NY/T 2249-2012 菠萝凋萎病病原分子检测技术规范 NY/T2249-2012 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

ICS65.020
中华人民共和国农业行业标准
NY/T2249—2012
菠萝凋萎病病原分子检测技术规范Technical specification of molecular detectionfor pineapple mealybug wilt pathogen2012-12-07发布
2013-03-01实施
中华人民共和国农业部
3发布
1范围
菠萝凋萎病病原分子检测技术规范NY/T2249—2012
本标准规定了菠萝凋萎病病原（包括菠萝调萎伴随病毒和菠萝杆状病毒）的分子检测方法。本标准适用于萝种苗及大田植株中菠萝萎伴随病毒和菠萝杆状病毒的定性检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的虚用是必不可少的以尺期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最薪（立括研有用修取适用HING
SN/T1193
中国检验实验衣票
SRESEARCHG
3术语和定义
适用受本
下列术语和定义
菠萝凋萎病病原
thogenofpineapplemealybugwil(PMiy)包括菠萝调奏件随病
pineppybugiltsoadus
和萝杆状病毒
(Pineapptebaci
TPE其电護数调美伴随病毒导
菠装调
号(PMWaV-
1)，菠萝调伴随病?2
PMWV2和业调
娄伴随病毒3号PMWaV
原的分类地
位、寄主范围、危售症快皮
热休克蛋白
heatshocprotein70 lrsp
分了量约为
伴得的
持等起着重要作用
聚合酶链式反应
模板基因序列
polymerasechain reaction PR
高消变生成为单链
在D公聚合酶作用和适有的长
计的两条引物分别与模板DNA两条链上租
酶的作用下以四种脱氧核
酸（dN
循环，使欲扩增的基因片段以儿何倍数护3.4
段工朴序列发牛退火面互
物，使引物得以延钟，然后
及特定构象的维
下，根据模板序列设
绩合·接着在DNA聚合
新重复变性、退火和延伸这
Zreverse-transeriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR逆转录聚合酶链式反应
RT-PCR是先利用依赖于RNA的DNA聚合酶，将待测RNA逆转录为DNA：再以逆转录后的一段DNA作为模板.以模板DNA两端序列互补的一对特异性寡核苷酸序列作为引物，在四种脱氧核糖核苷三磷酸存在下，利用依赖于DNA的DNA聚合酶的催化作用。经过数十次变性、退火和延伸的反应循环，使模板上介于两个引物之间的DNA片段得到特异性的技术扩增：再通过电泳等手段检测到被特异性扩增的片段。
IRNA结合区
RNAm是携带延长肽链上甲硫氨酸的tRNA，它负责识别延伸中AUG密码子。tRNAm结合区1
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为基因间隔区，该结合区为所有杆状病毒（Badnavirus）所共有。4原理
根据PMWaV-1PMWaV-2、PMWaV-3的HSP-70特有碱基序列设计特异性引物进行RT-PCR扩增·依据是否分别扩增获得预期的59obp、611bp和499bp的DNA片段，判断样品中是否携带菠萝凋菱伴随病毒：根据PBCoV的tRNAm结合区特有碱基序列设计特异性引物进行PCR扩增.依据是否扩增获得预期973bp的DNA片段，判断样品中是否携带菠萝杆状病毒。5
仪器设备、用具和试剂
按B.1和B.2的规定执行
6取样
PUBLISHING
以田间菠萝大苗村
验室检测用样量为
检测方法
7. 1PMWaV
的R-PCR检
7.1.1检测样品
参照附录
引物序列
方齿捷
女检测样品和对照精品的总
取样量为1.0g~5.0g.实
SRESEARCHE
RNA女超纯水作为空白
引物序列
BECGCACAAACTCAASCAATC
PMWaV-1
SCACAACACTCAC
PMWaV-
EACACCAA
ATOCACCAATTT
PMWaV-21
PMWaV-2R
PMW=V-3F
TGGATCIGTA
Aeroacho
PMWaV-3R
AGNETTCO
Z.1.3RT-PCR扩增发
正反义
首霜花叶病毒AMW反转录酶反应缓种液12.RT-PCR反应体系：
物PMWaV-1F,PMWaV
.RNA1，AMV反转录酶混合液
RTPCR扩增。
ICENTER
检测病毒
PMWaV-1
PMWaV-2
PMWaV-3
分别加入10μmol/L的引
LR与PMWV-3F.PMWaV-3R各1.5
L.加无RNA酶的超纯水天25L。
RT-PCR反应条件：50C反转录30min94反应2min火活反转录酶，9430s.不同温度退火（检测PMWaV-1退火温度为60C.PMWaV-2和PMWaV-3退火温度为55C）1min，72C延伸1min，30个循环：最后72C延伸7min。取出PCR反应管，对反应产物进行电泳检测或4℃条件下保存，存放时间不超过24h。
7.2PBCoV的PCR检测
7.2.1、引物序列
PBCoV-F5'-AGAAAAGAGAATGAACAAAC-3PBCoV-R.5-AGTGATAAAGGGTCAAATAA-3PCR片段长度为973bp。
7.2.2PCR扩增
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反应体系：10XPCR缓冲液（Mg+Plus)2.5L，TaqDNA聚合酶（5U/μL)0.25L.四种脱氧核糖核苷酸dNTP(100nmol/L)0.5μL，PBCoV-F、PBCoV-R引物（400nmol/L）各1μL，加超纯水补足25μLPCR反应条件：94℃2min：然后进入35个循环，94℃30s，52C30s.72℃1min：最后72C延伸10min。取出PCR反应管，对反应产物进行电泳检测或4C条件下保存，存放时间不超过24h。7.3反应体系中对照的设置
7.3.1阳性对照样品
以温室培养经菠萝粉蚜传毒接种后，呈现典型症状确定感染波萝调萎伴随病毒的菠萝叶片为材料，提取总RNA，以其为模板合成cDNA第一链，作为PMWaVs检测体系的阳性对照以温室培养经菠萝粉传毒接种后，呈现典型症状确定感染菠萝杆状病毒的菠萝叶片为材料，提取基因组DNA，作为PBCoV检测体系的阳性对照。7.3.2阴性对照样品
用脱毒的菠萝组培苗提取的总核酸作为样品阴性对照。7.3.3PCR反应体系阴性对照
用配制反应体系的无菌超纯水代替DNA模板，检测试剂是否受到污染8琼脂糖电泳
按B.8的规定执行。
9凝胶成像分析
将电泳后的琼脂糖凝胶置于紫外凝胶成像仪系统观察窗内，根据DNA分子量标准估计扩增条带的大小，并拍照保存，参考图1和图2。2.000bp
1000bp
250hp-611bp
图1菠萝凋萎伴随病毒PCR检测结果电泳图注：图中M为标准分子量，1~3分别为PMWaV-3样品、阴性对照和PMWaV-3阳性对照：4-6分别为PMWaV1样品、阴性对照和PMWaV-1阳性对照：7~9分别为PMWaV-2样品、阴性对照和PMWaV-2阳性对照。3M
←2000bp
973bp4
图2菠萝杆状病毒PCR检测结果电泳图注：图中M为标准分子量，1-3分别为PBCoV样品、PMWV-3阳性对照和阴性对照3
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10防污染措施
检测过程中防污染措施按SN/T1193的规定执行。11结果判定
11.1反应体系正常与否的判定
如果阳性对照样品出现目的扩增条带·阴性对照样品和PCR反应体系阴性对照不出现目的条带，表明PCR反应体系正常。
如果阳性对照样品未出现目的扩增条带，或PCR反应体系阴性对照出现目的条带，或阴性对照样品出现目的条带，表明PCR反应体系不正常.需更换试剂，重新进行PCR检测。具体操作按7.1.3和7.2.2的规定执行。
11.2送检样品阴性判定
在PCR反应体系正常的条件下，如果待检样品没有出现与阳性对照样品相同大小的目的扩增条带，则需要重新提取待检样品总RNA或DNA进行RT-PCR(加人引物PMWaV-1F、PMWaV-IR，PMWaV-2F、PMWaV-2R与PMWaV-3F.PMWaV-3R）或PCR检测(加人引物PBCoV-FPBCoV-R）.具体操作按7.1.3和7.2.2的规定执行·如果待检样品仍未出现与阳性对照相同大小的目的扩增条带，该待测样品可判为阴性.即待检样品未携带菠萝凋萎伴随病毒（PMWaV）或菠萝杆状病毒（PBCoV）
如果第二次检测待检样品出现与阳性对照样品相同大小的目的扩增条带，则初步判定为阳性，按11.3的程序检验。
11.3送检样品阳性判定
如果待检样品的PCR扩增产物出现与阳性对照相同大小的目的扩增条带，该样品初步判为阳性；将提取的总核酸分别进行RT-PCR(加人引物PMWaV-1F、PMWaV-1R.PMWaV-2FPMWaV-2R与PMWaV-3F、PMWaV-3R)或PCR检测（加人引物PBCoV-F、PBCoV-R）.如果仍出现与阳性对照样品相同大小的目的扩增条带.即可判定待检样品携带菠萝调萎伴随病毒（PMWaV）或萝杆状病毒（PBCoV）。
如果第二次检测待检样品未出现与阳性对照相同大小的目的扩增条带，则重做一次PCR再次验证，以此次结果为最终判定依据。11.4结果记录
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间、地点、植株生长状况，检测时间、地点、方法和结果等，并有经手人和实验室检测人员的亲笔签名。PCR检测电泳结果图片须妥善保存备查。12样品保存及销毁
经检测确定携带PMWaV或PBCoV的阳性样品经液氮干燥后，于一70C以下保存30d以备复核，同时将已知感染病毒的波萝植株种植在温室保存，以备试验用。保存的样品必须做好登记和标记工作。保存期过后的样品及用具应进行灭活处理。4
A.1分类地位
A.1.1菠萝凋萎伴随病毒
附录A
【资料性附录】
菠萝凋萎病病原背景资料
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属长线病毒科（Closterouirdae）葡葡卷叶病毒属Ambeloriras)学名为Pineapplemealybugwiit
SEINGRESEARCIR
associated rirus。
已发现和报道的菠草调类病毒有更已是么种另波更美病毒1).枝调美
associated wirus 1,PMWay
未定名种为：菠萝调
引起菠萝调萎病的
A.1.2菠萝杆
菠萝杆状疗
状DNA病毒
A.2寄主范围
A.2.1菠萝凋
菠萝素
杂草如须芒
A.2.2菠萝
PBCoV石
致病树毒
adnarn
伴随病
#车点然
A.3引起病害的
A.3.1菠费凋萎
田间菠萝发病初期的状通
调萎病
PMwavIMWa
花菜花
znasco
ineapplemealybuigilt
胃萎病
有服道表用
是叶片送渐褪绿转黄·由黄变紫红鱼十の定
中下层老叶叶缘变灰白色结死，叶边缘间下反卷，叶尖然卷，严重时整株#实小，早熟。生长旺盛或
果的菠要植株比生长势赛弱的植株发病更！毒侵染后到表现症状一般需
显（图A.1）
A.3.2菠萝杆状病毒
月~5个
用通常在高满
号(PMWaVs-3)：
我国已分离鉴定出
aulmoviridae).杆
河侵染菠萝大田
计片变紫红色，后期
亡，病株显著矮小，果
状表现更明显。菠萝受病
求的时症状表现更加典型和明
染病菠萝中PMWaVs的存在比较普遍，PBCoV是除PMWaVs外侵染菠萝的一种主要病毒，其与菠萝凋萎病虽未呈现明显的相关性，但在凋萎病隐症植株以及显症菠萝上均能检测到PBCoV。A.4分布地区
A.4.1菠萝凋萎伴随病毒
1910年在美国的夏威夷首次报道菠萝凋菱病（PMW），至今该病害已在世界各菠萝种植区传播流行。
亚洲：中国（广东、广西、海南、台湾）印度、印度尼西亚、马来西亚、菲律宾、斯里兰卡。5
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非洲：毛里求斯、南非。
图A.1菠萝调萎病的症状
美洲：危地马拉、牙买加、波多黎各、美国（佛罗里达、夏威夷）、巴西、秘鲁、哥斯达黎加、丰亚那、洪都拉斯、古巴。
大洋洲：澳大利亚。
欧洲：西班牙。
A.4.2菠萝杆状病毒
中国、澳大利亚、美国（夏威夷）。A.5传播途径
A.5.1菠萝凋萎伴随病毒
主要以菠萝粉包括菠萝洁白粉（Dysmicoccusbreuipes）和新萝灰粉（Dneobreuzipes）为媒介进行传播。不能机械接种进行传播。通过带毒的芽苗和植株组织远距离传播A.5.2菠萝杆状病毒
主要通过带毒的种苗寄主植物扩散传播，自然界中由菠萝洁白粉（Dysmicoccusbreuipes）和新菠萝灰粉（D.neobrevipes）以半持久方式进行传播。菠萝杆状病毒不能通过机械接种进行传播。A.6病毒形态及基因组
A.6.1菠萝凋菱伴随病毒
菠萝调萎病毒的粒子为弯曲的长线形，长度为1000nm～2200nm，直径约12nm。正向单链RNA分子，大小为16.9kb19.5kb，外壳蛋白（CP）亚基分子量为35ku~39ku。PMWaV-1基因长度为13.1kb，包含7个ORFs，有无尾部结构尚不清楚。在RNA聚合酶（RNA-dependentRNApolymerase，RdRp）和p6ORFs之间缺少一个基因间区，CP大小仅为28.1ku，并且缺失一个编码CPd的开放阅读框（ORF）。PMWaV-2具有典型的长线病毒科（Closteroviridae)单链RNA丝状病毒的基因组结构。PMWaV-2基因组3末端14861lnt区域包含10个ORFs，ORFla编码一个蛋白酶类蛋白酶（Papain-likeproteinase，PRO）、一个甲基转移酶（Methyltransferase，MTR）和一个解旋酶（HelicaseHEL），ORF1b编码一个依赖于RNA的RdRp，ORF2编码一个疏水蛋白，ORF3编码一个热击蛋白70（Heatshockprotein，HSP70），ORF4、ORF7ORF8、ORF9分别编码一个46ku、20ku、22ku和6ku的蛋白质，ORF5编码一个34ku的CP蛋白.ORF6编码一个CP差异蛋白，3'末端还有一个非编码区。A.6.2菠萝杆状病毒
病毒粒子为菌杆状，两端圆滑，侧边平行，无包薄膜，大小为25mm~30nm×60mm900nm，多数6
为30nm×130nm。基因组为单分子开环状双链DNA大小为7.5kb~8kb。NY/T2249—2012
单分体基因组含有3个ORF，前两个ORF编码2个小蛋白.ORF3编码一个大的多聚蛋白。ORF3上有3个高度保守的序列，分别编码天冬氨酸蛋白酶（Asparticprotease，AP），逆转录酶（Reversetranscriptase，RT）和RNA酶H(RibonucleaseH,RNaseH）：另外还有3个较保守的序列，分别是运动蛋白编码区（Movementproteindomain，MP）、富含半胱氨酸的锌指状的RNA结合区（Cysteine-richzincfinger-likeRNA-bindingregion，RB）、第二个富含半胱氨酸编码区（Secondcystein-richregion，2ndCR
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B.1设备
附录B
（规范性附录）
RT-PCR和PCR检测设备、试剂与方法PCR扩增仪、电泳仪、水平电泳槽、稳压器、高速冷冻离心机、凝胶成像分析系统、振荡器、超低温冰箱、恒温水浴锅、电子分析天平（感量为10mg）、pH计、磁力搅拌器、微波炉、高压火菌锅、烘箱、超净工作台等。
微量可调移液器（量程分别为0.1~2l，1~10，10~100，20~200，100uL~1000uL）、配套吸头、刀片、PCR管、离心管、研等。B.2试剂
三羟甲基氨基甲烷（Tris）、硼酸、氯化钠（NaCI）、十二烷基磺酸钠（SDS）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、醋酸钾（KAc）、酯酸钠（NaAe·3H,O）无水乙醇、曲拉通（TritonX-100）、β筑基乙醇、盐酸（HCI）、冰醋酸（HAc）、氢氧化钠（NaOH）、溴化乙锭等。B.3试剂的配制
B.3.1核酸抽提缓冲液
称取12.1gTris.18.61gEDTA和29.22gNaCI放置于合适的容器中，加超纯水定容到1L，灭菌冷却至室温，再加人2mLβ-巯基乙醇室温保存备用。B.3.25mol/LKAe溶液
称取49.C7gKAc放置于合适的容器中，用去离子水定容至100mL，室温保存备用。B.3.310%SDS溶液
称取10gSDS溶丁约80mL去离子水中，68C加热溶解-用浓盐酸调节pH至7.2.去离子水定容至100mL，室温保存备用。
B.3.43mol/LNaAc溶液
称取40.8gNaAc3HO溶于约40mL去离子水中，用冰醋酸调节pH至5.2.去离子水定容到100mL，室温保存备用。
B.3.50.5mol/LEDTA
称取186.13gEDTA溶于800ml.去离子水中，用氢氧化钠（NaOH）调pH至8.0.去离子水定容至1L，室温保存备用。
B.3.61mol/LTris-HCl(pH8.0)
称取121.1gTris溶解于800mL超纯水中.用盐酸（HC1)调pH至8.0.加超纯水定容至1000mL。火菌后在4C下保存备用
B.3.710mol/LNaOH
在160mL超纯水中加人80.0gNaOH，溶解后再加超纯水定容到200mL。B.3.81mol/LEDTA-—Na2（p8.0)称取372.2g乙二铵四乙酸二钠（EDTA一Na），加人70mL超纯水中，再加人适量NaOH溶液（B.3.8)，加热至完全溶解后.冷却至室温，再用NaOH溶液（B.3.8）调pH至8.0，加超纯水定容至100B
mL。灭菌后在4C下保存备用
B.3.91.2mol/LNaC
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称取70.2gNaCl.溶解于800mL超纯水中，加超纯水定容至1000mL，灭菌后室温保存备用。B.3.10TE缓冲液(pH8.0)下载标准就来标准下载网
分别量取10mLTris-HCl(B3.7）和1mLEDTANaa（B.3.9）.加超纯水定容至1000mL。灭菌后在4℃下保存备用。
B.3.11加样缓冲液
称取250.0mg溴酚蓝加10mL超纯水，在室温下溶解12h；称取250.0mg二甲基苯睛蓝，加10mL超纯水溶解：称取50.0g熊精，加30mL超纯水溶解。混合以上3种溶液，加超纯水定容至100mL，在4C下保存备用。
B.3.1250×TAE电泳缓冲液（pH8.0）称取242.2gTris，先用500mL超纯水加热搅拌溶解后，加人100mLEDTA一Naz（B.3.9）.用冰乙酸调pH至8.0.然后加超纯水定容到1000mL。使用时用超纯水稀释成1×TAEB.3.13PCR反应试剂
10×PCR缓冲液（MgPlus）、dNTP（各2.5mmol/L）、Taq聚合酶（5U/μL）、特异性引物对（20umol/L)
B.3.14其他试剂
Tris饱和酚（pH7.8）、氯仿、异戊醇、异丙醇、70%乙醇、DNA分子量标准和核酸染料。B.3.15说明
本标准所用试剂均为分析纯。除另有说明，用于RNA提取和反应的试剂均用无RNA酶的水配制及用无RNA酶的容器分装，耗材（如离心管）均经过无RNA酶处理。同时以上所有试剂均须高温高压灭菌处理121℃，1.1kg/cm2，20min。室温保存备用。B.4检测样品总RNA提取
a）取n个1.5mL去RNA酶的离心管，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每个管进行编号标记；
剪取病叶基部白色组织约100mg，液氮中迅速研磨成粉，转移至相应编号的1.5mL离心管b)
中，每管加人1mL核酸抽提和38μL和20μl基乙醇，匀浆：c）将勾浆液剧烈震荡混勾，常温下孵育5min~10min以使核蛋白分解完全；d）4℃1529×g离心10min，小心取上清液转人新的离心管中；加人等体积Tris饱和酚（pH≥7.8）：氯仿：异戊醇（25：24：1）加人200μL氯仿，充分混勺：e)
4℃1529×g离心10min，样品溶液分为三层：下层有机相、中层和上层为无色水相，将水相转f
移至新的离心管中；
加入等体积氯仿：异戊醇（24：1)，混勾.4℃1529×g离心10min，取上清液于另一新离心g
h）加人0.6倍体积异内醇沉淀核酸，4℃1529×g离心10min，弃上清液D用75%乙醇悬浮沉淀，4C1529×g离心10min，弃上清液，重复该步骤一遍；j)沉淀置于无菌操作台水平风吹5min，尽量除去乙醇；k）用50uL-100μL无RNA酶灭菌水溶解RNA沉淀：I）取6LRNA溶液于1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。剩余RNA液于70C保存备用B.5检测样品总DNA提取
剪取检测样品100mg，加入少许石英砂和液氮，快速研磨成浆状；转入1.50mL离心管中，加入19
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mL提取缓冲液和20L筑基乙醇，混勾，70℃水浴30min加人500山氯仿一异戊醇（24：1），充分摇匀，1529×g离心10min，取上清液；氯仿一异戊醇溶液再抽提一次，取上清，加人等体积的异丙醇，上下颠倒离心管混勾，静置于一20℃2h以上，离心后倒掉上清，沉淀，室温干燥：溶于200L的TE缓冲液，一20℃保存备用。
采用RNA与DNA提取试剂盒的·操作步骤参照产品说明书健康香蕉组培苗基因组DNA按同样的方法制备与保存。B.6
S凝胶制备
用TAE配制1.0%琼脂糖凝胶（电泳级）在微波炉中熔化混匀，冷却至55C左右。加人溴化乙锭或其他核酸染料（.5ug/mL），混匀，倒入制胶平台上，插上样品梳。待凝胶凝固后，轻轻拔出梳子，将带凝胶的胶板置于电泳槽中，使样品孔位于电场负极，加人足够量的1XTAE（缓冲液没过凝胶表面约1mm)。
B.7加样
在第一个加样孔中加人5LDNA标准分子量，分别取2L加样缓冲液与5LPCR的反应产物混勾，加人后面的加样品孔中。B.8电泳
通电源电泳，电压5V/cm，电泳30min后，停止电泳。将整个胶置于凝胶成像分析系统上观察，并拍照。
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