.的选择性物M(100ng/μl)、2L的dNTP(5.2.8)(2. 5mInol/L)、0.3μL的TagDNA聚合酶(5.2.7)(5U/uL),1. 5μl.的氯化（25mm/L）2.0μl.的10XFCR反缓冲液、7.2L的无菌双蒸水纠分混合，反应体积为20μL。采用梯度PCR方汰，其反应条件为：起始反应温度94℃变性60%，68%退火30S，72℃延仲60s以后每个循环4的退火温度逐次降低1℃，经13个循环后降至56℃，其余条件不变，再进行23个循环。7.2.5AFLP选择性扩增反应产物电泳7.2.5.1玻璃板处理
NY/T 2174—2012
用0.1mol/1.的氧氧化钠(5.1.4)处理玻璃板1h，并清洗，然后白来水冲洗。用洗洁剂清洗，然店分别用白米水和无离子水冲洗干净。玻璃板放置50℃条件下烘干。用无水乙醇去除玻璃板上所有可见的污斑，并凉下，在带耳的玻璃板面用反硅烷化试剂（5.4.1)处理（用擦镜纸涂），并凉干（必要时在一小角作记号）。在另一板玻璃板的面用亲和硅烷（5.4.2)处理，方达同上。干后，用去离子水冲洗，再用无水乙醇（5.4.3)处理。将经亲和硅烷处理的玻璃板面向上，在两边放上边条，然后将带.耳的经反硅烷化试剂处理的玻璃板面向下叠好，再用医用宽胶带将玻璃板的两边和底端封好，并夹上夹子。7.2.5.2制胶
取60mL的6%聚丙烯酰胺凝胶（5.3.14）于200m烧杯中，加人800ul.的10%过硫酸铵（5,3.13),40L的二甲苯苯胺（5.3.2），迅速混匀。将玻璃板倾斜成15°，并把溶液从玻璃板的一边灌人，直至灌满，并插人梳子（注：对于尖头梳子，先以平端摘入0.5cm左右）。让胶聚合2.5h，案合后，用无离子水清洗玻璃板。
7.2.5.3样品处理
取3uI.AFLP选择性产物与等体积的2×AFLP上样缓冲液（5.3.10)混合后，95℃条件变性5min，并迅速放置冰上冷却。小分子量pUC19DNA/MspI(5.2.10)也作同样处理，7.2.5.4电泳
预电泳：使用DNA序列分析电泳槽和多功能电泳仪，以1500V、50W（上槽800mL1×TBE，下1000mL1×IBE>电泳30min~40min。待温度达55℃时断电，开始点样。先用枪头冲洗点样孔，并开始点样。电泳：电压1500V，功率50W条件下电泳2h，直到前沿染料至玻璃板末端1cm~1.5cr1为止。电泳结束后15min.从电泳槽上拆下玻璃板，并川无离子水将玻璃板擦干净。7.2.5.5银染
固定：将带胶的玻璃板（胶面向上)放在2L的固定溶液（5.5.6)中固定20min。洗涤：分别用21.的无离子水洗涤带胶的玻璃板3次，每次5min。染色：将带胶的玻璃板（胶面向上）在2L染色液（5.5.7）中，充分振荡45min用超纯水洗胶9s显影：在2L的显影液（5.5.8）中，充分搬荡，卢至所有带山现。在固定液中终止显影，并在无离广水中漂洗。室温条件下，将玻璃板垂直放置过夜，凉十后，进行图像扫描并记录数据，读带范围为50bp～330bp，8结果计算
数据记录
根据AFLI选择性扩增产物范围的主条带有或无分别赋值，有带的记为1，无带的记为0。8.2
遗传相似系数计算
供检品种与真实品种间遗传相似系数按式(1)算2N
Gs=N+'Ny
式中：
为供检品种与真实品种间的遗传相似系数；N：真实品种的总条带数
N，供检品种y的总条带数：
N，—代表两个格种共有的条带数。9鉴定规则
遗传相似系数为0.99～1.供检品种是真实品种，遗传机似系数小J0.99，供检品种不足真实品种5
NY/T2174—2012
热带作物品种
杜花悦
限制性内切酶
EcrRI/Mse1
EroR I/Mre I
附录A
【资料性附录】
热带作物品种DNA分子鉴定所用接头和引物接头
EeuR I/Mse I 接头
EcoR/Msp接头
EcR I/Mse I
EenRI/MseI
EcuR I/Mse I
EcaR 1/Mse T
EenR I/Mse I
FreR I/Mse I 接头
FrnRI/MeI接头
EroRI/MseI接头
EcaR I/Mse I 接头
FrnR I/Mse 1 接头
预扩增引物对
EonRI- A/Mse [- C
EcuR1-A/Mse I C
EcoR1- A/Mse I-C
EeoR 1 A/Mse I-C
FtuRI - A/Mse I- C
FcuR 1-A/Me I C
EcaR I - 0/Mse I- 0
选择性扩增引物对
E- AG/M-CAA
E- TG/M : CIG
E- ACA/M-CAT
E- ACT/M CTT
E AAC/M-CTO
F- ACC/M-CAT
F ACT/M-CTT
E- ACC/M-CAT
E- ACC/M-CAG
E ACT/M CAT
E-ACA/M-CAA
E- AGG/M-CFT
E-ACC/M-CTC
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中华人民共和国农业行业标准
NY/T 2174—2012
主要热带作物品种AFLP分子
鉴定技术规程
Technical code for identifying main tropical crops varieties withAFLP molecular markers
2012-06-06发布
2012-09-01实施
中华人民共和国农业部
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部农垦局提出。言
本标滩中农业部热帮作物及制品标准化技术委员会归口。NY/T2174—2012
本标准起草单位：中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，中国热带农业科学院热带牛物技术研究所、中国热带农业科学院南亚热带作物研究所、中国热带农业科学院橡胶研究所。本标准主要起草人：邹冬梅、蒋耳顺、灵坤鑫、雷新涛、曾霞。1范围
NY/T2174—2012
主要热带作物品种AFLP分子鉴定技术规程本标准规定了主要热带作物品种AFLI分子鉴定的术语和定义、试剂和材料、仪器和设备、鉴定步骤、结果计算和鉴定规则。
本标准适用于橡胶（Hewa brusitiensis Muell-Arg）芒果（Mangifera indiczIinn.）荔枝（Litchzchinensis Sonn.)龙眼(Dimocurpus tongana Lour.香蕉(Musa nana Lour.)木薯(Murihut escutenlaCrants）、柱花草（StytosanthesSW.）的品种AFLP分子鉴定；也可作为其他热带作物品种AFLP分子鉴定参考。
2规范性引用文件
下列文件对丁本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注口期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义
下列术和定义适用丁本文件。
遗传相似性genetic similarity供检品种与真实品种间在DNA分子遗传上的一致性程度，用遗传相似系数表示。4原理
根据不同热带作物品种基因组DNA存在差异，基因组DNA经限制性内切酶双酶切后分别连上特定的接头，再进行预护增和选择性扩增；出于选择性基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性，贝只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才训以被扩增；扩增产物经聚丙烯酰腰凝胶电泳分离，然后根据凝胶I:INA指纹的有无求鉴定品种间的差异。5试剂与材料
除非另有说明外，在分析中仪使用确认为分析纯试剂。水为GB/T6682规定的无菌双蒸水或纯度与之相当的水。
5.1样品DNA提取试剂
5.1.1三羟甲基氨基甲烷(Tris,NHC(CH:OH),CAS:77-86 1)。5. 1.2氯化氢(HC1,CAS:7647-01-0)。5.1.3乙二胺四乙酸_钠(EDTA Na·21O,CnHraNNazO:+2H2O,CAS:638192 6)5.1.4
氢氧化钠（NaOII,CAS:1310-73-2)。5.1.5
氯仿(CTICI,CAS:67-66-3)。
异戊醇(C,I,O,CAS:123-51 3)。5.1.7
十烷基三甲基漠化铵(CTABCH（CHa）,NBr,CAS：57-09-0)。氯化钠(NaC1,CAS:7647-115)。
NY/T2174—2012
5. 1. 93 巯基乙醇(β-Mercaptocthaiiol,C,H.OS,CAS:60-24 2)。(CTI,O,CAS:108952)
5. 1. 11异两醇(C,H:O,CAS:67-63 -0)。醋酸钠(CHI,O0Na,CAS:127-Q9-3)5. 1.12
Z较(CHO2,CAS:64- 1 -7).
5. 1. 141mol/1. Tris-II(l(pII8. 0):在80 ml.无菌双蒸水中溶解12.11 g Tris(5.1. 1)加人 1. 2 ml,浓HCl(5.1.2)调节pH牵8.0(溶液冷至室温后，最后调定II)，用光菌双蒸水定容至100mL5.1.150.5mol/IEDTA（pH8.0)：在80ml.无菌双蒸水中加入18.61g乙一胺四乙酸钠（5.1.3)，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用氢氧化钠(5.1.4)调节溶液的pII至8.0（约需2氢氧化钠）然后用无菌双蒸水定容至100mL。
5.1.16氯仿：异戊醇（24：1)：先加960mL氯仿（5.1.5），再圳40ml异戊醇（5.1.6），混合均匀，保在探色坡璃瓶中，4℃保存。
5. 1. 17CTAB提取缓冲液：称取4g CTAB(5.1. 7)和 16. 361g NaCI(5. 1. 8),量取1 mol/L Tris-HCl（5.1.14)20mL和0.5mol/LEDTA(5.1.15)8mL.先用70mL无菌双热水溶解，再定容至200mL火菌、冷却后，加人0.2%β统基乙醇（5.J.9)400u1.和氯仿：异戊醇（5.1.16）：100mL，摇勾即可。5.1.18苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1)：将饱和举酚（5.1.10)与等体积的氯伤：戊醇（24：1）(5.1.16)混合均勺，保存在棕色玻璃瓶中，4℃保存5. 1. 191XTE缓冲液:量取1 mol/T. Tris-HCl 缓冲液(5. 1. 14)5 mI. 和 0. 5 mol/ I. EDTA(5. 1. 15)1mL溶液]-500mL烧杯中，向烧杯中加人400m光菌双蒸水均匀混合，用无菌双蒸水定容到500mL后,高温高压成菌，室温保存
5.1.2050×TAE电泳缓冲液：称取242gTris碱(5.1.1),量取57.1ml乙酸（5.1.13)，量取1n0mL0.5 mol/L FDTA(5.1. 15),用无菌双蒸水楚容至垒 11.。5.1.211×TAE电泳缓冲液：取50×TAE电冰缓冲液（5.1.20）20mL，用无菌双蒸水定容至1L5.1.22琼脂瓣，电泳级
5.1.230.8%琼脂糖：称取0.8g琼脂糖到三角瓶中，加人1×TAE电泳缓冲液(5.1.21)100ml.,加热牟完全溶解。
5.2生化试剂
5. 2. 1RNA 酶
限制性内划酶EcoRI.
限制性内切酶MseI。
MsI接头序列.5＇GAXGAIGAGTCCTGAG3',3'-TACICAGGACICAT-5';EcRI接头5.2.4
F列:5'-CTCGTAGACTGXGTACC3',3'-CATCTGACGCATGGTTAA 5'5.2.5T4 DNA连接酶。
引物：顶扩增引物选择性扩增引物(参见附录A)。5.2.7
Tan DNA 聚合酶。
脱试核芒三磷酸（dNTP=）。
DL2000;DNA标准分子量，
小分厂量pUC19DNA/MspI:DNA标准分子量。5. 2. 10
5.2.1110×PCR反应缓冲液：500mmol/LKCl.100tmmol/LTris·Cl,在25℃下，p9.0,1.0%Triuon X l0o.
5.3点样及制胶试剂
甲酰胺(CHNO.CAS：75-12-7)。
甲苯苯胺(CHzN,NA0S,CAS:265017 -1)。溴蓝(CHμBr:(0,S,CAS:115 39 -9)。硼酸(H,BO;.CAS: 10043 -35-3)。丙烯酰胺(CH,=CHCONHI2:CAS:79 -06 -1)双丙烯酰胺（V.N°亚甲基双丙烯酰胺，C,HlcNzO,CAS:110269）。过硫酸铵[(NH,),SO,CAS:7727-54:0]。尿素[CO(NH,)2,CAS:5713-6],超级纯,NY/T2174—2012
N,N,N,N*-四甲基乙-胺_TEMED,(CH,)2NCH,CH,N(CI1,),CAS:51 - 672]。2XAFIP上样缓冲液：敢980μL甲酰胺(5.3.1).2μL0.5mol/LEDTA(5.1.15),0.1μL—甲苯苯胺(5.3.2),0.1mg漠酚蓝(5.3.3),用无菌双蒸水定容1mL。5.3. 1110XTBE:称取108g Tris碱(5. 1. 1)和 55翻酸(5.3. 4),加人 0.5mol/1. FDTA(pII8. 0)40 mL,用无菌双蒸水定容至1L
5.3.1240%丙烯酰胺：分别称取内烯酰胺(5.3.5)76g和双丙烯酰胺（5.3.6)4.0g.加150mL无双蒸水，37℃溶解后，定容至200ml，5.3.1310%过硫酸铵：1g过硫酸铵(5.3.7),加无菌双蒸水定窄至10tnL-4℃条件下避光保存。5.3.146%聚丙烯酰胺凝胶：称取42g尿索（5.3.8）.加人30ml.无菌双蒸水.加热溶解并置于冰浴中，加人11ml.的10×TBE（5.3.11),15mL的40%丙烯酰胺（5.3.12),1.33ml.的10%过硫酸铵(5.3.13)混勾后用无菌双蒸水定窄至100ml-。该游液在4℃条件下，可保存数周。5.4处理玻璃板试剂
反硅烷化试剂。
亲和硅烷。
无水乙醇(CH,0,CAS,64 17 5)a
银染试剂
醇(CII,OII,CAS: 67 - 56 - 1)。硝酸银（AgNO.CAS：7761-88-8)5.5.3甲醛(CH20,CAS;50 00 0).5.5.4
碳酸钠(NazCO,CAS;497198)。
硫代硫酸钠(NazSO，CAS:7772-987)。5.5.6
固定溶液：量取200ml,单醇（5.4.1)和100mL乙酸（5.1.13),用无菌双蒸水定穿至1L。染色液：1g硝酸银（5.5.2），37%甲醛（5.5.3)1.5ml.，用无菌双蒸水定窄至1L品影液：称取60碳酸钠（5.5.4），溶解于2l.无菌双蒸水，使用前加人37为甲醛3.0mL，10g/1.硫代硫酸钠（5.5.5)溶液400L6仪器和设备
梯度PCR扩增仪。Www.bzxZ.net
紫外分光光度计。
多功能电泳仪。
DNA序列分析电泳槽。
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高冷冻离心机。
6.6移液枪。
高压灭菌锅。
鉴定步骤
样品DNA提取
采集0.4g~0.5g新鲜嫩叶，在液氮中研磨成细粉洙。将研磨后的细粉沫转至2ml.的离心管中。加人600μl.65℃预热的（FAB提取缓冲液（5.1.17），混匀。在65℃水浴中温育1h～2h。分别用600μ1.的酚：氯仿：异戊醇（5.1.18)和氯仿：异戊醇（5.1.16>抛提。离心收集上清液到光菌的离心管中。用等体积的异丙醇（5.1.11)和1/10体积的3mal/L醋酸钠（pI[5.2)(5.1.12)沉淀DNA。离心收集LNA，并在室温下晾干。用70%的酒精洗盐。加入10CμI.TE缓冲液（5.1.19），完全济解DNA。加入10μI.RVA酶(10ag/μL)(5.2.1)并于37℃水浴中温育1h。用紫外分光光度度计(6.2)测定DNA的浓度，在0.8%的琼脂糖胶（5.1.23)上电泳，检测DNA的质量。DNA保存在一20℃冰箱。7.2AFIP反应
鉴定所沙及的接头和引物参见附录A。7.2.1模板DNA的双酶切
每个DNA样品按照12 μl.的DNA(25ng/μL)、0.5μL的Eco RI(20 U/μL)<5.2.2)、0. 5 μL的Mse1(10U/μL)(5.2.3）、2.5uL的10×EcR1酶切缓冲液、9.5L的无菌双蒸水组分混合，总休积为25。进行EcoR1和MseI的双酶切，37℃保温酶切2h，70℃保温15min以终止反应，冰上放置，短暂离心收集于管底并保存在一20℃冰箱。7.2.2DNA片段和接头的连接
酶切完全后的DNA片段与EcoRI和MseT接头（5.2.4)迹行连接反应，并按10uL的DNA双酶切反应液、5μI的EcoRI接头(10μmol/L)、5μl.的MseI接头(10rol/L)、2.5μ.的10×连接缓冲液、1μL的T4DNA连接悔（5.2.5）、1.5ul.的无菌双蒸水组分泥合，每个样品反应的总体积为25μL于16℃条件下过夜(15h）连接。取连接产物10μL.按1：5的比例用1×TF缓冲液（5.1.19)稀释后用片预扩增反应。其余连接反应液保存在一20℃冰箱。7.2.3AFI,P预扩增反应
按2.5ul.的1*5稀释的连接反应液、1uI.的预扩增引物E(100g/μL）、1μL的预扩增引物M(100ng/μL）、0.2μL的TagDNA聚个酶（5.2.7)（5L/μL）、4pL的氯化镁（25mmol/L),2.5μL的10×PCR反成缓冲液（5.2.11)、2l的dNTPs(5.2.8)（2.5mmol/1.）、11.8μL的无菌双蒸水组分混合，反应体积为25叫l反应件：94℃预变性5min：94℃变性30s，56℃退火60s.72℃延伸60s，共25个循环。预扩增反应后，取51I.预扩增产物进行0.8%的琼脂糖（5.1.23)电泳，检测预扩增效果。另取3μ.反成产物按1：50比例用1×TE缓冲液（5.1.19)稀释作为选择性扩增反应模板。其余产物保存在—20%冰箱
7.2.4AFLP选择性扩增反应
取经150比例稀释的预扩增物5μ.作为选择性扩增的DNA模板，加人1=I的选择性引物(5.2.6)E(100 ng/L),1μl.的选择性物M(100ng/μl)、2L的dNTP(5.2.8)(2. 5mInol/L)、0.3μL的TagDNA聚合酶(5.2.7)(5U/uL),1. 5μl.的氯化（25mm/L）2.0μl.的10XFCR反缓冲液、7.2L的无菌双蒸水纠分混合，反应体积为20μL。采用梯度PCR方汰，其反应条件为：起始反应温度94℃变性60%，68%退火30S，72℃延仲60s以后每个循环4的退火温度逐次降低1℃，经13个循环后降至56℃，其余条件不变，再进行23个循环。7.2.5AFLP选择性扩增反应产物电泳7.2.5.1玻璃板处理
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用0.1mol/1.的氧氧化钠(5.1.4)处理玻璃板1h，并清洗，然后白来水冲洗。用洗洁剂清洗，然店分别用白米水和无离子水冲洗干净。玻璃板放置50℃条件下烘干。用无水乙醇去除玻璃板上所有可见的污斑，并凉下，在带耳的玻璃板面用反硅烷化试剂（5.4.1)处理（用擦镜纸涂），并凉干（必要时在一小角作记号）。在另一板玻璃板的面用亲和硅烷（5.4.2)处理，方达同上。干后，用去离子水冲洗，再用无水乙醇（5.4.3)处理。将经亲和硅烷处理的玻璃板面向上，在两边放上边条，然后将带.耳的经反硅烷化试剂处理的玻璃板面向下叠好，再用医用宽胶带将玻璃板的两边和底端封好，并夹上夹子。7.2.5.2制胶
取60mL的6%聚丙烯酰胺凝胶（5.3.14）于200m烧杯中，加人800ul.的10%过硫酸铵（5,3.13),40L的二甲苯苯胺（5.3.2），迅速混匀。将玻璃板倾斜成15°，并把溶液从玻璃板的一边灌人，直至灌满，并插人梳子（注：对于尖头梳子，先以平端摘入0.5cm左右）。让胶聚合2.5h，案合后，用无离子水清洗玻璃板。
7.2.5.3样品处理
取3uI.AFLP选择性产物与等体积的2×AFLP上样缓冲液（5.3.10)混合后，95℃条件变性5min，并迅速放置冰上冷却。小分子量pUC19DNA/MspI(5.2.10)也作同样处理，7.2.5.4电泳
预电泳：使用DNA序列分析电泳槽和多功能电泳仪，以1500V、50W（上槽800mL1×TBE，下1000mL1×IBE>电泳30min~40min。待温度达55℃时断电，开始点样。先用枪头冲洗点样孔，并开始点样。电泳：电压1500V，功率50W条件下电泳2h，直到前沿染料至玻璃板末端1cm~1.5cr1为止。电泳结束后15min.从电泳槽上拆下玻璃板，并川无离子水将玻璃板擦干净。7.2.5.5银染
固定：将带胶的玻璃板（胶面向上)放在2L的固定溶液（5.5.6)中固定20min。洗涤：分别用21.的无离子水洗涤带胶的玻璃板3次，每次5min。染色：将带胶的玻璃板（胶面向上）在2L染色液（5.5.7）中，充分振荡45min用超纯水洗胶9s显影：在2L的显影液（5.5.8）中，充分搬荡，卢至所有带山现。在固定液中终止显影，并在无离广水中漂洗。室温条件下，将玻璃板垂直放置过夜，凉十后，进行图像扫描并记录数据，读带范围为50bp～330bp，8结果计算
数据记录
根据AFLI选择性扩增产物范围的主条带有或无分别赋值，有带的记为1，无带的记为0。8.2
遗传相似系数计算
供检品种与真实品种间遗传相似系数按式(1)算2N
Gs=N+'Ny
式中：
为供检品种与真实品种间的遗传相似系数；N：真实品种的总条带数
N，供检品种y的总条带数：
N，—代表两个格种共有的条带数。9鉴定规则
遗传相似系数为0.99～1.供检品种是真实品种，遗传机似系数小J0.99，供检品种不足真实品种5
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热带作物品种
杜花悦
限制性内切酶
EcrRI/Mse1
EroR I/Mre I
附录A
【资料性附录】
热带作物品种DNA分子鉴定所用接头和引物接头
EeuR I/Mse I 接头
EcoR/Msp接头
EcR I/Mse I
EenRI/MseI
EcuR I/Mse I
EcaR 1/Mse T
EenR I/Mse I
FreR I/Mse I 接头
FrnRI/MeI接头
EroRI/MseI接头
EcaR I/Mse I 接头
FrnR I/Mse 1 接头
预扩增引物对
EonRI- A/Mse [- C
EcuR1-A/Mse I C
EcoR1- A/Mse I-C
EeoR 1 A/Mse I-C
FtuRI - A/Mse I- C
FcuR 1-A/Me I C
EcaR I - 0/Mse I- 0
选择性扩增引物对
E- AG/M-CAA
E- TG/M : CIG
E- ACA/M-CAT
E- ACT/M CTT
E AAC/M-CTO
F- ACC/M-CAT
F ACT/M-CTT
E- ACC/M-CAT
E- ACC/M-CAG
E ACT/M CAT
E-ACA/M-CAA
E- AGG/M-CFT
E-ACC/M-CTC
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