NY/T 1859.2-2012 农药抗性风险评估 第2部分：卵菌对杀菌剂抗药性风险评估 NY/T1859.2-2012 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

ICS 65.100
中华人民共和国农业行业标准
NY/T1859.2—2012
农药抗性风险评估
第2部分：卵菌对杀菌剂抗药性风险评估Guidelines on the risk assessment for pesticide resistance-Part 2: The risk assessment for Oomycete resistance to fungicides2012-06-06发布
2012-09-01实施
中华人民共和国农业部
NY/T1859《农药抗性风险评估》为系列标准。第1部分：总则；
二一第2部分：卵菌对杀菌剂抗药性风险评估；—第3部分：蚜虫对拟除虫菊酯类农药抗药性风险评估：第4部分：乙酰乳酸合成酶抑制剂类除节剂抗性风险评估。本部分为《农药抗性风险评估》的第2部分。本部分按照GB/T1.12009给出的规则起草，本部分中中华人民共和国农业部提出并归几。本标准起草单位：农业部农药检定所、中国农业大学本标谁主要起草人：刘西莉、吴新平、张文君、陈立萍、朱春雨、张住、张楠NY/T1859.2—2012
1范围
农药抗性风险评估
NY/ T 1859. 2—2012
第2部分：卵菌对杀菌剂抗药性风险评估本部分规定了植物病原卵菌对杀菌剂抗药性风险评估的原则和要求，本部分适用于卵菌门霜需日腐科疫霉属、腐莓属、霜疫霉属等兼性奇生性病原菌对具有直接作用方式的杀菌剂抗药性风险评估。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件.仪注日期的版本适用于本文件。凡是不注口期的引文件，其最新版本（包括所有的修订单)适用于本义件。NY/T1156.1~1156.2—2006农药室内生物测定试验准则NY/I1667（所有部分）农药登记管理术语NY/T1859.1—2010农药抗性风险评估第1部分：总则3术语和定义
NY/T1667(所有部分)界定的以及下列术语和定义适用于：本文件3.1
药剂驰化fungicideadaption
用杀菌药剂连续对病原菌处理使其对处理药剂恐受能力增加的过程。3.2
紫外诱变UV-rnutagenesis
用紫外线照射病原菌的菌丝或孢子，诱发病原菌发生与抗药性相关的突变。3.3
抗性突变频率resistancemutation frequency指供试靶标病原菌群体中发生与抗药性相关突变的菌株所占的百分比例。3.4
最小抑制浓度minimum inhibitoryconeentration(MIC)可完全抑制病原菌孢子萌发或菌丝生长的最低药剂浓度。3.5
抗性指数resistance facton
抗性菌株对该药剂的敏感性（EC或MIC).与其亲本菌株敏感性（EC或MIC)或与嫩感其线的平均E的比值。
适合度 FinessbZxz.net
抗药性病原菌在存活、生长、致病、繁殖等方面与辙感群体的牛生存竞争能力。3.7
cross-resistance
交互抗药性
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病原菌由于同的抗药性机制，对用作选择药剂以外来的其他杀菌剂产生的抗药性。3.8
负交互抗药性ncgaitive cross-resistance病原菌对”·种杀随剂产生抗性时，刘另一种杀菌剂表现为史辙感的现象。4抗药性风险评估
4.1抗药性风险的影响因子
4.1.1药剂
多作用位点、非选择性杀菌剂如白菌清、代森锰锌等在理论1属于低抗性风险的药剂：单作用位点、选择性强的杀菌剂如甲霜灵等米基酰胺类的杀菌剂、嘧菌酯等甲氙基丙烯酸酯类杀菌剂埋论1:属丁高抗性风险药剂：用于卵菌病害防治的其他杀菌剂，如霜霉威等氨基甲酸酯类杀荫剂、烯酰吗啉等羧酸酰胺类杀菌剂、霜脲氰和氟吡菌胺等不同的酰胺类杀菌剂理论上均属于中等抗性风险的药剂，4.1.2靶标生物
卵菌门霜毒目腐霉科疫寄属和橘寄属的病凉菌，主要引起土传病害，理论上属于低等抗药性风险的病原菌。如疫霉属中引起辣椒疫病的辣椒疫荐（Phytophthnracupsici）、起黄瓜疫病的瓜类疫病菌（Phytophthoramelomis），以及腐爆属引起蔬菜猝倒病的瓜果腐霉（Pythitumaphanidermattum）：疫霉属中引起马铃薯晚疫病和番茄晚疫病的致病疫霉（Phytophttorainfestans），初侵染来源为七壤或种薯，在田间以风雨传播为主，再侵染频繁，理论上为低中等抗药性风险的病原菌；霸疫霉属中引起荔枝疫病的荔枝霜疫霉（Peronnphythnra.titchi）则以风雨传播为主，病菌繁殖周期较短，再侵染频繁，理论下属于到高等抗药性风险的病原菌。4.1.3农事操作风险
大面积种植单品种作物、单作或连作的农事操作抗性风脸高。增加药剂选择压力和加再病害发生的施药技术和耕作裁培措施均会增加抗药性风险，4.2抗性风险评估内容
4.2.1敏感基线的建立
从末使用过某种药剂及其相同作机理药剂的多个代表性地区采集供试菌株（60株～100株）。按照农药室内牛物测定试验准则NY/T1156.22006中的方法测定其对该药剂的敏感性（ECs值）。如果菌株敏感性呈单峰分布，则这些菌株可视为野生敏感菌株，其对药剂的敏感性(ECs值)的平均值可作为靶标菌对该药剂敏感基线的EC。4.2.2药剂特性及交互抗性
明确供试约剂所届类别、作用方式、作用机制及其活性和持效期：调查该药剂（或同类药剂)在当地使用的历史、使用频率；同类药剂是否有抗药性的现象：当地是否采取了抗药性治理措施。参考以上调查结果，并依据对嫩感菌株利抗性菌株毒力测定结果分析该药剂是否与牛产上常用药剂之间具有交互抗性，如病原菌对供试药剂产生抗药性后，同时对刃一种药剂的敏感忙也降低，则两杀菌剂问具有交互抗药性；如病原菌对供试药剂产牛抗药性后，对刃一种药剂比原来更加敏感，则两杀菌剂间具有负交互扰药性
4.2.3靶标病原菌产生抗药性的潜能采用紫外诱变和药剂驯化的方法在室内进行抗药性菌株的筛选。紫外诱变时以紫外光照射后菌丝或袍十存活率为5%~10%的照射剂量进行突变体筛选；药剂卵化时须将靶标菌接种于带药浓度接近MIC浓度的培养基平板上·培养数大后挑取孢子能够萌发并正常扩展的菌落战出现角灾变的菌落边缘菌丝，在含药浓度逐步提高的带约平板上连续培养多代之所，将在含MIC药剂浓度之上还能牛长的菌落，确定为疑似突变体，在无药培养平板上转接继代培养3代后测定其对杀菌剂的敏感性，获得抗药2
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性状能够稳定遗传的菌株。抗药性突变频率X（%）按式（1）订算，抗性指数F按式（2）计算，计算结果保留整数。
式中：
X一抗药性突变频率,单位为百分率(%)：N，—一筛选获得的抗药性菌体数量，单位为个；N2用于抗药性筛选的供试靶标病原菌群体数量和，单拉为个FE
式中：
F抗性指数；
E抗性菌株对该药剂的敏感性(E心）,单位为微克每亳升(μg/ml)：E2—亲本菌株对该药剂的敏感性(ECs）,单位为微克每毫升（pg/mL)。4.2.4抗药性菌株的适合度测定
测定靶标病原菌的菌丝生长速率、温度嫩感性、孢子囊和游动孢了产生能力、休止孢萌发能力、致病力、竞争力等适合度相关的生物学性状指标，比较抗药性菌株和敏感菌株（包括亲本菌株)有无差异，具体方法见附录A。如果抗性群体的适合度明显低于敏感群休（包括亲本菌株），则该药剂田间使用后靶标菌对其产生抗药性的风险较低。如果抗性群体的适合度接近或高于敏感群体（包括亲本菌株），则该药剂具有定的田间抗性风险。如果抗性群体的适合度明显高于敏感群体（包括亲本菌株），该药剂产牛田间抗性风险较高。
4.2.5抗性风险级别分析
依据抗性菌株的突变频率，抗性指数和适合度测定结果，并结合交互抗药性、抗性遗传、药剂的作用机制及其活性和病害特征等研究结果，综合分析药剂在由间推广使用后产生抗药性的风险。4.2.5.1高等抗性风险
如果药剂持效期长、作用位点单·、田问有同类药剂使用的历史、靶标菌易」产牛抗药性突变、抗药性菌株适合度接近或高于敏感群体（包括亲本菌株），且防治对象为气流和雨水传播的多循环病害，则该药剂的用间使而风险较高，如抗药性由显性基因控制，则抗性风险级别为商等风险。如抗药性出隐性基因控制,则抗性风险级别为中一高等风险。4.2.5.2中等抗性风险
如果药剂作用位点单“.田问有同类药剂使用的历史.靶标菌易于产牛抗药性突变、抗药性菌株适合度接近或高丁敏感群体（包括亲本菌株），防治对象土要是由土壤或种了传播的单循环病害，则该药剂其有一定的用间使用风险。如抗药性由品性基因控制则抗性风险级别为中高等风险。如抗药性出隐性基因控制，则抗性风险级别为巾等风险。4.2.5.3低等抗性风险
如果药剂为多作用位点，田间没有同类药剂使用的历史、抗性菌株突变频率较低、抗性菌株的适合度显著低于敏感群体亲本菌株，则该药剂的由间使用风险级别为低等风险。5抗性风险管理
5.1一般原则
抗性风险的级别确定后，要考虑抗性风险的可接受性。属丁低抗性风险级别的药剂.不需要采取抗性管理措施；属于中等抗性风险的药剂，必要吋应考虑采取抗性风险管理措施；属丁高等抗性风险级别的药剂，需要采取抗性管理措施。对于中.高抗性风险的药剂.农药生产企业应为登记的农药产品提供3
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抗性风险评粘资料及管理措施，并在产品标签和便用说明亚工注明如何规避抗性风险。对高等抗药性风险的药剂，其抗性风险管理应内农药生产（经书）企业登记管理部门、科研和植保推部门及使用者共同参与。
5.2抗性风险管理措施
5.2.1有害生物综合治理
利用轮作，抗性品种、生物防治以及其他有利丁减轻病害发牛和危害的非化学防治措施，5.2.2限制性使用技术
限定农药品种的年使用或连续使川次数。对于多作用位点、非选择性的低抗药性风险药剂，如白菌清、代森锰锌等，在一种作物上药剂每年连续使用次数不多于5次～7次；对于中等抗性风险的药剂，如霜霉威等氨墨甲酸酯类杀菌剂、烯酰吗琳等羧酸酰腰类杀菌剂，霜腺和氟吡菌胺等不同的酰胺类杀菌剂，年使用不多于3次～4次；对子单作而位点，选摔性强的高等抗性风险药剂，如甲霜灵等米基酰胺类的杀菌剂、嘧菌酯等小氧基丙烯酸酯类杀菌剂年使用次数不多于2次～3次。5.2.3混合用药
甲霜灵等苯基酰胺类的杀点剂、嘧菌酯等甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂可分别与代森锰锌等多作用位点杀菌剂或氨基甲酸酯类杀菌剂或羧酸酰胺类杀菌剂或霜豚氨、氟吡菌胺等酰胺类杀菌剂混合使用，有利于延缓抗药性的发展。混合用药时，药剂组分的选择、配比.用量以及混合的程序等要符合农药相容性和延缓抗药性的要求。
5.2.4轮换用药
甲霜灵等苯基酰胺类的杀菌剂可与嘧菌酯等甲氧基内烯酸酯类杀菌剂或代森锰锌等多作用位点杀菌剂或氨基酸酯类杀菌剂或羧酸酰胺类杀菌剂或霜豚氰、氟吡菌胺等酰胺类杀菌剂轮换使用，延缓抗药性的发展。轮换使用时药剂维合的选择要符台延缓抗药性的要求，5.2.5负交互抗性药剂的使用
使用通过试验证助与供试药剂具有负交互抗性的杀菌剂，以治理植物病原卵菌对供试系菌剂抗约性的发展。
5.2.6产品标签标注
在产品标签上标注抗性风险级别,并标明相成抗性风险管理的措施。4
附录A
【规范性附录】
抗药性菌株的适合度測定
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适合度是指抗药性病原谢在存活、生长、致病、繁殖等方面与嫩感群体的生存竞争能力。试验中通过测定靶标病原菌的抗药稳定性、菌丝生长逆率、温度敏感性，孢子囊和游动孢子产生能力、休止孢发能力、致病力、竞争力等适合度相关的生物学性状指标，比较不同抗性水平的抗药性菌株和敏感菌株（包括亲本菌株)有无差异.来评价抗药性菌株的适合度。如果抗性群体的适合度明显低于敏感群体（包括亲本菌株），则该药剂田间使用后靶标菌对其产生抗药性的风险较低。如果抗性群体的适合度接近或高丁敏感群体（包括亲本菌株），则该药剂具有定的国间抗性风险。如果抗性群体的适合度明显高于敏感群体(包括亲本菌株),该药剂产生田间抗性风险较高。A.1抗药菌株的稳定性
将抗药突变体在无药平板上培养，待产牛子后进行转代，分别测量各菌株第1代、第5代和第10代对药剂的敏感性。比较培养不同代数后菌株对药剂敏感性有无明显变化。A2菌丝生长速率
无菌条件下，用直径5mm的灭菌打孔器在已培养好的敏感和抗性菌株的菌落边缘切取菌饼，用接种器将其分别接种于直径为9cm的平板中央，盖上皿盖，置于适宜温度的培养箱中培养。根据不同靶标菌的生长速率差异，每闻隔12h或24h测定一次菌落直径，每菌株重复4次。计笋菌落的均直径，绘制各菌株生长曲线，比较调套时间内抗药突变体与其亲本菌株的菌丝生长速率。A.3温度敏感性
接种抗性菌株和敏感菌株于适宜培养基的平板上，分别在4℃、10℃～18℃、20℃～30%℃和37℃下培养，每菌株重复4次。根据敏感菌株的牛长情况，测最各温度下靶标菌的菌落直径，确定敏感菌株和抗性菌株的最适生长温度：并明确抗性水平的高低与温度的敏感性是否相关。A.4游动孢子产生能力
将抗性突变体及其亲本菌株在适宜产孢的培养基上培养，待形成菌落后转移至12h光暗交替的条件下继续培养，诱导其产生孢子囊。加入10mL无菌水于培养血中，并采用适宜的方法诱导其释放游动孢子，血球让数板测定游动孢子浓度。统计分析抗性菌株与其亲本菌株之间产孢能力的差异。A.5休止孢萌发能力
将游动孢子悬浮液稀释成适当浓度（10×10倍显微镜下每个视野50个～100个孢子左右），取10L于凹玻片中，在合适的培养温度和时间下培养，检查抗药性菌株和亲木敏感菌株的休止孢的萌发率。统计分析抗性菌株与其亲本菌株的休止孢明发率的差异。每菌株重复4次。各审复随机观察3个以上视野，调查孢子总数不少于200个。A.6致病力及活体产孢子囊能力
将抗性突变体及亲本菌株在适宜的培养基上培养，切取菌饼或制备孢子悬浮液，按照适的接种力5
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法将其接种于凹准备好的活休组织（叶片、果实等）或植株上。置适宜的温度、湿度和光照条件下养，待接种敏感亲本菌株的组织或植袜发病后，进行病斑面积或病情指数的调香。每菌株重复4次。并将发病部位的组织全部放入离心管中，加人定量儿菌水后用振荡器震荡3min，收集孢广凝·使其分散均，用血球计数板计数各菌株孢子囊悬浮液的浓度。计算出每个植或叶片（架实)病斑单位面积上的产拖子囊量，并分析突变体与敏感亲本菌株产孢子囊量的差异显菁性。A.7竞争力
选择产孢能力.抱子萌发能力或致病力机当的抗药性菌株和敏感菌株，制备同等浓度的孢子悬浮液,分别按照1：1,1：3和3：1的比例混合，选择适宜的接种方法将其分别接种于已准备好的活体组织(叶片，果实等)或植株上，待其发病后迹行菌株分离，俭测其中抗药性菌株和敏感菌株的比例，
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