NY/T 2281-2012
基本信息
标准号： NY/T 2281-2012
中文名称：苹果病毒检测技术规范
标准类别：农业行业标准(NY)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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标准简介
NY/T 2281-2012 苹果病毒检测技术规范
NY/T2281-2012
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标准内容
ICS 65.020
中华人民共和国农业行业标准
NY/T2281-2012
苹果病毒检测技术规范
Protocol for the detection of apple viruses2012-12-24发布
2013-03-01实施
中华人民共和国农业部
本标准按照GB/T1.1给比的规则起草，本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国果品标准化技术委员会（SAC/TC5IO)山口。NY/T2281—2012
本标准起草单位：中国农业科学院果树研究所、农业部果品及木质量监督检验测试中心（兴城）。本标准主要起草人：董雅风、张尊平、范旭东、任芳、聂继云。T
1范围
苹果病毒检测技术规范
本标准规定了苹果病毒检测的抽样与取样要求、检测方法、判定原则。NY/T 2281—2012
本标准适用于苹果无病毒母本树、无病毒苗木及苹果植株的苹果花叶病毒（Aplemosazczirus：ApMV）、苹果褪绿叶斑病毒（Applechlorouicteaf'spotvirus，ACLSV）、苹果茎痘病毒（ApptestempittingvirusASPV）、苹果茎沟病毒（Applestemgruouingvirus，ASGV），苹果锈果类病毒（Applescarshin viruid,ASSVd)的检测。
2抽样与制样
2.1抽样
2.1.1无病毒母本树
每株均需检测。
2.1.2无病毒苗木
分品种进行抽样。采取随机抽样方法。以666.7m抽检10株为基数，每增加666.7m,增检5株，不足666.7m的按666.7m2计。2.1.3苹果植株
对疑似感病的植株每株必检。
2.2制样
2.2.1木本指示植物检测
温空检测时，早春从待检的苹果植株上取·-年生芽嫁接到特定指示植物上。日问检测时，夏末秋初取待检植株离皮绿枝进行芽接。2.2.2ELISA和KT-PCR检测
春季取待检苹果植上幼嫩新鲜叶片；或冬季取休眠枝条的韧皮部组织。3检测方法
3.1田间症状观寒法
检测刘象为苹果锈果类病毒和苹果花叶病毒，用简首接观察其症状表现（参见附录）3.2木本指示植物检测法
包括温室检测和田间检测。
检测对象为苹果褪绿叶斑病毒、苹果茎症病毒、苹果茎沟病毒、苹果花叫病毒和苹果锈果类病，具体操作参见附录B。
3.3酶联免疫吸附法(ELISA)
检测对象为苹果褪绿叶斑病葬、苹果茎痘病毒、苹果茎沟病毒和苹果花叶病毒，具体操炸参见附录C
3.4反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)检测对象为苄果褪绿叶斑病毒、芒果茎痘病毒、苹果菌沟病毒、苹果花叫病毒和苹果锈果类病毒，具体操作参,见附录 D
NY/T 2281—2012
4判定规则
根据附录A～附录D的要求进行检测和判定，如1果一个样品采用了2种以上检测方法，且检测结果不--敛，则以阳性结果为推，判定为带毒，1苹果无病毒母本树
检出携带主要检测对象中的任何一种病毒/类病毒,该母本树即判定为不合格4.2
苹果无病毒苗木
检出某株苗木携带主要检测对象中的任何一种病毒/类病毒，即判定该批苗木不合格。需要检测的苹果植株
检出带主要检测对象中的仁何-种柄毒/类病毒，则判定该株苹果带，附录A
(资料性附录】
2种非潜隐性病毒病的要田间症状见表 A.1表 A. 1 2 种非潜隐性病毒病的主要田间症状病毒及类病毒
苹果花叶病蒂
苹果锈果类病毒
症状类型
锈果型
花脸难
锈果-花脸复合型
斑驳型
环斑型
花叶型
条斑型
镀边型
症状表现
NY/T2281—2012
先从幼果顶部出现淡绿色水渍状斑块.而后向果梗部护展成木栓化锈斑与纵纹-随果实生长而发生龟裂
果实着色后.病果果面显现红绿相问的不规则色斑.垦花脸状呈现既布锈斑义有花脸的复合症状从小计脉开始发生:鲜黄色或黄白色病斑,病斑形状不娩侧,大小不一,边缘清晰
叶片上产生圆形、椭形或近圆形货色环斑，或近似环状的斑纹病斑不规则，有较大的深绿与浅绿相间色变，边缘不清晰叶片沿叶脉失绿黄化，并乾延至附近的叶肉组织.呈黄色条斑或网纹状叶片边缘发生黄化,形成很窄的黄色镶边3
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B.1温室检测法
B.1.1砧木准备
附录B
【资料性附录]
木本指示植物检测法
温室检测：早存，将上年播种的实生砧苗移栽于直径15cm.高25cm的花益中，每个花盆裁植1株，将花盆移人温室内。温室温度白天控制在20℃~28℃、夜问 9℃~15℃。B.1.2、嫁接
温室检测：砧木开始萌发后，先用嵌芽接法将1个待捡芽嫁接在砧木基部，再用划接法在该芽上方5cm处嫁接指示植物接穗（带2个～3个饱满芽），每个样品嫁接4株。B.1.3嫁接后管理
温案检测：嫁接后，将温室温度控制在18℃-~26℃，适时浇水、防治害虫和剪除砧木萌檗。符指示植物长出嫩叶后，每周观察一，记载症状表现B.1.4结果判断
所嫁接的4株中只要有1株现表B.1规定的典型症状，即判定该样品携带相应的苹果病毒。表B.1苹果病毒斑类病毒在水本指示植物上的主要症状病毒及类病毒
苹果褪绿叶斑病毒
苹果茎痘病森
苹果茎沟病毒
苹果花叶病毒
苹果锈果类病毒
B.2由间检测法
B.2.1砧木准备
指示植物
苏俄节果(R12740-7A)
光辉(RHdianL)
弗吉尼业小苹果（Virginia crab）兰注王(Lord lanbourne)
国光（Ralls）
指示植物症状
褪绿叶斑，植株矮化，舟形叶
叶片反卷，植株矮化
木质部产止纵向叫陷条沟;有的病株嫁接周[肿胀,接合部内有深褐色坏死斑纹；温室鉴定中叫片有时产生黄斑或环形斑，并扭曲变形
叶片上产亚黄斑,沿叶脉出现条斑紫中上部叶片向背面反卷、弯曲，叶片变小、易脱落，并在墓上产生不规则的木栓化锈斑
四间梭测：存季，挑选前一年播种的牛整齐一致的木实牛节，定植干检测圃内.株行距大于15 cmX60 cm.
B.2.2嫁接
田间检测：8月中句将待检株芽接在砧本基部，同时将指示植物芽嫁接在待检芽上方，两芽相聚1. 0 cm~2. 0 cm,每个样品嫁接 4株。B.2.3嫁接后管理
用间检测：第二年苗木发芽前，在指示植物接芽的上方1.cm~.1.5cm处剪除站下，及时除萌，同时加强肥水管理和病虫害防治,5月下旬开始，每周观察“次，记载症状衣现。B.2.4结果判断
所嫁接的4株中只要有1株呈现表B.1规定的典型症状，即判定该样品携带相应的苹果病毒。4
C.1原理
附录C
（资料性附录）
酶联免疫吸附检测法(ELISA)
NY/T 2281—2012
在固相支持物上（酶联板）包被病毒特异性抗体，加人待测样品后，再用悔标记的病毒抗休进行免疫认别,最后通过酶促化学反应检测病毒是否存在的一种血清学检测方法。C.2试剂
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馅水或去离子水或相当纯度的水；酶标抗体为碱性磷酸酶标记抗体。
C.2.1包被缓冲液（pH9.6）
Nazcos
溶于900mL蒸馏水中，搅拌至完全溶解，调节pI至9.6，定容至1000mL，C. 2. 2冲洗缓冲液(PST,PH7. 4)Na,HPO, - 12H,O
NaH2PO, ? 2H,0
Tween - 20
溶于900mL蒸馏水中，搅拌至完全落解，调节pH至7.4.定容至1000mlC.2.3抗原提取缓冲液
聚乙烯吡喀烷酮（PVP)
溶于100mL冲洗缓冲液(C.2.2)。C.2.4酶标抗体缓冲液
聚乙烯吡咯烷酮（VP)
牛血清H蛋H(BSA)
济于100ml冲洗缓冲液（C.2.2)。C.2.5底物缓冲液(pH9.8)
二乙醇胺
定容至100mL，月6MHCl调pH至9.8。C.2.6底物【现用现配】
在10mL底物缓冲液(C.2.4)中加10mg对硝基苯磷酸~钠盐（PNPP)。C.2.7终止液
先用少量蒸馏水溶解后，定容至100纽L。C.3仪器设备
C.3.1酶标检测仪。
NY/T 2281—-2012
C. 3. 2 酸度。
C. 3. 3 微量移液器:200 μl~1 L00 μL,20 μL--200 μl,10 μL,~100 μI.0. 5 μL~10 μLC.3.4电了天平：感量为0.01g和0.0001房。C. 3.5 冰箱。
C. 3. 6 恒温箱。
C.3.7离心机。
C.4分析步骤
FLISA检测方法可选择A蛋凸酶联免疫法(PAS-ELISA)或双抗心酶联免疫吸附法(DASEL.ISA)
C4.1A蛋白酶联免疫法(PAS-ELISA)C.4.1.1包被A蛋白
用包被缓冲液（C.2.1)稀释A蛋白至1μg/ml.5μg/mL，每孔加100μL，37℃保温2h，弃去孔中液体，用PBST(C.2.2)洗板3次~4次，每次加人PBST(C2.2)后静置3min~5min。C.4.1.2加第一抗血清
用PBST(C.2.2)将抗血清稀释至T作浓度,加人到微孔中，每孔加100μL，保温和洗板方法同C. 4. 1. 1.
C.4.1.3加抗原样品
取梨嫩叶或一年牛休眠枝条韧皮部，每1g样品加人5ml,~10ml.抗原提取缓冲液(C.2.3),研磨，4 000t/min离心5min。每个微孔板需同时设阳性、阴性和空白对照，每个样品加2个微孔，每个微孔加100ul.上清液，4℃冰籍中放置过夜。按C.4.1.1方法洗板，注意第一次洗板体不得溢出微孔。C.4.1.4加第二抗血清
用 PBST(C.2. 2)将抗血清(与第 -抗血清相同)稀释至工作浓度,加人到微孔中,每孔 10 μI,保温和洗板方法同℃、4.上、1，
C.4.1.5加酶标A蛋白
用PBST(C.2.2)将市售酶标A蛋白稀释至.T.作浓度，加人到微孔中，每孔100pL，保温和洗板方法同C. 4.1. 1。
C.4.1.6 加底物
每个微孔加10℃ml底物（C.2.6),黑暗叶宰温放置30min~120min，C.4.1.7终止反应
每个微孔加25μL终止液（C.2.7)。C.4.1.8结果判定
以空白对照调零，测定各微孔405nm吸光值。若待检样品2孔平均吸光值/阴性对照2孔平均吸光值2，则该样品为阳性，即携带所检病毒。C.4.2双抗夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)C.4.2.1加抗血清
用包被缓神冲被（2.1)将病毒特异抗血清IgG稀释至工作铱度，加人到微孔1,存孔100μL，37℃保温2 h,PBST(C.2、2)洗板3次~4次,每次加人PBST((. 2. 2)后静置 3 min~5min。C.4.2.2加抗原样品
方法向C.4.1.3。
C.4.2.3加酶标抗体
NY/T 2281—2012
用酶标抗体缓冲液（C.2.4)将碱性磷酸酶标记的特异抗血清IgG稀释至T.作浓度，加人到微孔中，每孔100μl..按C.4.2.1保温和洗板。C.4.2.4加底物
每个微孔加100μL底物（C.2.6),黑暗中室温放置15min～30min。C.4.2.5终止反应
每个微孔加25μL终止液（C.2.7)。C.4.2.6结果判定
方法同 C.4. 1. 8。
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D.1原理
附录D
（资料性附录）
反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法利用反转录酶将病毒RNA反转录为cDNA，并以耐热DNA聚合酶和一对引物（与待测目标核酸分子序列同源的DNA片段）通过高温（DNA分子变性）和低温（引物和目标核酸分子复兴并被耐热DNA聚合酶延仲)交替循环扩增待测目标核酸分子的方法，D.2试剂
D.2.1研磨缓冲液
硫氰酸胍
PVP-30
DEIC处理水定至50mI,4℃保存。用前加入2%偏重亚硫酸钠。D.2.2清洗缓冲液
10. 0 mM Tris-HCI
0.5 nM EDTA
DEPC处埋水定容250mL,4℃贮存，D.2.350×TAE缓冲液
冰乙酸
13.5 mI(或37.5mL 36%乙酸）
灭蒸馅水定容至 250 mL,pH 为 8.0,D.2.46×凝胶加样缓冲液
溴酚蓝
二甲苯青 FF
40%（W/V）蔗糖水溶液
灭菌然馏水定奔至50ml，4℃冰箱保存。13.3仪器设备
D.3. 1 PCR 仪。
D.3.2水平凝胶电泳仪，
D.3.3凝胶成像系统。
D. 3. 4 微量移液器:200 μL,~1 000 μL,20 μL~200 μL,10 μL~100 μL,0. 5 μL~10 μL。8
D.3.5电子天：感量为0.01g和0.0001gD.3.6高速冷冻离心机。
D.3.7无RNase的吸头和离心管。D.4操作步骤
D.4.1总RNA提取
采用二氧化硅极附法提取总RNA：NY/T 2281—2012
称取100mg待检材料放入塑料袋中，加人1mL研磨缓冲液（4.0mol/L硫氰酸胍，0.2mol/1a
醋酸钠，25mmol/LEDTA,1.0mol/L醋酸钾.2.5%PVP-40,2%偏重业硫酸钠）磨碎：b）取500μI.勾浆置于1.5mL消毒离心管中（先加人150uL10%N-lauruylsarcosine），70保温10min、冰中放置5min后，14000/min离心10min；取300μl..上清液，加人150L100%乙醇、300μl.6mol/L碘化钠、30μL10%硅悬浮液（pHc
2.0），率温下振荡20min；
d）6000r/min离心1min，充人上清，加人500μL清洗缓冲液（10.0mfnol/LTris-HCl,pf7.50.5nmol/LEDTA;50.0nmol/LNaCl;50%乙醇)重悬浮沉淀，6000r/nin离心Imin；重复步骤d)：
将离心管反扣在纸巾上，室温下自然十燥后，重新总浮于无RNase和DNase的水4+，70℃保温f）
g）13(00r/min离心3rnin，取上清液，保存于一70%超低温冰箱中。也可来用商品性试剂盒和CTAB法提取总 RNA。
D.4.2合成cDNA
5μL总RNA与10.1g/μl八碱基随机引物和9μL水混合，95℃变性5min后立即置冰中冷却2 min。再加人含 5 μL5×M-MIV RT 缓冲液、1. 25 μL 10 nIvl/ L dNTPs、0. 5 μl.200 U/μT.MMLV反转录嗨和3.25μL灭菌纯水的反转录混合液，经37℃1amin、42℃50rnin70℃5min合成cDNA。
D.4.3FCR扩增
PCR反应混合液共25μ,包括2.5μLcDNA,2.5μL10×PCR缓冲液、0.5μI.10mmol/LdNTPs、0.5μI10μmol/1.互补引物、0.375μL2U/μl.TauDNA聚合酶、18.125uL灭菌纯水，按如卜程序进行PCR扩增：94℃10min;94℃30s，退火（退火温度见表D.1)45s，共35个循环，最后72℃延伸10 min。根据各组引物的退火温度及扩增产物人小设计。D.4.4结果判定
检测时设阴性、阳性对照，采用1%琼脂糖电泳，180V电泳约30min,0.5μg/ml.EB济液染色10min-15min，观察到与阳性对照相同的目的条带的样品为阳性，带病毒；与阴性对照-样，未观察到目的条带的样品为即性，无病毒。表 D.1苹果病毒的特异性引物
病毒名称
苹果花叶蜗毒（ApMV）
苹果裙绿叶斑病毒(ACI.SV)
苹果茎痘病毒(ASPV)
引物序列(5’°3'）
HI: TCAACATGGT:TGCAAGTAC
P2.CTAACAAATCTTCATCGATAA
. PI:CAGACICTTATTGAAGTOGAA
12,GGCAACCCIGGAACAGA
P1 :CTCTTGAACCAGCTGATGGC
P2:ATAGCCGCCCOGGTTAGGTT
退火温度(Tm),
产物，bp
NY/T 2281—2012
病毒名称
苹果茎沟病毒（ASGV）
苹果绣果类病毒（ASSVd）
表D.1（续）
物杀列（5'3')
PI:CTGCAAGACTGOACCAAGTTT
PZ:COCGCTGTTGGATTIGATACACCTCPI:GGTAAACACCGIGCGGTCCC
P2:GGGAAACACCTATTGTGTTT
退火温度（Tm），℃
产物，bp
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中华人民共和国农业行业标准
NY/T2281-2012
苹果病毒检测技术规范
Protocol for the detection of apple viruses2012-12-24发布
2013-03-01实施
中华人民共和国农业部
本标准按照GB/T1.1给比的规则起草，本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国果品标准化技术委员会（SAC/TC5IO)山口。NY/T2281—2012
本标准起草单位：中国农业科学院果树研究所、农业部果品及木质量监督检验测试中心（兴城）。本标准主要起草人：董雅风、张尊平、范旭东、任芳、聂继云。T
1范围
苹果病毒检测技术规范
本标准规定了苹果病毒检测的抽样与取样要求、检测方法、判定原则。NY/T 2281—2012
本标准适用于苹果无病毒母本树、无病毒苗木及苹果植株的苹果花叶病毒（Aplemosazczirus：ApMV）、苹果褪绿叶斑病毒（Applechlorouicteaf'spotvirus，ACLSV）、苹果茎痘病毒（ApptestempittingvirusASPV）、苹果茎沟病毒（Applestemgruouingvirus，ASGV），苹果锈果类病毒（Applescarshin viruid,ASSVd)的检测。
2抽样与制样
2.1抽样
2.1.1无病毒母本树
每株均需检测。
2.1.2无病毒苗木
分品种进行抽样。采取随机抽样方法。以666.7m抽检10株为基数，每增加666.7m,增检5株，不足666.7m的按666.7m2计。2.1.3苹果植株
对疑似感病的植株每株必检。
2.2制样
2.2.1木本指示植物检测
温空检测时，早春从待检的苹果植株上取·-年生芽嫁接到特定指示植物上。日问检测时，夏末秋初取待检植株离皮绿枝进行芽接。2.2.2ELISA和KT-PCR检测
春季取待检苹果植上幼嫩新鲜叶片；或冬季取休眠枝条的韧皮部组织。3检测方法
3.1田间症状观寒法
检测刘象为苹果锈果类病毒和苹果花叶病毒，用简首接观察其症状表现（参见附录）3.2木本指示植物检测法
包括温室检测和田间检测。
检测对象为苹果褪绿叶斑病毒、苹果茎症病毒、苹果茎沟病毒、苹果花叫病毒和苹果锈果类病，具体操作参见附录B。
3.3酶联免疫吸附法(ELISA)
检测对象为苹果褪绿叶斑病葬、苹果茎痘病毒、苹果茎沟病毒和苹果花叶病毒，具体操炸参见附录C
3.4反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)检测对象为苄果褪绿叶斑病毒、芒果茎痘病毒、苹果菌沟病毒、苹果花叫病毒和苹果锈果类病毒，具体操作参,见附录 D
NY/T 2281—2012
4判定规则
根据附录A～附录D的要求进行检测和判定，如1果一个样品采用了2种以上检测方法，且检测结果不--敛，则以阳性结果为推，判定为带毒，1苹果无病毒母本树
检出携带主要检测对象中的任何一种病毒/类病毒,该母本树即判定为不合格4.2
苹果无病毒苗木
检出某株苗木携带主要检测对象中的任何一种病毒/类病毒，即判定该批苗木不合格。需要检测的苹果植株
检出带主要检测对象中的仁何-种柄毒/类病毒，则判定该株苹果带，附录A
(资料性附录】
2种非潜隐性病毒病的要田间症状见表 A.1表 A. 1 2 种非潜隐性病毒病的主要田间症状病毒及类病毒
苹果花叶病蒂
苹果锈果类病毒
症状类型
锈果型
花脸难
锈果-花脸复合型
斑驳型
环斑型
花叶型
条斑型
镀边型
症状表现
NY/T2281—2012
先从幼果顶部出现淡绿色水渍状斑块.而后向果梗部护展成木栓化锈斑与纵纹-随果实生长而发生龟裂
果实着色后.病果果面显现红绿相问的不规则色斑.垦花脸状呈现既布锈斑义有花脸的复合症状从小计脉开始发生:鲜黄色或黄白色病斑,病斑形状不娩侧,大小不一,边缘清晰
叶片上产生圆形、椭形或近圆形货色环斑，或近似环状的斑纹病斑不规则，有较大的深绿与浅绿相间色变，边缘不清晰叶片沿叶脉失绿黄化，并乾延至附近的叶肉组织.呈黄色条斑或网纹状叶片边缘发生黄化,形成很窄的黄色镶边3
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B.1温室检测法
B.1.1砧木准备
附录B
【资料性附录]
木本指示植物检测法
温室检测：早存，将上年播种的实生砧苗移栽于直径15cm.高25cm的花益中，每个花盆裁植1株，将花盆移人温室内。温室温度白天控制在20℃~28℃、夜问 9℃~15℃。B.1.2、嫁接
温室检测：砧木开始萌发后，先用嵌芽接法将1个待捡芽嫁接在砧木基部，再用划接法在该芽上方5cm处嫁接指示植物接穗（带2个～3个饱满芽），每个样品嫁接4株。B.1.3嫁接后管理
温案检测：嫁接后，将温室温度控制在18℃-~26℃，适时浇水、防治害虫和剪除砧木萌檗。符指示植物长出嫩叶后，每周观察一，记载症状表现B.1.4结果判断
所嫁接的4株中只要有1株现表B.1规定的典型症状，即判定该样品携带相应的苹果病毒。表B.1苹果病毒斑类病毒在水本指示植物上的主要症状病毒及类病毒
苹果褪绿叶斑病毒
苹果茎痘病森
苹果茎沟病毒
苹果花叶病毒
苹果锈果类病毒
B.2由间检测法
B.2.1砧木准备
指示植物
苏俄节果(R12740-7A)
光辉(RHdianL)
弗吉尼业小苹果（Virginia crab）兰注王(Lord lanbourne)
国光（Ralls）
指示植物症状
褪绿叶斑，植株矮化，舟形叶
叶片反卷，植株矮化
木质部产止纵向叫陷条沟;有的病株嫁接周[肿胀,接合部内有深褐色坏死斑纹；温室鉴定中叫片有时产生黄斑或环形斑，并扭曲变形
叶片上产亚黄斑,沿叶脉出现条斑紫中上部叶片向背面反卷、弯曲，叶片变小、易脱落，并在墓上产生不规则的木栓化锈斑
四间梭测：存季，挑选前一年播种的牛整齐一致的木实牛节，定植干检测圃内.株行距大于15 cmX60 cm.
B.2.2嫁接
田间检测：8月中句将待检株芽接在砧本基部，同时将指示植物芽嫁接在待检芽上方，两芽相聚1. 0 cm~2. 0 cm,每个样品嫁接 4株。B.2.3嫁接后管理
用间检测：第二年苗木发芽前，在指示植物接芽的上方1.cm~.1.5cm处剪除站下，及时除萌，同时加强肥水管理和病虫害防治,5月下旬开始，每周观察“次，记载症状衣现。B.2.4结果判断
所嫁接的4株中只要有1株呈现表B.1规定的典型症状，即判定该样品携带相应的苹果病毒。4
C.1原理
附录C
（资料性附录）
酶联免疫吸附检测法(ELISA)
NY/T 2281—2012
在固相支持物上（酶联板）包被病毒特异性抗体，加人待测样品后，再用悔标记的病毒抗休进行免疫认别,最后通过酶促化学反应检测病毒是否存在的一种血清学检测方法。C.2试剂
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馅水或去离子水或相当纯度的水；酶标抗体为碱性磷酸酶标记抗体。
C.2.1包被缓冲液（pH9.6）
Nazcos
溶于900mL蒸馏水中，搅拌至完全溶解，调节pI至9.6，定容至1000mL，C. 2. 2冲洗缓冲液(PST,PH7. 4)Na,HPO, - 12H,O
NaH2PO, ? 2H,0
Tween - 20
溶于900mL蒸馏水中，搅拌至完全落解，调节pH至7.4.定容至1000mlC.2.3抗原提取缓冲液
聚乙烯吡喀烷酮（PVP)
溶于100mL冲洗缓冲液(C.2.2)。C.2.4酶标抗体缓冲液
聚乙烯吡咯烷酮（VP)
牛血清H蛋H(BSA)
济于100ml冲洗缓冲液（C.2.2)。C.2.5底物缓冲液(pH9.8)
二乙醇胺
定容至100mL，月6MHCl调pH至9.8。C.2.6底物【现用现配】
在10mL底物缓冲液(C.2.4)中加10mg对硝基苯磷酸~钠盐（PNPP)。C.2.7终止液
先用少量蒸馏水溶解后，定容至100纽L。C.3仪器设备
C.3.1酶标检测仪。
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C. 3. 2 酸度。
C. 3. 3 微量移液器:200 μl~1 L00 μL,20 μL--200 μl,10 μL,~100 μI.0. 5 μL~10 μLC.3.4电了天平：感量为0.01g和0.0001房。C. 3.5 冰箱。
C. 3. 6 恒温箱。
C.3.7离心机。
C.4分析步骤
FLISA检测方法可选择A蛋凸酶联免疫法(PAS-ELISA)或双抗心酶联免疫吸附法(DASEL.ISA)
C4.1A蛋白酶联免疫法(PAS-ELISA)C.4.1.1包被A蛋白
用包被缓冲液（C.2.1)稀释A蛋白至1μg/ml.5μg/mL，每孔加100μL，37℃保温2h，弃去孔中液体，用PBST(C.2.2)洗板3次~4次，每次加人PBST(C2.2)后静置3min~5min。C.4.1.2加第一抗血清
用PBST(C.2.2)将抗血清稀释至T作浓度,加人到微孔中，每孔加100μL，保温和洗板方法同C. 4. 1. 1.
C.4.1.3加抗原样品
取梨嫩叶或一年牛休眠枝条韧皮部，每1g样品加人5ml,~10ml.抗原提取缓冲液(C.2.3),研磨，4 000t/min离心5min。每个微孔板需同时设阳性、阴性和空白对照，每个样品加2个微孔，每个微孔加100ul.上清液，4℃冰籍中放置过夜。按C.4.1.1方法洗板，注意第一次洗板体不得溢出微孔。C.4.1.4加第二抗血清
用 PBST(C.2. 2)将抗血清(与第 -抗血清相同)稀释至工作浓度,加人到微孔中,每孔 10 μI,保温和洗板方法同℃、4.上、1，
C.4.1.5加酶标A蛋白
用PBST(C.2.2)将市售酶标A蛋白稀释至.T.作浓度，加人到微孔中，每孔100pL，保温和洗板方法同C. 4.1. 1。
C.4.1.6 加底物
每个微孔加10℃ml底物（C.2.6),黑暗叶宰温放置30min~120min，C.4.1.7终止反应
每个微孔加25μL终止液（C.2.7)。C.4.1.8结果判定
以空白对照调零，测定各微孔405nm吸光值。若待检样品2孔平均吸光值/阴性对照2孔平均吸光值2，则该样品为阳性，即携带所检病毒。C.4.2双抗夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)C.4.2.1加抗血清
用包被缓神冲被（2.1)将病毒特异抗血清IgG稀释至工作铱度，加人到微孔1,存孔100μL，37℃保温2 h,PBST(C.2、2)洗板3次~4次,每次加人PBST((. 2. 2)后静置 3 min~5min。C.4.2.2加抗原样品
方法向C.4.1.3。
C.4.2.3加酶标抗体
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用酶标抗体缓冲液（C.2.4)将碱性磷酸酶标记的特异抗血清IgG稀释至T.作浓度，加人到微孔中，每孔100μl..按C.4.2.1保温和洗板。C.4.2.4加底物
每个微孔加100μL底物（C.2.6),黑暗中室温放置15min～30min。C.4.2.5终止反应
每个微孔加25μL终止液（C.2.7)。C.4.2.6结果判定
方法同 C.4. 1. 8。
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D.1原理
附录D
（资料性附录）
反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法利用反转录酶将病毒RNA反转录为cDNA，并以耐热DNA聚合酶和一对引物（与待测目标核酸分子序列同源的DNA片段）通过高温（DNA分子变性）和低温（引物和目标核酸分子复兴并被耐热DNA聚合酶延仲)交替循环扩增待测目标核酸分子的方法，D.2试剂
D.2.1研磨缓冲液
硫氰酸胍
PVP-30
DEIC处理水定至50mI,4℃保存。用前加入2%偏重亚硫酸钠。D.2.2清洗缓冲液
10. 0 mM Tris-HCI
0.5 nM EDTA
DEPC处埋水定容250mL,4℃贮存，D.2.350×TAE缓冲液
冰乙酸
13.5 mI(或37.5mL 36%乙酸）
灭蒸馅水定容至 250 mL,pH 为 8.0,D.2.46×凝胶加样缓冲液
溴酚蓝
二甲苯青 FF
40%（W/V）蔗糖水溶液
灭菌然馏水定奔至50ml，4℃冰箱保存。13.3仪器设备
D.3. 1 PCR 仪。
D.3.2水平凝胶电泳仪，
D.3.3凝胶成像系统。
D. 3. 4 微量移液器:200 μL,~1 000 μL,20 μL~200 μL,10 μL~100 μL,0. 5 μL~10 μL。8
D.3.5电子天：感量为0.01g和0.0001gD.3.6高速冷冻离心机。
D.3.7无RNase的吸头和离心管。D.4操作步骤
D.4.1总RNA提取
采用二氧化硅极附法提取总RNA：NY/T 2281—2012
称取100mg待检材料放入塑料袋中，加人1mL研磨缓冲液（4.0mol/L硫氰酸胍，0.2mol/1a
醋酸钠，25mmol/LEDTA,1.0mol/L醋酸钾.2.5%PVP-40,2%偏重业硫酸钠）磨碎：b）取500μI.勾浆置于1.5mL消毒离心管中（先加人150uL10%N-lauruylsarcosine），70保温10min、冰中放置5min后，14000/min离心10min；取300μl..上清液，加人150L100%乙醇、300μl.6mol/L碘化钠、30μL10%硅悬浮液（pHc
2.0），率温下振荡20min；
d）6000r/min离心1min，充人上清，加人500μL清洗缓冲液（10.0mfnol/LTris-HCl,pf7.50.5nmol/LEDTA;50.0nmol/LNaCl;50%乙醇)重悬浮沉淀，6000r/nin离心Imin；重复步骤d)：
将离心管反扣在纸巾上，室温下自然十燥后，重新总浮于无RNase和DNase的水4+，70℃保温f）
g）13(00r/min离心3rnin，取上清液，保存于一70%超低温冰箱中。也可来用商品性试剂盒和CTAB法提取总 RNA。
D.4.2合成cDNA
5μL总RNA与10.1g/μl八碱基随机引物和9μL水混合，95℃变性5min后立即置冰中冷却2 min。再加人含 5 μL5×M-MIV RT 缓冲液、1. 25 μL 10 nIvl/ L dNTPs、0. 5 μl.200 U/μT.MMLV反转录嗨和3.25μL灭菌纯水的反转录混合液，经37℃1amin、42℃50rnin70℃5min合成cDNA。
D.4.3FCR扩增
PCR反应混合液共25μ,包括2.5μLcDNA,2.5μL10×PCR缓冲液、0.5μI.10mmol/LdNTPs、0.5μI10μmol/1.互补引物、0.375μL2U/μl.TauDNA聚合酶、18.125uL灭菌纯水，按如卜程序进行PCR扩增：94℃10min;94℃30s，退火（退火温度见表D.1)45s，共35个循环，最后72℃延伸10 min。根据各组引物的退火温度及扩增产物人小设计。D.4.4结果判定
检测时设阴性、阳性对照，采用1%琼脂糖电泳，180V电泳约30min,0.5μg/ml.EB济液染色10min-15min，观察到与阳性对照相同的目的条带的样品为阳性，带病毒；与阴性对照-样，未观察到目的条带的样品为即性，无病毒。表 D.1苹果病毒的特异性引物
病毒名称
苹果花叶蜗毒（ApMV）
苹果裙绿叶斑病毒(ACI.SV)
苹果茎痘病毒(ASPV)
引物序列(5’°3'）
HI: TCAACATGGT:TGCAAGTAC
P2.CTAACAAATCTTCATCGATAA
. PI:CAGACICTTATTGAAGTOGAA
12,GGCAACCCIGGAACAGA
P1 :CTCTTGAACCAGCTGATGGC
P2:ATAGCCGCCCOGGTTAGGTT
退火温度(Tm),
产物，bp
NY/T 2281—2012
病毒名称
苹果茎沟病毒（ASGV）
苹果绣果类病毒（ASSVd）
表D.1（续）
物杀列（5'3')
PI:CTGCAAGACTGOACCAAGTTT
PZ:COCGCTGTTGGATTIGATACACCTCPI:GGTAAACACCGIGCGGTCCC
P2:GGGAAACACCTATTGTGTTT
退火温度（Tm），℃
产物，bp
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