NY/T 1859.4-2012
基本信息
标准号： NY/T 1859.4-2012
中文名称：农药抗性风险评估 第4部分：乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂抗性风险评估
标准类别：农业行业标准(NY)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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相关标签： 农药 抗性 风险 评估 乙酰 乳酸 抑制剂 除草剂
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标准简介
NY/T 1859.4-2012 农药抗性风险评估 第4部分：乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂抗性风险评估
NY/T1859.4-2012
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标准内容
ICS 65.100
中华人民共和国农业行业标准
NY/T1859.4—2012
农药抗性风险评估
第4部分：乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂抗性风险评估
Guidelines on the risk assessment for pesticide resistance-Part 4:The risk assessment of weed resistance to acetolactateSynthase ( ALS )-inhibiting herbicides2012-06-06发布
2012-09-01实施
中华人民共和国农业部
NY/T1859《农药抗性风险评估》为系列标准第1部分：总则；
一一第2部分：卵菌对杀菌剂抗药性风险评估；一第3部分：蚜虫对拟除虫菊酯类杀虫剂抗药性风险评估：一一第4部分：乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂抗性风险评估。本部分为《农药抗性风险评估》的第4部分。本部分按照（GB/T1.1—2009给出的规则起草。本部分由中华人民共和国农业部提并归口。本部分起草单位：农业部农药检定所、中国农业科学院植物保护研究所。本部分主要起草人：张宏军、张朝贤、崔海兰、张柱、周欣欣、聂东兴，土媛NY/T1859.4—2012
1范围
农药抗性风险评估
NY/T 1859.4—2012
第4部分：乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂抗性风险评估本部分规定了农药登记用乙酰乳酸合贼嗨抑制剂类除草剂抗性风险评估的原则和要求。本部分适用于杂草对乙酰乳酸台成酶抑制剂类除草剂抗性风险评估。杂草抗药性蓝测、抗药性鉴定及抗药性治理等可参照本部分执行。2规范性引用文件bZxz.net
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引文件，其最新版本(包括所有的订单)适用十本文件。NY/T1155.3农药室内生物测定试验准则除草剂第3部分：活性测定试验上壤喷雾法NY/T1155.4农药室内生物测定试验准则除草剂第4部分：活性测定试验辈叶喷雾法NY/T1155.5农药室内生物测定试验准则除草剂第5部分：水除草剂上壤活性测定试验浇灌法
NY/T1155.9农药室内生物测定试验准则除草剂第9部分：水田除草剂活性测定试验鉴叶喷雾法
NY/T1667（所有部分）农药登记管理术语NY/T1859.12010农药抗性风险评估第「部分：总则3术语和定义
NY/T1667(所有部分)界定的以及下列术语和定义适用十本文件。3. 1
乙酰乳酸合成酶acetolactate synthase，ALS，也称乙酰羟酸合酶acetohydroxyacil synthasc，AHAS是植物和微生物体内缬氨酸、亮氨酸、异完氨酸这3种支链氨基酸生物合成过程巾第阶段的关键性酶，也已被证明是一种重要的除草剂靶标。3.2
乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂ALS-inhibitingherbicide是一类以乙酰乳酸合成酶为靶标的除草剂。此类除草剂按化学结构分磺酰尿类（sullanylureas，SU)，咪唑啉酮类（imidazolinones，IMI)、嘧啶硫代苯甲酸酯类（pyrimidinylthiobenzaates，PTB）、唑并嘧啶类（triazolopyrinidincs，TP）、磺酰胺羰基三唑啉酮类（.sulfonylainocarhonyltriazolinone.ScT）等3.3
生长抑制中量 thc dnse required to redluce shoot weight by 50% relative to untreated plants, (GRso经杂草与相应药剂的剂量反应曲线让算得到的杂草地上部分牛长抑制中量。3.4
抗性指数resistanceindex
杂草的抗性种群与敏感种群针对同-药剂的有效中量（EI)s）、抑制中澈度（IC%c）或生长抑制中量(GR）的比值，
NY/T1859.4—2012
整株生物测定法wholeplant pot experinenl药剂处理后，进行整株杂生物量测定，分别建立杂草抗性种群与敏感种群的剂量反应曲线，以生长抑制中量和抗性指数评价杂草抗药性的一种方法4抗性风险评估
4.1抗性风险的影响因子
4.1.1药剂
乙酰乳合成酶抑制剂类除剂的作用靶标单一·有超高效活性，月已有50多个品种在全球泛应用,理论上属于高抗性风险药剂。4.1.2靶标杂草
乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂主要作用靶标是阔叫杂草和痧草，部分品种也可防治禾木科杂草。种了数量人、种群中抗药性突变频宰高适合度高，理论上属于离抗药性风险靶标杂草，4.1.3农事操作风险
天面积种植单品种作物、单作或连作的农事操竹抗性风险高。凡是有利增加药剂选择压力和加重杂草发生的施药技术及裁培耕作措施均会增加抗药性风险。4.2抗性风险评估内容
4.2.1药剂特性及靶标杂草抗药性水平调查该药剂及同类药剂在当地的使用历史、使用频率，同类药剂是否有抗性的现象及抗性水平。根据乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂的作用特性、靶标杂草的特性以及抗性指数等，将抗性水平分成高和中两个级别，一般采用整株牛物测定法计算抗性种群和敏感种群的GRm或FED，相关杂草培养，药剂处理等参见VY/T1155.32006或NY/T1155.42006或NY/T1155.52006或NY/T1155.9--2008。乙酰乳酸合成酶对药剂的敏感性测定方法适用丁与靶标酶相关抗性机制的抗性水测定，测定方法见附录A,计算抗性种群和敏感种群的IC50。乙酰乳酸合成酶基因突变位点检测法适用于检测靶标酶突变引起的抗药性机制检测，以确定抗性突变的类型，测定方法见附录B。按式(1)计算抗性指数，计算结果保留小数点两位。RI - R/S
式中：
RI——抗性:指数；
R——抗性种群的Rs或ELn或ICsc单位为.克每公项（g/hm）或毫克每升（tg/L）S——敏感种群的GR或FDs或ICso，单位为克舒公颂（g/hm）或毫克每刀（mg/L）(1)
如果有同类药剂使的历史并产生了抗性，评价约剂的抗性指数人于等于10.00，为高抗性水平，如果有同类药剂使用的历史、抗性指数大于1.00小于10.00,为中等抗性水平4.2.2靶标杂草产生抗药性的潜能针对该药剂上要防除杂节，建立靶标杂卓对评估约剂的敏感性基线；通过日问采集、室内筛选，明确抗药性发牛的概率、速度和程度等。4.2.3田间抗药性产生的风险
评估在用间条件下，不采用抗性管理措施时靶标杂草对药剂产生抗药性的风险。4.2.4靶标杂草的交互抗药性分析调查该药剂及同类药剂在当地使用的厉史、使用频率，同类药剂是否针对同一种杂草有抗性的现象。
采用整株生物测定法，同时测定待评价药剂及同类已登记药剂的抗性指数，并依据其他乙酰乳酸合2
KAONiTKAa
NY/T1859.4—2012
成酶抑制剂类除草剂的抗药性发生现状和抗性水平分级，分析是否与该药剂其有交与抗性。4.2.5抗性风险级别分析
4.2.5.1如果药剂作用靶标单*、使用频率高，测定的抗性指数10.00，且有交互抗性，该药剂为高风险；
4.2.5.2如果药剂作用靶标单一、使用频率高，测定的抗性指数为10.00>抗性指数>1.00有同类药剂使用的历史,该药剂为中等风险5抗性风险管理
5.1一般原则
对于高抗性风险的乙酰乳酸合成酶抑制剂类药剂，农药生产企业需要为登记的产品提供抗性风险评估资料及管理措施，并在产品标签和使用说明书上注明相应的抗性杂节种类，是否存在交互抗性的药剂及如何规避抗性风险。对于中等抗性风险的药剂，鼓励农药生产企业为登记的产品提供抗性风险评估资料及管理借施，并在产品标签和使用说明书上注明相应的抗性杂草种类、是否存在交互抗性的药剂及如何规避抗性风险。对高抗性风险的药剂，抗性风险普理需要农药生产（经营）企业、登记管理部门、植保推广部门和使用者等共同参与。5.2抗性风险管理措施
5.2.1杂草综合治理
利用轮作，机械除节、牛物防治以及人工除草等措施防除杂草，尽量减少化学防治措施的使用次数。5. 2. 2 限制性使用技术
限定除草剂品种的年使用或连续使用次数、使用时间、使用剂量，使用区域范用、施药方法等。5.2.3混合用药
乙酰乳酸合成酶抑制剂类药剂可与氯乙酰胺类、激素类、光合系统抑制剂类等不同作机制的除草剂混合使用，延缓抗药性的发展，混合用药时，药剂组分的配比以及混合的程序等要符含农药相容性和延缓抗药性的要求。
5.2.4轮换用药
乙酰乳酸合成酶抑制剂炎药剂可与氯乙酰胺类、激素类、光合系统抑制剂类、乙酰辅酶人羧化酶抑制剂类等不同作用机制的除草剂轮换使用，延缓抗药性的发展。5.2.5负交互抗性药剂的使用
使用通过实验证明与乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂具有负交互抗性的药剂，延缓抗药性的发展。5.2.6产品标签标注
在产品标签上标注抗性风险级别，并标明相应抗性风险管理的措施。3
NY/T1859.4—2012
A1杂草准备
附录A
【规范性附录】
乙酰乳酸合成酶对药剂敏感性测定法将用间采集的计对某一药剂具有抗性和想成敏感的杂草种了作为试材，在采用整株牛物测定法确定抗性或敏感之后，分现进行裁培择，培亲方法参见NY7个1155.3惑NY7T1155.4或NYT1155.5或VY/T1155.9待杂草生长到3叶期～1叶期，选取牛长良好的敏感和抗药性种群杂草，分别取幼嫩叶片5.0冬，3次重复，样品于=70℃冻存。A.2溶液配制
磷酸缓冲液:pI[=7. 0,0. 1 m1ol/L K,HPO,KH.PO,:酶提取液:含 1 Hlmol/L 丙酮酸钠,0. 5m1ol/LMgC12+0.5tmnol/1.TPP(氯化硫腰素焦磷酸盐）,10μmol/LFAD(黄素腺嘌二核苷酸)的0. 1 nol/L pH 7. 0 的磷酸缓冲液;酶溶解液:含20 mmol/I.丙酮酸钠,0. 5 mmol/L MgCl.的 0. 1 mol/LpH 7. 的磷酸缓冲液;酶反应液:含20 mmol/1.丙酮酸钠,0.5 mmol/L MgCl20.5mimol/LIIP,1Cumol/I,FAD的0.1mol/I.p117.（的磷酸缓冲液0.5%肌酸：溶于蒸馏水5%1素酚：溶于2.5mul/LNaOH溶液，
A.3乙酰乳酸合成酶提取与活性测定取约2.5片剪碎放入项冷研钵中，液氮下快速研磨成细粉；细粉转人离心管中，准确称量出2.0g，加16mL酶提取液，混匀，冰上放置10min，于25000g、1下离心20min，收集上清液即为粗液；在粗酶液中缓慢人(NII4)2S0.晶体至50%饱和度,沉淀2 h后，于25 000 g、4℃下离心20 min，弃上清液，沉淀落于12酶裕解液中待测;以上操作均在0～4（条件下进行。在10m正离心管巾加人0.9ml.酶反应液，依次加人配制好的机应药剂母液0.1m，使相应药剂终浓度为5个~7个系列梯度浓度，如苯磺隆可设置0.01μM、0.1pM、1pM、10μM、100μM.设空口对照；加人0.5ml.酶液，摇勾后在37℃恒温水浴中略反应1h，取出后加人3mol/LHzSO.0.2，60℃水溶脱羧15min中止反应（空白对照在加人酶液前加.人HSO）；加人1mI0.5%肌酸和1nL5%甲素,f0%水浴显色 15min,迅速置于冰浴中冷却1min离心后，取上清于52tn比色.记录吸光值（A525）。试验重复3次。
A.4数据统计与分析
用DI-S（数据处理系统）,SAS（统分析系统）或SPSS(社会科学统计程/）标准统计软件数据进行统计分析，并对药剂浓度的对数值与相应吸光值的抑制率的机率值进行回归分析，计算抗性种群和敏感种群的C0值及5%置限，按式(1）计算抗性搭数，A.5结果
根据统计结果进行分析评价，出证式艺酰乳酸合成酶活力测试验报告，并列出原始数据。4
iiKAONiKAa
B.1杂草准备
附录B
（规范性附录】
乙酰乳酸合成酶基因突变位点检测法NY/T1859.4—2012
将田间采集的针对某·药剂具有抗性和敏感的杂草种广作为试材，在采用整株生物测定法确定抗性或敏感之后，分别进行盆裁培养，培养方法参见NY/T1155.3或VY/T1155.4或NY/T1155.5或NY/T1155.9。待杂草生长至3叶期～4叶期，取抗性种群和嫩感种群的叶片，每个种群取5个植株叶片，每株3片叶~4片叶（100mg～150mg），分别装袋贴好标签后保存了一70℃低温冰箱中。B.2DNA提取
分别将敏感和抗药性植株的DNA提取。DNA提取可采用CIAB法或试剂盒法（参考各试剂公司操作说明)。
B.3引物设计
根据拟南芥(在GenBank上的登记号为X51514)及与供试杂草亲缘关系相近的植物的AIS基因序列的保守区设计PCR扩增引物.这些引物需能扩增出相应杂草的AIS基内保守区序列，需包含目前已报道的突变位点。
B.4基因组扩增及测序
设计的引物扩增敏感和抗药性植株的DNA，经电泳检测后将扩增的目的片段回收纯化：与T载体（如TaKaRa公司的pMD19·Tycctor）连接后转化大肠杆菌感受态细胞（如DH5a），经蓝白斑筛选，挑取白色单菌落，并进行PCR鉴定，取阳性克隆进行测序，每个植株测序样本不少于5个。获得的序列用序列分析软件（如DNAMAN)进行序列比对分析：B.5撰写报告
与国内外抗性义献相比较，确定抗性突变位点，给出乙酰乳酸合成酶基因突变位点检测报告。5
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农药抗性风险评估
第4部分：乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂抗性风险评估
Guidelines on the risk assessment for pesticide resistance-Part 4:The risk assessment of weed resistance to acetolactateSynthase ( ALS )-inhibiting herbicides2012-06-06发布
2012-09-01实施
中华人民共和国农业部
NY/T1859《农药抗性风险评估》为系列标准第1部分：总则；
一一第2部分：卵菌对杀菌剂抗药性风险评估；一第3部分：蚜虫对拟除虫菊酯类杀虫剂抗药性风险评估：一一第4部分：乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂抗性风险评估。本部分为《农药抗性风险评估》的第4部分。本部分按照（GB/T1.1—2009给出的规则起草。本部分由中华人民共和国农业部提并归口。本部分起草单位：农业部农药检定所、中国农业科学院植物保护研究所。本部分主要起草人：张宏军、张朝贤、崔海兰、张柱、周欣欣、聂东兴，土媛NY/T1859.4—2012
1范围
农药抗性风险评估
NY/T 1859.4—2012
第4部分：乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂抗性风险评估本部分规定了农药登记用乙酰乳酸合贼嗨抑制剂类除草剂抗性风险评估的原则和要求。本部分适用于杂草对乙酰乳酸台成酶抑制剂类除草剂抗性风险评估。杂草抗药性蓝测、抗药性鉴定及抗药性治理等可参照本部分执行。2规范性引用文件bZxz.net
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引文件，其最新版本(包括所有的订单)适用十本文件。NY/T1155.3农药室内生物测定试验准则除草剂第3部分：活性测定试验上壤喷雾法NY/T1155.4农药室内生物测定试验准则除草剂第4部分：活性测定试验辈叶喷雾法NY/T1155.5农药室内生物测定试验准则除草剂第5部分：水除草剂上壤活性测定试验浇灌法
NY/T1155.9农药室内生物测定试验准则除草剂第9部分：水田除草剂活性测定试验鉴叶喷雾法
NY/T1667（所有部分）农药登记管理术语NY/T1859.12010农药抗性风险评估第「部分：总则3术语和定义
NY/T1667(所有部分)界定的以及下列术语和定义适用十本文件。3. 1
乙酰乳酸合成酶acetolactate synthase，ALS，也称乙酰羟酸合酶acetohydroxyacil synthasc，AHAS是植物和微生物体内缬氨酸、亮氨酸、异完氨酸这3种支链氨基酸生物合成过程巾第阶段的关键性酶，也已被证明是一种重要的除草剂靶标。3.2
乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂ALS-inhibitingherbicide是一类以乙酰乳酸合成酶为靶标的除草剂。此类除草剂按化学结构分磺酰尿类（sullanylureas，SU)，咪唑啉酮类（imidazolinones，IMI)、嘧啶硫代苯甲酸酯类（pyrimidinylthiobenzaates，PTB）、唑并嘧啶类（triazolopyrinidincs，TP）、磺酰胺羰基三唑啉酮类（.sulfonylainocarhonyltriazolinone.ScT）等3.3
生长抑制中量 thc dnse required to redluce shoot weight by 50% relative to untreated plants, (GRso经杂草与相应药剂的剂量反应曲线让算得到的杂草地上部分牛长抑制中量。3.4
抗性指数resistanceindex
杂草的抗性种群与敏感种群针对同-药剂的有效中量（EI)s）、抑制中澈度（IC%c）或生长抑制中量(GR）的比值，
NY/T1859.4—2012
整株生物测定法wholeplant pot experinenl药剂处理后，进行整株杂生物量测定，分别建立杂草抗性种群与敏感种群的剂量反应曲线，以生长抑制中量和抗性指数评价杂草抗药性的一种方法4抗性风险评估
4.1抗性风险的影响因子
4.1.1药剂
乙酰乳合成酶抑制剂类除剂的作用靶标单一·有超高效活性，月已有50多个品种在全球泛应用,理论上属于高抗性风险药剂。4.1.2靶标杂草
乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂主要作用靶标是阔叫杂草和痧草，部分品种也可防治禾木科杂草。种了数量人、种群中抗药性突变频宰高适合度高，理论上属于离抗药性风险靶标杂草，4.1.3农事操作风险
天面积种植单品种作物、单作或连作的农事操竹抗性风险高。凡是有利增加药剂选择压力和加重杂草发生的施药技术及裁培耕作措施均会增加抗药性风险。4.2抗性风险评估内容
4.2.1药剂特性及靶标杂草抗药性水平调查该药剂及同类药剂在当地的使用历史、使用频率，同类药剂是否有抗性的现象及抗性水平。根据乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂的作用特性、靶标杂草的特性以及抗性指数等，将抗性水平分成高和中两个级别，一般采用整株牛物测定法计算抗性种群和敏感种群的GRm或FED，相关杂草培养，药剂处理等参见VY/T1155.32006或NY/T1155.42006或NY/T1155.52006或NY/T1155.9--2008。乙酰乳酸合成酶对药剂的敏感性测定方法适用丁与靶标酶相关抗性机制的抗性水测定，测定方法见附录A,计算抗性种群和敏感种群的IC50。乙酰乳酸合成酶基因突变位点检测法适用于检测靶标酶突变引起的抗药性机制检测，以确定抗性突变的类型，测定方法见附录B。按式(1)计算抗性指数，计算结果保留小数点两位。RI - R/S
式中：
RI——抗性:指数；
R——抗性种群的Rs或ELn或ICsc单位为.克每公项（g/hm）或毫克每升（tg/L）S——敏感种群的GR或FDs或ICso，单位为克舒公颂（g/hm）或毫克每刀（mg/L）(1)
如果有同类药剂使的历史并产生了抗性，评价约剂的抗性指数人于等于10.00，为高抗性水平，如果有同类药剂使用的历史、抗性指数大于1.00小于10.00,为中等抗性水平4.2.2靶标杂草产生抗药性的潜能针对该药剂上要防除杂节，建立靶标杂卓对评估约剂的敏感性基线；通过日问采集、室内筛选，明确抗药性发牛的概率、速度和程度等。4.2.3田间抗药性产生的风险
评估在用间条件下，不采用抗性管理措施时靶标杂草对药剂产生抗药性的风险。4.2.4靶标杂草的交互抗药性分析调查该药剂及同类药剂在当地使用的厉史、使用频率，同类药剂是否针对同一种杂草有抗性的现象。
采用整株生物测定法，同时测定待评价药剂及同类已登记药剂的抗性指数，并依据其他乙酰乳酸合2
KAONiTKAa
NY/T1859.4—2012
成酶抑制剂类除草剂的抗药性发生现状和抗性水平分级，分析是否与该药剂其有交与抗性。4.2.5抗性风险级别分析
4.2.5.1如果药剂作用靶标单*、使用频率高，测定的抗性指数10.00，且有交互抗性，该药剂为高风险；
4.2.5.2如果药剂作用靶标单一、使用频率高，测定的抗性指数为10.00>抗性指数>1.00有同类药剂使用的历史,该药剂为中等风险5抗性风险管理
5.1一般原则
对于高抗性风险的乙酰乳酸合成酶抑制剂类药剂，农药生产企业需要为登记的产品提供抗性风险评估资料及管理措施，并在产品标签和使用说明书上注明相应的抗性杂节种类，是否存在交互抗性的药剂及如何规避抗性风险。对于中等抗性风险的药剂，鼓励农药生产企业为登记的产品提供抗性风险评估资料及管理借施，并在产品标签和使用说明书上注明相应的抗性杂草种类、是否存在交互抗性的药剂及如何规避抗性风险。对高抗性风险的药剂，抗性风险普理需要农药生产（经营）企业、登记管理部门、植保推广部门和使用者等共同参与。5.2抗性风险管理措施
5.2.1杂草综合治理
利用轮作，机械除节、牛物防治以及人工除草等措施防除杂草，尽量减少化学防治措施的使用次数。5. 2. 2 限制性使用技术
限定除草剂品种的年使用或连续使用次数、使用时间、使用剂量，使用区域范用、施药方法等。5.2.3混合用药
乙酰乳酸合成酶抑制剂类药剂可与氯乙酰胺类、激素类、光合系统抑制剂类等不同作机制的除草剂混合使用，延缓抗药性的发展，混合用药时，药剂组分的配比以及混合的程序等要符含农药相容性和延缓抗药性的要求。
5.2.4轮换用药
乙酰乳酸合成酶抑制剂炎药剂可与氯乙酰胺类、激素类、光合系统抑制剂类、乙酰辅酶人羧化酶抑制剂类等不同作用机制的除草剂轮换使用，延缓抗药性的发展。5.2.5负交互抗性药剂的使用
使用通过实验证明与乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂具有负交互抗性的药剂，延缓抗药性的发展。5.2.6产品标签标注
在产品标签上标注抗性风险级别，并标明相应抗性风险管理的措施。3
NY/T1859.4—2012
A1杂草准备
附录A
【规范性附录】
乙酰乳酸合成酶对药剂敏感性测定法将用间采集的计对某一药剂具有抗性和想成敏感的杂草种了作为试材，在采用整株牛物测定法确定抗性或敏感之后，分现进行裁培择，培亲方法参见NY7个1155.3惑NY7T1155.4或NYT1155.5或VY/T1155.9待杂草生长到3叶期～1叶期，选取牛长良好的敏感和抗药性种群杂草，分别取幼嫩叶片5.0冬，3次重复，样品于=70℃冻存。A.2溶液配制
磷酸缓冲液:pI[=7. 0,0. 1 m1ol/L K,HPO,KH.PO,:酶提取液:含 1 Hlmol/L 丙酮酸钠,0. 5m1ol/LMgC12+0.5tmnol/1.TPP(氯化硫腰素焦磷酸盐）,10μmol/LFAD(黄素腺嘌二核苷酸)的0. 1 nol/L pH 7. 0 的磷酸缓冲液;酶溶解液:含20 mmol/I.丙酮酸钠,0. 5 mmol/L MgCl.的 0. 1 mol/LpH 7. 的磷酸缓冲液;酶反应液:含20 mmol/1.丙酮酸钠,0.5 mmol/L MgCl20.5mimol/LIIP,1Cumol/I,FAD的0.1mol/I.p117.（的磷酸缓冲液0.5%肌酸：溶于蒸馏水5%1素酚：溶于2.5mul/LNaOH溶液，
A.3乙酰乳酸合成酶提取与活性测定取约2.5片剪碎放入项冷研钵中，液氮下快速研磨成细粉；细粉转人离心管中，准确称量出2.0g，加16mL酶提取液，混匀，冰上放置10min，于25000g、1下离心20min，收集上清液即为粗液；在粗酶液中缓慢人(NII4)2S0.晶体至50%饱和度,沉淀2 h后，于25 000 g、4℃下离心20 min，弃上清液，沉淀落于12酶裕解液中待测;以上操作均在0～4（条件下进行。在10m正离心管巾加人0.9ml.酶反应液，依次加人配制好的机应药剂母液0.1m，使相应药剂终浓度为5个~7个系列梯度浓度，如苯磺隆可设置0.01μM、0.1pM、1pM、10μM、100μM.设空口对照；加人0.5ml.酶液，摇勾后在37℃恒温水浴中略反应1h，取出后加人3mol/LHzSO.0.2，60℃水溶脱羧15min中止反应（空白对照在加人酶液前加.人HSO）；加人1mI0.5%肌酸和1nL5%甲素,f0%水浴显色 15min,迅速置于冰浴中冷却1min离心后，取上清于52tn比色.记录吸光值（A525）。试验重复3次。
A.4数据统计与分析
用DI-S（数据处理系统）,SAS（统分析系统）或SPSS(社会科学统计程/）标准统计软件数据进行统计分析，并对药剂浓度的对数值与相应吸光值的抑制率的机率值进行回归分析，计算抗性种群和敏感种群的C0值及5%置限，按式(1）计算抗性搭数，A.5结果
根据统计结果进行分析评价，出证式艺酰乳酸合成酶活力测试验报告，并列出原始数据。4
iiKAONiKAa
B.1杂草准备
附录B
（规范性附录】
乙酰乳酸合成酶基因突变位点检测法NY/T1859.4—2012
将田间采集的针对某·药剂具有抗性和敏感的杂草种广作为试材，在采用整株生物测定法确定抗性或敏感之后，分别进行盆裁培养，培养方法参见NY/T1155.3或VY/T1155.4或NY/T1155.5或NY/T1155.9。待杂草生长至3叶期～4叶期，取抗性种群和嫩感种群的叶片，每个种群取5个植株叶片，每株3片叶~4片叶（100mg～150mg），分别装袋贴好标签后保存了一70℃低温冰箱中。B.2DNA提取
分别将敏感和抗药性植株的DNA提取。DNA提取可采用CIAB法或试剂盒法（参考各试剂公司操作说明)。
B.3引物设计
根据拟南芥(在GenBank上的登记号为X51514)及与供试杂草亲缘关系相近的植物的AIS基因序列的保守区设计PCR扩增引物.这些引物需能扩增出相应杂草的AIS基内保守区序列，需包含目前已报道的突变位点。
B.4基因组扩增及测序
设计的引物扩增敏感和抗药性植株的DNA，经电泳检测后将扩增的目的片段回收纯化：与T载体（如TaKaRa公司的pMD19·Tycctor）连接后转化大肠杆菌感受态细胞（如DH5a），经蓝白斑筛选，挑取白色单菌落，并进行PCR鉴定，取阳性克隆进行测序，每个植株测序样本不少于5个。获得的序列用序列分析软件（如DNAMAN)进行序列比对分析：B.5撰写报告
与国内外抗性义献相比较，确定抗性突变位点，给出乙酰乳酸合成酶基因突变位点检测报告。5
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