NY/T 2291-2012
基本信息
标准号： NY/T 2291-2012
中文名称：玉米细菌性枯萎病监测技术规范
标准类别：农业行业标准(NY)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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出版信息
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标准简介
NY/T 2291-2012 玉米细菌性枯萎病监测技术规范
NY/T2291-2012
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标准内容
ICS65.020
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 2291--2012
玉米细菌性枯萎病监测技术规范Guidelines for quarantine surveillance ofPantoea stewarti subsp, stewartii(Smith)Mergaert et al.2012-12-24发布
2013-03-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准按照GB/T 1.1给出的规则起草。本标准中农业部种植业管理司提出。本标准由全国植物检疫标推化技术委员会（SAC/TC，271)归口。NY/T2291—2012
本标准起草单位：全国农业技术推广服务中心、江苏省植物保护站、南京农业大学。本标准土要起草人：冯晓东、龚伟荣、胡白石、熊红利、胡婕、褚蛛频、李潇楠、朱莉。I
1范围
玉米细菌性枯萎病监测技术规范NY/T2291—2012
本标准规了农业植物检疫中玉求细菌性枯萎病的疫情监测、室内检验、监测记录和报告的方法。本标准适用于玉米细菌性枯萎病菌的疫情监测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB15569农业植物调运检疫规程
GB/T23624米种子产地检疫规程
SN/T1375玉米细菌性粘萎病菌检疫鉴定方法3原理
玉米细菌性枯萎病菌Pantoea stereartii subsp.stewartii(Smith)Mcrgacrt et al.是危害玉米引起枯萎病的一种病原细菌，病害可造成严重量损失，为进境植物检疫性有害生物。属原核生物界(Procaryatar），薄壁菌门（Gracilicutes），肠杆菌科（enlerubacteriaceae）泛菌属（Pantoea）。异名：Frwinia stewarti (Smith)Dye.玉米细菌性枯萎病菌的田间症状、生理生化反应、血清学反应和FCR反应等特征是其检测与鉴定的重要依据。
4试剂与材料
氢氧化钾(K()H)、氟化钠(NaCI)、碘化钾（KI)、碘(I2）、草酸铵[(NII,):CaO,、甲基红指示剂、α-茶酚、乙醇、结晶紫、熊糖、明胶、琼脂、牛肉浸宵、蛋白陈、酵母提取物等。检验中所需的其他试剂与培养基，参见附录A
所有试剂均为分析纯。
5仪器与用具
超净工作台，电广天平、显微镜、培养箱、摇床、高压灭菌锅、载玻片、盖玻片、解剖刀、注射器、培养血、试管和接种针等。
6疫情监测
6. 1监测区域
重点监测玉米制繁种基地、引进境外玉米种子种植区、进口玉米加工和销售场所及其周边的卡米田等高风离区域。
6. 2 监测时间
玉米整个生长期,重点监测苗期垒叶丝期。6.3监测方法
6.3.1踏查
NY/T 2291—2012
在卡米不同生长期，选择有代表性的用块进行踏查，观察田间玉米有无细菌性粘萎病发病症状（参见附录B），必要时可采用定点（定株）系统调查。同时调查种子来源、栽培管理及病出害发生情况，做好记录。发现有典型或疑似症状的植株，采样进行内检验。6. 3. 2系统监测
选择有代表性的田块，进行田间定点定期调查，每30d谢查·-次，采取5点取样或随机取样方法，每点选取植物10株一-20株进行调查，危可根据器要增减调查数量。疑似症状植株采样进行室内检验，6.3.3产地检疫
卡米制繁种基地的疫情调香，按照GB/T23624的要求逊行田问调查，6.3.4调运检疫
按照（GB15569的要求对调出的去米种子进行调运检疫：对调人本地的上米种子逊行复检，并取样进行室内龄验，
7室内检验
7.1鉴定方法
7.1.1常规鉴定
7.1.1.1喷菌检查
切取出问采回的植株叶片病健交界处约10mm220mm，平放在载玻片的水滴中，加盖玻片后，在低蓓显徽镜下检查，观察有无喷菌现象。7.1.1.2分离培养鉴定
选择田间采回的具有新鲜症状的植株叶片进行病菌分离。在无菌条件下取病健交界处红织约5mm×mm用75%乙醇表面消毒15s，无菌水清洗2次~3次后放入0.2mL无菌水中，用灭菌玻璃棒研碎，在家温下没泡30min。将浸山液在NA培养基板上划线，重复3个~5个平板，（27L2)℃培养3d～5l．观察病原菌形态特征和培养特性，玉米细菌性枯萎病菌形态特征参见附录C。7.1.1.3革兰氏染色
挑取少量分离到的病原菌浮液，涂片固定后用草酸铵结晶紫染1miⅡ，自来水冲洗。加碘液覆盖涂面染1min后水洗，并眉吸水纸吸去水分。灿95%酒精数滴，并轻轻擦动逆行脱色，30后水洗，吸去水分。加番红花红液染10后，白米水冲洗。十燥，镜检。若菌体都呈紫色为革兰氏阳性菌，菊休红色为革兰氏阴性菌。
也可在载玻片上加一小滴3%K(II液。用火菌牙签挑少量纯培养的菌落放人3%KOH液滴中，轻轻搅拌，5s~10s后慢慢向上提起，如有黏丝出现，则为单兰氏阴性菌：若无黏丝出现，即为革兰氏阳性菌。
7.1.1.4致病性鉴定
将待测菌配成每毫升今有10°个细胞的菌悬液，用注射器注射接种于3叶期～4叶期盆栽的玉米幼苗茎基部,直到喇叭口处出现菌液为止，接种植株用塑料袋保湿24l,12h光照/黑略的循环条件下30℃培养。接种7d后观察植株发病症状。7.1.1.5生理生化测定
手米细菌性粘萎病菌收生理化测靠方活参见S/11375。7. 1.2SPA-ELISA检测
玉米细菌性枯菱病菌SPA-EI.TSA检测程序参见 SN/T 13757. 1. 3PCR 检测
玉米细菌性枯萎病PCR检测程序参附录D7.2鉴定结果判定
7.2.1常规鉴定
NY/T2291—2012
田间植株发病症状符合附录A描述的去水细菌性枯萎病典型症状，解镜检有喷菌现象，可初步确定病原菌为玉米细菌性枯萎病菌。如要进步确定，则进行分离培养，分离培养物形态特征符合附录C,革兰氏染色呈阴性.致病性鉴定产生典型症状，生理生化测定结果为阳性可确定病原菌为玉米细菌性枯萎病菌。
7.2:2SPA-ELISA检测
在阴性对照OD值≤0.1，且阳性对照OD值大于阴性对照（)D值2倍的前提下，样品孔（D值大于阴性对照OI)值2倍时，检测结果判定为阳性，样品中带有玉米细菌性枯差病菌：否则，检测结果为阴性,样品中不带有玉米细菌性粘萎病菌。7.2.3PCR检测
在阴性对照无增条带、阳性对照出现相应人小的特异性条带的前提下，供试样品出现与阳性对照相同大小的特异性扩增条带，样品判定为阳性，即带有玉米细菌性枯菱病菌；供试样品未出现与阳性对照相同大小特异性条带，样品判为阴性，即不带玉米细菌性枯萎病菌。7.3样品和菌株的保存
检验样品须保存6个月，保存期满后，需经灭菌处理。检验过程中使用的用具和用品应进行消灭活处理。分离并鉴定为玉米细菌性枯菱病菌的菌株可采用适当的力方式长期保存。8监测报告
记录监测结果并填写《卡米细菌性枯菱病田间调查监测记录表见附录E）。植物检疫机构对监测结果进行整理汇总形成监测报告。9记录保存
详细记录、汇总监测区内调查结果，各项监测的原始记录连同其他材料妥善保存于植物检疫机构3
NY/T2291—2012
A 1 NA 培养基
附录A
(资料性附录）
培养基及试剂的配制方法
取牛肉浸膏3g蛋广陈5g.酵母提取物1g，蔗糖10g，p调至7.0～7.2.15g琼脂，蒸馏水1000ml.,121灭菌20min
A.2革兰氏染色液
A.2.1结晶紫液
A：结品紫2g，95%酒精20mL;B液：(NII)2Cz0),0.8g，蒸馏水80mL。使用前将A液、B液相混，静胃48h后使用。
A.2.2碘液
I2Ig·KI2g，蒸馏水300ml.,将KI溶于少量蒸馏水中，然后加人I2,待12全部溶解后，加水稀释至300mL
A.2.3番红花红液
2.5外番红.花红酒精落液10mL、蒸馏水100ml.。4
附录B
[资料性附录]
玉米细菌性枯萎病与其他病害症状区分玉米细菌性枯萎病与其他病害症状区分见表B.1.表 B. 1玉米细菌性枯萎病与其他病害症状区分病
上米细菌性枯括萎病
(Pantoea steuurtii subsp. stewartii)玉米细菌性萎蔗病
(Clarnbacter michiganensis suhsp.nebraskensis)
玉米细菌性叶疫病
(Mitourar arende)
玉米细菌性纹病
(Psetutomonas andropogonis)
玉米人斑病
(Earserohilum turcicam)
玉米小斑病
(Bipolarismaydis)wwW.bzxz.Net
玉米圆斑病
(Bipoluris zeicota)
叫部症状
形成谈绿色到黄色，县不规则或波软边缘的条斑，与叶脉平行，有的条斑可以延长到整个叶片,病斑干枯后咸耦色
在叶片土产生与中脉平行的、分散的水溃状条斑,最后全叶干枯
引起具有红色边缘的，窄长的条斑和斑点，特点是有条既严重的叶片易撕成碎条产生窄长、行的、橄榄绿到黄褐色水满状病斑
病斑大,梭形(或卵圆形),灰绿色到棕黄色，边缘明显、严重侵染时病斑相连多数叶片死亡,像火烧一样
引起小的、界限明显的、擦黄色到褐色病班，当侵染严重时叶片像火烧状同小斑病相似
NY/T2291—2012
极茎或穗部症状
苞叶上也有条纹病斑
系统侵染的植株维管束变色
根或崇部早水流状，并分泌出黏液，出现凝腐状
茎秆上出现腐烂
上部叶片条纹病斑融合在一
起，上部的叶片全部变白，顶部变白是这·个病害的典型特征
NY/T 2291—2012
（资料性附录】
玉米细菌性枯萎病菌形态特征
玉米细菌性枯萎病菌是-种不运动、无芽孢、革兰氏染色阴性、兼性厌氧杆菌.大小为（0.4~0.7）um×(0.9~2.0）μm，以单个或短链形式存在。在营养琼脂培养基上菌落小阅形，.长慢，黄色，表面平滑，在片养琼脂上划线培养，其菌菜的变化为：从稀薄、黄色、湿润，易梢落到较薄、概黄色、下燥，不清落。在肉汤培养液中生长微弱、易形成灰色环利黄色沉淀物。D.1制样
D. 1. 1叶片样品
附录D
【资料性附录]
玉米细菌性枯萎病菌PCR检测程序NY/T 2291—2012
将田问采回的植株叶片先用无菌水洗2次，再用75%酒精表面消毒15s，将样品剪成20mm2小片，装入烧杯，按照供试样品质量（g）：样品提取液体积（mL)=1：20的比例加人样品提取液，静置没泡10 min。
D.1.2种子样品
取样品种子20g,用小型粉碎机粉碎10s,将样品用样品提取液25mL浸泡10min。D.1.3病原菌分离物
用接种环挑取一坏病原菌菌液,加 1 ml.样品提取液中混匀,经10 000 r/ min离心2 min,弃F清液。重复3次。
D. 2 PCR 检测方法
D.2.1PCR检测引物
见表 D. 1。
表 D. 1玉米细菌性枯萎病菌 PCR检测引物物
CPSI.1/CPSR2G
(XTGTCAGTCTOGAACC/ ATCTCGAACCGGTAAC)GGOGCGTCGACACCTGCGGTTGGAACAOCGXYCTCTACACAXXGTGTAOTTAGT
GCGCTTGCGTGTTATGAGUT
AGICCGCIGCGAAGCCGA
2PCR反应体系
反应组成
10XPCR huffer
25 mMgCl2
25 Im NTI
20mg/mL牛血清白蛋(BSA）
1%Tween 20
Pritner(20 μrm)
5 /μL Taq TINA 案合醇
馍板DNA
片段大小
0. 299 kb
物来源
David et al. 2002
工茂华等，2006
NY/T2291—-2012
1).2.3PCR检测程序
见表D.2。
引物名称
CPSIL1/ CPSR2e'r
ITSA/TTSR
PSA/FSB3
表 D.2玉米细菌性枯萎病菌PCR检测程序程序
94 1min24℃ 15 ×,52%; 15 #,72% 3c s(25个循环);72℃ 5 mim94℃5min;94℃3Cs+62℃30s，72℃:1min(5个循环）+72℃10min94℃5min;91℃3s.62℃30s72℃1min35个循环）72℃10minDavid(20w2)报导该对引物对于Pantoeaananatsw.herbicolu特异性不强.且对了:PsanuzrtiiIXCl16函株没有特异性条带。
为策式FCR
D.3电泳
敢PCR扩增产物5pL与样品缓冲液1L混合均句，用1%的琼脂糖凝胶电泳（80V、1h)后，溴化乙锭（EB)染包（20min~3Cmin），在凝胶成像系统中观察.记录观察结果，对样品PCR扩增带拍照并保存(图 D. 1)。
1000bp
）引物GFSL1/CSH2
500 lp
说明：
阳性样品
其他；
10-酮性对照。
[物SASH
图 D. 1PCR 产物电泳图
附录E
【规范性附录】
玉米细菌性枯萎病田间调查监测记录表玉米细菌性枯菱病田间调查监测记录见表 E.1。表E.1玉米细菌性枯萎病田间调查监测记录表撕查单位：
作物品种
调查地点
调查株数
疑似症状表现株数
NY/T2291—2012
调查时间：
蓝测(检测)结果
调查人(签宇)：
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中华人民共和国农业行业标准
NY/T 2291--2012
玉米细菌性枯萎病监测技术规范Guidelines for quarantine surveillance ofPantoea stewarti subsp, stewartii(Smith)Mergaert et al.2012-12-24发布
2013-03-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准按照GB/T 1.1给出的规则起草。本标准中农业部种植业管理司提出。本标准由全国植物检疫标推化技术委员会（SAC/TC，271)归口。NY/T2291—2012
本标准起草单位：全国农业技术推广服务中心、江苏省植物保护站、南京农业大学。本标准土要起草人：冯晓东、龚伟荣、胡白石、熊红利、胡婕、褚蛛频、李潇楠、朱莉。I
1范围
玉米细菌性枯萎病监测技术规范NY/T2291—2012
本标准规了农业植物检疫中玉求细菌性枯萎病的疫情监测、室内检验、监测记录和报告的方法。本标准适用于玉米细菌性枯萎病菌的疫情监测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB15569农业植物调运检疫规程
GB/T23624米种子产地检疫规程
SN/T1375玉米细菌性粘萎病菌检疫鉴定方法3原理
玉米细菌性枯萎病菌Pantoea stereartii subsp.stewartii(Smith)Mcrgacrt et al.是危害玉米引起枯萎病的一种病原细菌，病害可造成严重量损失，为进境植物检疫性有害生物。属原核生物界(Procaryatar），薄壁菌门（Gracilicutes），肠杆菌科（enlerubacteriaceae）泛菌属（Pantoea）。异名：Frwinia stewarti (Smith)Dye.玉米细菌性枯萎病菌的田间症状、生理生化反应、血清学反应和FCR反应等特征是其检测与鉴定的重要依据。
4试剂与材料
氢氧化钾(K()H)、氟化钠(NaCI)、碘化钾（KI)、碘(I2）、草酸铵[(NII,):CaO,、甲基红指示剂、α-茶酚、乙醇、结晶紫、熊糖、明胶、琼脂、牛肉浸宵、蛋白陈、酵母提取物等。检验中所需的其他试剂与培养基，参见附录A
所有试剂均为分析纯。
5仪器与用具
超净工作台，电广天平、显微镜、培养箱、摇床、高压灭菌锅、载玻片、盖玻片、解剖刀、注射器、培养血、试管和接种针等。
6疫情监测
6. 1监测区域
重点监测玉米制繁种基地、引进境外玉米种子种植区、进口玉米加工和销售场所及其周边的卡米田等高风离区域。
6. 2 监测时间
玉米整个生长期,重点监测苗期垒叶丝期。6.3监测方法
6.3.1踏查
NY/T 2291—2012
在卡米不同生长期，选择有代表性的用块进行踏查，观察田间玉米有无细菌性粘萎病发病症状（参见附录B），必要时可采用定点（定株）系统调查。同时调查种子来源、栽培管理及病出害发生情况，做好记录。发现有典型或疑似症状的植株，采样进行内检验。6. 3. 2系统监测
选择有代表性的田块，进行田间定点定期调查，每30d谢查·-次，采取5点取样或随机取样方法，每点选取植物10株一-20株进行调查，危可根据器要增减调查数量。疑似症状植株采样进行室内检验，6.3.3产地检疫
卡米制繁种基地的疫情调香，按照GB/T23624的要求逊行田问调查，6.3.4调运检疫
按照（GB15569的要求对调出的去米种子进行调运检疫：对调人本地的上米种子逊行复检，并取样进行室内龄验，
7室内检验
7.1鉴定方法
7.1.1常规鉴定
7.1.1.1喷菌检查
切取出问采回的植株叶片病健交界处约10mm220mm，平放在载玻片的水滴中，加盖玻片后，在低蓓显徽镜下检查，观察有无喷菌现象。7.1.1.2分离培养鉴定
选择田间采回的具有新鲜症状的植株叶片进行病菌分离。在无菌条件下取病健交界处红织约5mm×mm用75%乙醇表面消毒15s，无菌水清洗2次~3次后放入0.2mL无菌水中，用灭菌玻璃棒研碎，在家温下没泡30min。将浸山液在NA培养基板上划线，重复3个~5个平板，（27L2)℃培养3d～5l．观察病原菌形态特征和培养特性，玉米细菌性枯萎病菌形态特征参见附录C。7.1.1.3革兰氏染色
挑取少量分离到的病原菌浮液，涂片固定后用草酸铵结晶紫染1miⅡ，自来水冲洗。加碘液覆盖涂面染1min后水洗，并眉吸水纸吸去水分。灿95%酒精数滴，并轻轻擦动逆行脱色，30后水洗，吸去水分。加番红花红液染10后，白米水冲洗。十燥，镜检。若菌体都呈紫色为革兰氏阳性菌，菊休红色为革兰氏阴性菌。
也可在载玻片上加一小滴3%K(II液。用火菌牙签挑少量纯培养的菌落放人3%KOH液滴中，轻轻搅拌，5s~10s后慢慢向上提起，如有黏丝出现，则为单兰氏阴性菌：若无黏丝出现，即为革兰氏阳性菌。
7.1.1.4致病性鉴定
将待测菌配成每毫升今有10°个细胞的菌悬液，用注射器注射接种于3叶期～4叶期盆栽的玉米幼苗茎基部,直到喇叭口处出现菌液为止，接种植株用塑料袋保湿24l,12h光照/黑略的循环条件下30℃培养。接种7d后观察植株发病症状。7.1.1.5生理生化测定
手米细菌性粘萎病菌收生理化测靠方活参见S/11375。7. 1.2SPA-ELISA检测
玉米细菌性枯菱病菌SPA-EI.TSA检测程序参见 SN/T 13757. 1. 3PCR 检测
玉米细菌性枯萎病PCR检测程序参附录D7.2鉴定结果判定
7.2.1常规鉴定
NY/T2291—2012
田间植株发病症状符合附录A描述的去水细菌性枯萎病典型症状，解镜检有喷菌现象，可初步确定病原菌为玉米细菌性枯萎病菌。如要进步确定，则进行分离培养，分离培养物形态特征符合附录C,革兰氏染色呈阴性.致病性鉴定产生典型症状，生理生化测定结果为阳性可确定病原菌为玉米细菌性枯萎病菌。
7.2:2SPA-ELISA检测
在阴性对照OD值≤0.1，且阳性对照OD值大于阴性对照（)D值2倍的前提下，样品孔（D值大于阴性对照OI)值2倍时，检测结果判定为阳性，样品中带有玉米细菌性枯差病菌：否则，检测结果为阴性,样品中不带有玉米细菌性粘萎病菌。7.2.3PCR检测
在阴性对照无增条带、阳性对照出现相应人小的特异性条带的前提下，供试样品出现与阳性对照相同大小的特异性扩增条带，样品判定为阳性，即带有玉米细菌性枯菱病菌；供试样品未出现与阳性对照相同大小特异性条带，样品判为阴性，即不带玉米细菌性枯萎病菌。7.3样品和菌株的保存
检验样品须保存6个月，保存期满后，需经灭菌处理。检验过程中使用的用具和用品应进行消灭活处理。分离并鉴定为玉米细菌性枯菱病菌的菌株可采用适当的力方式长期保存。8监测报告
记录监测结果并填写《卡米细菌性枯菱病田间调查监测记录表见附录E）。植物检疫机构对监测结果进行整理汇总形成监测报告。9记录保存
详细记录、汇总监测区内调查结果，各项监测的原始记录连同其他材料妥善保存于植物检疫机构3
NY/T2291—2012
A 1 NA 培养基
附录A
(资料性附录）
培养基及试剂的配制方法
取牛肉浸膏3g蛋广陈5g.酵母提取物1g，蔗糖10g，p调至7.0～7.2.15g琼脂，蒸馏水1000ml.,121灭菌20min
A.2革兰氏染色液
A.2.1结晶紫液
A：结品紫2g，95%酒精20mL;B液：(NII)2Cz0),0.8g，蒸馏水80mL。使用前将A液、B液相混，静胃48h后使用。
A.2.2碘液
I2Ig·KI2g，蒸馏水300ml.,将KI溶于少量蒸馏水中，然后加人I2,待12全部溶解后，加水稀释至300mL
A.2.3番红花红液
2.5外番红.花红酒精落液10mL、蒸馏水100ml.。4
附录B
[资料性附录]
玉米细菌性枯萎病与其他病害症状区分玉米细菌性枯萎病与其他病害症状区分见表B.1.表 B. 1玉米细菌性枯萎病与其他病害症状区分病
上米细菌性枯括萎病
(Pantoea steuurtii subsp. stewartii)玉米细菌性萎蔗病
(Clarnbacter michiganensis suhsp.nebraskensis)
玉米细菌性叶疫病
(Mitourar arende)
玉米细菌性纹病
(Psetutomonas andropogonis)
玉米人斑病
(Earserohilum turcicam)
玉米小斑病
(Bipolarismaydis)wwW.bzxz.Net
玉米圆斑病
(Bipoluris zeicota)
叫部症状
形成谈绿色到黄色，县不规则或波软边缘的条斑，与叶脉平行，有的条斑可以延长到整个叶片,病斑干枯后咸耦色
在叶片土产生与中脉平行的、分散的水溃状条斑,最后全叶干枯
引起具有红色边缘的，窄长的条斑和斑点，特点是有条既严重的叶片易撕成碎条产生窄长、行的、橄榄绿到黄褐色水满状病斑
病斑大,梭形(或卵圆形),灰绿色到棕黄色，边缘明显、严重侵染时病斑相连多数叶片死亡,像火烧一样
引起小的、界限明显的、擦黄色到褐色病班，当侵染严重时叶片像火烧状同小斑病相似
NY/T2291—2012
极茎或穗部症状
苞叶上也有条纹病斑
系统侵染的植株维管束变色
根或崇部早水流状，并分泌出黏液，出现凝腐状
茎秆上出现腐烂
上部叶片条纹病斑融合在一
起，上部的叶片全部变白，顶部变白是这·个病害的典型特征
NY/T 2291—2012
（资料性附录】
玉米细菌性枯萎病菌形态特征
玉米细菌性枯萎病菌是-种不运动、无芽孢、革兰氏染色阴性、兼性厌氧杆菌.大小为（0.4~0.7）um×(0.9~2.0）μm，以单个或短链形式存在。在营养琼脂培养基上菌落小阅形，.长慢，黄色，表面平滑，在片养琼脂上划线培养，其菌菜的变化为：从稀薄、黄色、湿润，易梢落到较薄、概黄色、下燥，不清落。在肉汤培养液中生长微弱、易形成灰色环利黄色沉淀物。D.1制样
D. 1. 1叶片样品
附录D
【资料性附录]
玉米细菌性枯萎病菌PCR检测程序NY/T 2291—2012
将田问采回的植株叶片先用无菌水洗2次，再用75%酒精表面消毒15s，将样品剪成20mm2小片，装入烧杯，按照供试样品质量（g）：样品提取液体积（mL)=1：20的比例加人样品提取液，静置没泡10 min。
D.1.2种子样品
取样品种子20g,用小型粉碎机粉碎10s,将样品用样品提取液25mL浸泡10min。D.1.3病原菌分离物
用接种环挑取一坏病原菌菌液,加 1 ml.样品提取液中混匀,经10 000 r/ min离心2 min,弃F清液。重复3次。
D. 2 PCR 检测方法
D.2.1PCR检测引物
见表 D. 1。
表 D. 1玉米细菌性枯萎病菌 PCR检测引物物
CPSI.1/CPSR2G
(XTGTCAGTCTOGAACC/ ATCTCGAACCGGTAAC)GGOGCGTCGACACCTGCGGTTGGAACAOCGXYCTCTACACAXXGTGTAOTTAGT
GCGCTTGCGTGTTATGAGUT
AGICCGCIGCGAAGCCGA
2PCR反应体系
反应组成
10XPCR huffer
25 mMgCl2
25 Im NTI
20mg/mL牛血清白蛋(BSA）
1%Tween 20
Pritner(20 μrm)
5 /μL Taq TINA 案合醇
馍板DNA
片段大小
0. 299 kb
物来源
David et al. 2002
工茂华等，2006
NY/T2291—-2012
1).2.3PCR检测程序
见表D.2。
引物名称
CPSIL1/ CPSR2e'r
ITSA/TTSR
PSA/FSB3
表 D.2玉米细菌性枯萎病菌PCR检测程序程序
94 1min24℃ 15 ×,52%; 15 #,72% 3c s(25个循环);72℃ 5 mim94℃5min;94℃3Cs+62℃30s，72℃:1min(5个循环）+72℃10min94℃5min;91℃3s.62℃30s72℃1min35个循环）72℃10minDavid(20w2)报导该对引物对于Pantoeaananatsw.herbicolu特异性不强.且对了:PsanuzrtiiIXCl16函株没有特异性条带。
为策式FCR
D.3电泳
敢PCR扩增产物5pL与样品缓冲液1L混合均句，用1%的琼脂糖凝胶电泳（80V、1h)后，溴化乙锭（EB)染包（20min~3Cmin），在凝胶成像系统中观察.记录观察结果，对样品PCR扩增带拍照并保存(图 D. 1)。
1000bp
）引物GFSL1/CSH2
500 lp
说明：
阳性样品
其他；
10-酮性对照。
[物SASH
图 D. 1PCR 产物电泳图
附录E
【规范性附录】
玉米细菌性枯萎病田间调查监测记录表玉米细菌性枯菱病田间调查监测记录见表 E.1。表E.1玉米细菌性枯萎病田间调查监测记录表撕查单位：
作物品种
调查地点
调查株数
疑似症状表现株数
NY/T2291—2012
调查时间：
蓝测(检测)结果
调查人(签宇)：
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