NY/T 2251-2012
基本信息
标准号： NY/T 2251-2012
中文名称：香蕉花叶心腐病和束顶病病原分子检测技术规范
标准类别：农业行业标准(NY)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准简介
NY/T 2251-2012 香蕉花叶心腐病和束顶病病原分子检测技术规范
NY/T2251-2012
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标准内容
ICS 65.020
中华人民共和国农业行业标准
NY/T2251—2012
香蕉花叶心腐病和束顶病病原分子检测技术规范
Technical specification of molecular detection for pathogen of banana mosaic andheart rot disease and bunchy lop disease2012-12-07发布
2013-03-01实施
中华人民共和国农业部
本标准按照GB/T 1.1给出的规则起草。本标准由农业部农垦局提出。
本标准由农业部热带作物及制品标准化技术委员会财口。本标准起草单位：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所。本标准主要起草人：黄俊生、彭军、杨腊英、下国芬、梁昌聪、郭立佳、刘磊。NY/T2251—2012
1范围
NY/T 2251—2012
香蕉花叶心腐病和束顶病病原分子检测技术规范本标准规定了否燕花叶心腐病和束顶病病原的分子检测力法。本标准适川丁香蕉组培培养物、种苗及人回植株上的花叶心腐病和束项病病原的定性检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引川义件·仅注口期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件,其最新版机（包括所有的修改单)适用于本文件。$V/T1193基内检验实验室技术要求3术语和定义
下列术语和疑义适川丁存文件。3.1
黄瓜花叶病毒香蕉株系cucumhermosaicvirusCMV引起香蕉花叶心腐病的病原物。该病毒的分类地位、寄主范围、地理分布及其为害症状参见附求A
香蕉束顶病毒hanana bunchy top virus,BT引起香蕉束顶病的病原物。该病毒的分类地位、寄主范围、地理分布及其为症状参见附录A，3.3
coat protein gene,CP gene
外壳蛋白基因
编码病毒外尧蛋白的基因。
复制酶基因replicasegene
编码病毒复制酶的基因。
聚合酶链式反应 polymerase chain rcaction,PCR模板基因序列先经高温变性成为单链.在T)NA聚合酶作用和造宜的反应条件下、根据模板序列设计的两条引物分别与模板TNA两条链上相应的--段互补序列发生退火而互相结合·接着在DNA聚合酶的作用下以四种脱氧核糖核酸（dNTP)为底物使引物得以延仲.然后不断重复变性、退火和延伸这一循环、使欲扩增的基因片段以几何倍数扩增，3.6
逆转录聚合酶链式反应revcrse transeription-polymerasechain reactiun,RT-PCRRT-PCR尽死利用依赖十RNA的NA聚合酶将待测RNA逆转录为 cDNA：再以逆转录后的-段DXA作：为模板.以模板DNA两端序列丘补的一对特异性寡核节酸序列作为引物，在四种脱氧核糖核节磷酸存在下利用依赖于INA的T)VA合酶的催化作用。经过数十次变性、退火和延仲的反应循坏.使模板上介于两个引物之间的DXA片段得到特异性的技术扩增，再通过电泳等于段检测到被特异性扩增的片段，
NY/T 2251—2012
多重 PCRultiplex PCR
义称多平引物 PCR 或复合 ICR,F是在同一 PCR反应体系甲加上 2对以上引物,同时扩增出多条核酸片段的PCR反应，其反应原理、反应试剂和操作过程-与一般FCR相同。4原理
根据黄瓜花叶病毒否蕉株系外壳蛋白素因的特有碱基序列设计特异性引物（扩增片段557bp），进行RT-PCR扩增。依据是否扩增获得预期557hp的TDNA片段，判断样品中是否携带黄瓜花叶病毒香蕉株系。根据香蕉束顶病毒复制酶基因特有碱基序列设计异性引物（扩增片段748bp)，进行PCR扩增。依据是否扩增获得预期748bp的TDNA.片段，判断样中是否携带策项病毒。5器设备及试剂
见 1 和 R. 2。
6取样
6.1田间香蕉檀株
按附录A摘的症状仔细检查田间香蕉植株和吸芽，取预叶下第三片叶的中脉，联样量为5.0g10.0g，实验室检测用样量为0.1g。6.2香蕉组培培养物、种苗
取香蕉球整部位：取样量为.1.0多～5.0名，实验室检测用样量为0.1g。7CMV香薰株系和BBTV多量PCR检测7. 1总核酸提取
见B 4. 1..
7.2多重PCR友应Www.bzxZ.net
7.2.1cDNA第一链合成反应
在0.5ml,PCR薄壁管中,加入总核酸2μL.无RNA酶超纯水 3:5μL,在管中加CMV μrimer 2(10[μmol/L)1uL，轻轻滤勾、离心，70℃保温5min后立即冰浴至少1min。然后产格按照顺序依次加人卜列试剂的混合物：1a×PCR缓冲液（Mg+Plus)1L，RiNA酶抑制剂（40U/>0.5L，dNTP(10mmol/L)1 μL,二硫苏糖醇(DTT,0.1 mol/L)0.5:μL.轻轻混勾,离心,12C孵育-2 min~5min;加人高效RNA逆转录酶（200/）0.5，反应终体积为10L，在55C水浴中群育60min；于70C加热15min 以终止反应。合成的 cINA放置在一20℃保存备用。7.2.2PCR反应
在PCR薄壁管中分别加人以下试剂后进行FCR度应10jiLcDNA第一链合成产物，10×PCR缓冲被(Mg2|Plus)4μL,dATP混合物(10mmol/L)1μL,特异性[物(20 umol/L.,序列见表1)各0.25TagDNA聚合酶（5/u)0.2，无菌超纯水5.8，总反应体积为25l表 引物序列
BBTV primer 1
BBTV μriner 2
CMV primer 1
CMV priter2
引物序列
3-ATGTGGTATGCTGCATGTTC-3'
{5'- GGTTCATATTTCCCGCTTTGA 3-'- CACCCAAOCITIGIGGGTAG - S5'- CAACACTGCCAACTCAGCTC 3
正反义
扩增片段
557 boy
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反应条件:94C预变性3min;然后进行35个循环：94℃变性35s,60℃退火 30 s,72℃延伸45 s;最后72℃延伸7min。取出PCR反应管，对反成产物进行电泳检测或4（条件下保存，存放时间不超过24h,
7.3反应体系中对照的设置
7.3.1样品阳性对照
用温室栽培经过汁液摩擦接种且症状典型确定感染 CMV 的香蕉植株 RNA,并经 7.2.1合成的cDNA第一链作为MV香燕袜系检测体系的阳性对照。用温率栽培通过蚜虫传毒接种且症状典型确定感染BBTV的香燕植株基因组DNA作为BBTV捡测体系的阳性对照。
7.3.2样品阴性对照
用经过脱毒的健康香蕉组培苗提取的总核酸作为样品阴性对照。7.3.3PCR反应体系阴性对照
用配制反应体系的儿菌超纯水代替DNA模板，检测试剂是否受到污染。7.4PCR产物凝胶电泳检测
琼脂糖凝胶的制备及其电泳见B.4.2和B.4.3。7.5凝胶成像分析
将整块琼脂糖凝胶置于紫外凝胶成像仪系统观察窗内，根据DNA分子量标准估计扩增条带的大小，并拍照保存，参考图见图1。(k
2 000 bp
-PCR 反应体系阴性对照;
-样品潮性对照；
M-DL2000标准分了量：
1~ 2--PCR 体系中仅存在 LBLTV 模板的扩增结果;3-.1
1000hp
S00 hp
-PCR怀系中仅存作:CMV香蒸株系模板的扩增结果：
-FCR体系中同时有在BBTV,CMV 香5 ~ 6-
蕉株系麒板的扩增结果。
图1CMV香蕉株系和BBIV的多重PCR检测结果电泳图7.6防污染措施
检测过程中防污染措施按照SN/T1193中的规定执行。8结果判定
接表2.表3判定结果：
NY/T 2251—2012
表2CMV香蕉株系RT-HCR检测结果判定别定条件
RT-[R产物在557处是条带现(见图1PCR反底体
系阴性刘照
是/否
是/否
样品舒生
样铝阳性奇照
扩增片段大小
557 hr:
检测伴而
扩增片没人心
结果判
检测峰品是否含CMV香燕株系
川温室裁培经过汁液摩擦接种后，香焦生叶心腐病症状典型，确定感染CMV否黛株系·反之则:ACMV香燕株系
检测并品不含CMV香焦株系
检测续果无效.将实验中的所有试剂更倦·并草新提最检样品的总酸，进行多重PCR抢测表 3 BBIVPCR 检测结果判定
判定条竹
PLR 产物在 7.18 bp 处是否有案肾出现(死图 1)PCR反应体
系阴性对照
9结果记录
祥品阴性
是/香
样品可性对照
扩增片段大小
是/个
是/香
检测样品
扩增吗没大小
是/否
是/布
结果圳定
检测详品是传含 HBTV
温室裁培还过蚜山传毒接种后·香蕉策顶病毒症状典型.确定感染T3ITV.及之圳无HHTV格测样品不含EBT
检测结臭无效.将实验中的所有试剂更换-为币新提取检测样品的总陵，达行多重检测完整的实验记录包括：样品的米源、种类、时间、聪点和植株生长状况，检测时问、地点、方法和结果等、并有经于人和实验室检测人员的亲笔签名，PCR检测电泳结果图片须妥善保存备查。10样品保存及销毁
经检测确定携带（MV或BBTV的附性样品经液氮干燥后：十·-70℃以下保存30d以备复核，同时将已知感染病毒的香植株种植在温案保存，以备试验用，保存的样品必须做好登记和标记作。保存期过后的样品及用其成进行灭活处理。A.1学名
附录A
【资料性附录”
香蕉花叶心腐病、香蕉束顶病病原的背景资料A.1.1香蕉花叶心腐病病原
黄瓜花叶病毒香蕉株系学名：Cucumbernosatcuinus.写：CMVA.1.2香蕉束顶病病原
香焦束项病毒学名：Bananabunchytopirux，缩写：BrV4.2分类地位
A.2. 1CMV
雀麦花叶病毒科（Bromnvitidar）.黄瓜花叶病毒遇（（ucumntirus）A. 2.2 BHTV
矮缩病毒科(Naunaviridae）.否蕉束顶病毒属（Babut.irus)。A.3形态特征
A.3.1香蕉花叶心腐病病原
病毒粒子为等轴对称的：！面体，无包膜，直径约29nm。A.3.2香蕉束顶病病原
病毒粒体球状，直径约18mm。
A.4基因组
A4.1香蕉花叶心腐病病原
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三分体球彩 +ssRNA.RNA 1 长 3 337 nt,RNA2 长 3 050 nr.RNA 3 长 2 216 nt.RNA 4 为 RNA 3的亚基因组RA，长IOcOnt，
A.4.2香蕉束顶病病原
该病毒的基因组至少由6个组分所组成；每个组分是单链环状DNA（ssI)NA).并包装4个病寿粒体内;6个组分的 ssDNA长度均为1018bp1111bp;6个组分中有5个含有单个大的开阅读其中组份1编码复制酶，组份3编码外克强、组份4编码运动蛋白，其他3个组份不清，A5寄主范围
A.5.1香蕉花叶心腐病病原
除侵染香焦（Misaspu.）外，还可浸染大熊（Mzsuspp：）以及荫芦科（Cucurbitaccae）利茄科（So-lanaccac)多种作物和多种杂草
A.5.2香蕉束顶病病原
自然界主要侵染香焦Musap.）。A6地理分布
A.6.1香蕉花叶心腐病
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世界各香蕉种植区均有分布。
A6.2香蕉束顶病
世界各香蕉种植区均有分布。
A.7危害症状
A.7.1香蕉花叶心腐病
同一植株上通常是花叶和心腐症状同时存在，但有时也仅见花叶或心腐症状。植株早期感病，蕉株矮缩，甚至死亡；成株期感病生长衰弱，能抽蕾，但不能结成有经济价值的蕉果，为害极大。花叶症状为典型花叶斑驳状，叶片呈褪绿黄色条纹，尤以近顶部片叶最明显，叶脉微肿凸。心腐症状表现为假茎内侧初现黄褐色水渍状小点，后扩大并联合成黑褐色坏死条纹或坏死斑块，病株根、茎横剖面亦呈黑褐色坏死斑点或斑块（参见图A.1)。图A1香蕉花叶心腐病症状
A.7.2香蕉束顶病
主要症状表现为植株矮化，新生中叶片窄、短、直、硬，病叶质脆呈束状，在叶柄及茎秆上常见深色条纹，俗称“黑筋”。老化叶片叶缘退绿黄化，中脉周围浓绿（参见图A.2）。图A.2香蕉束顶病症状
A.8传播途径
A.8.1香蒸花叶心腐病
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黛园中自然传每媒介主要是蚜虫，病株和带病的种苗调运是远距离传播的途径。摩擦接种病株汁液也可近距离传播。
A.8.2香蕉束顶病
通过香燕交脉蚜（Pentalunianigramerrosa）以半持久性方式传播，带病毒的吸芽和种苗调运是远距高传播的途径，摩擦接种病株汁液不能传播。7
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B.1仪器设备
附录B
【规范性附录】
RT-IPCR和PCR检测所需仪器、试剂与方法PCR扩增仪、台式冷冻离心机、振荡仪、冰箱（2℃-8℃和一20C两种），超低温冰箱、恒温水浴锅、电子分析大平(感量为0.1 Tig)、II 、中泳系统、凝胶成像系统、量可调移液器（量程分别为0. : μl,~2 μl., 1 μ, 1 μl.,i0 μ[.-100 μl.,20 μl-- 200 μl100 r--1 000 μL)—套及配套吸头,离心管、刀片、PCR 管、研钵等;
B.2试剂
三羟中基氨基甲烷(Tris）.硼骏、氯化钠（NaCI)、I二烷基磺酸钠(SDS）二~胺叫乙酸钠（EI)TA)、酷酸钟（KAc）,醋酸钠（NaAc·3H:)、无水乙醇、曲拉通（Iri1onX-100）B-巯正乙婷、盐酸(HCI)冰酷酸(HAc）氢氧化钠(NaOH）、碳酸二乙酯(D)EPC）、二硫苏潴醇(DTT)等，B.3试剂的配制
B.3.1核酸抽提缓冲液
称取12.1Tri*，18.6gFT)T和29.2gNaC1放置」合适的容器中，加超纯水定容到1000ml.，灭菌冷却至案，再加人2Iml.3-筑基乙醇，室温保存备用。B.3.25 mol/L KAc溶液
称收=9.1KAc放置于合适的容器中，用去离于水定容100 mL，室温保存备用。B.3.310% SIS溶液
称取 10 g ST溶丁约 8 ml.去离子水中,68C加热溶解,用 HCI调节 pH 至7.2.去离子水定穿至100ml.室温保存备用。
B.3.43mol/L NaAt:溶液
称取0.8NaAc-3TI,溶1约10ml.去离子水币HA调节pH至5.2.去离子水定容到100ml，室温保存备H。
R. 3.5 0. 5 mol/L EDTA
称取T86.1EUTA济」800ml去离子水，用NaH调pH到8.0.去离了水定容至100CmL.室湖保存备用
B. 3. 61 rmol/ L Tris-HCl(pII 8. 0)称取121.1g1ri溶解于800ml.超纯水中,用HCl调pH至8.0.加超纯水定容至1000ml.灭菌店在4C卜保存备H。
B.3.710 mol/I.NaOH
在160ml.超纯水中加人80.0gNa0H.溶解后再加超纯水定容到200mlB.3.81mol/1. I1)TA-Naz (pH 8.0)称取372.2gHI)TA-Va2加人791m.超纯水中.加人适量NaOH溶液（B.3.7).加热至完全溶解后.冷却至率温.再用Na)H溶液（B.3.7)调pII至8.0.加超纯水定容至100ml，火菌后在4C下保存备用，
B. 3. 91. 2 mol/ L. NaCl
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称取70.2gNl.济解于800ml.超纯水中.加超纯水定容至1000ml灭菌后案温保存备川：B.3.10TE缓冲液(pH8.0)
分别量取10 ml.Tris-HCl(R 3.6)和1ml.ELTANa（B.3.8),加超纯水定容至10m，灭菌后在4℃:下保存备用。
B.3.11加样缓冲液
称取2500mg溴蓝.加10ml.超纯水，在案温下溶解12h;称取230.0mg二[基苯腈蓝：加1CmI.超纯水济解，称取50.0g熟，加30mL超纯水溶解，混合以上3种溶峻.加超纯水定容至10gmL:在1℃下保存备用。
B. 3. 1250 × TAE 电泳缓冲液(pH 8. D)称取242.2gTris，先用500mI超纯水加热搅拌溶解后.加人100ml.EF)1ANa:（B.3.8）,用HA调pH至8.0.然店加超纯水定容到1C00mI.使用时用超纯水稀释成1×TAEB.3.13PCR反应试剂
10XPCR缓冲液（Mg-Plus）、四种脱氙核糖核酸（clVTP.各2.mmol/1)、Ta案合酶（5U/l）、特异性引物对(20μmol/L)。
B.3. 14其他试剂
氯仿、异戊醇、异丙醇、70为艺醇、DVA分子量标准、核酸染料。B.3. 15说明
本标准所用试剂均为分析纯。除刃有说明，用于RNA提取和反成的试剂均用无RNA酶的水配制及叫无RVA酶的容器分装耗材（如离心管）均经过无RNA酶处理。同时以1所有试剂均须高温高压灭菌处现(121(.,1.1 kg/cm)20 minR.4方法
B.4.1总核酸提取
在灭菌的1.GmL离心管中加人被检样品、样品阳性对照、样品阴性对照，许按一定顺序缩号，每管加人0.1g检测样品，加液氮后用下净的研棒研磨·然后加抽提缓冲液1.5ml.充分泥匀（不能过小弧烈.以免产生乳化层，也叮以用手题倒混勾），按每750ul.拖提缓冲液人100l的比例加人10SLS65C水浴201mi130in,吸液时汁意更换吸头以避免交叉污染：加人500l.5mol/1.KAc.静置冰上20 Imin后，1500℃×g离心15min;取各管中的t清液400μl.转移至相应的2. 作ml.离心管中-期人0.1倍体积NaAc:3倍体积的无水醇颠倒混匀.一20℃放置至少2h以上4℃、1500×g离心15min(离心管开口保持朝离心机转轴方向放置）小心倒去上清，倒置于吸水纸上，吸下余液：加20%叫.70乙醇,颠倒洗涤；于1℃15000×g离心10mim.小心例去上清.倒置丁吸水纸上，尽量吸T余液;930×g离心10 s（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置）将1:消液全部倒掉，室温十燥3min:加人20μL无RNA悔超纯水轻轻滤句.济解管壁上的沉凝.10×吕离心5.泳「:保存备用提取的总核酸必须在2h内进行PCR检测，若需长期保存须效置70冰箱、采用RVA与DNA提取试剂盒的.操作步骤参照品说明书。健康香蕉组培脂基因纠TDVA按同样的方法制备与保存B.4.2凝胶制备
用1×TAET作液配制1.0外琼脂糖凝胶，在微波炉中溶化说句-冷却至60C左右：垢人核酸染料：混匀·倒人胶槽.捕L样品梳;待凝胶凝固后，拔出固定在凝胶中的样品梳：将带凝胶的胶板罩于电泳槽中-使样品孔位于电场负被·间电泳槽中期人1×TAE泳缓冲液（缓冲液越过凝胶表面即可）。B.4.3加样与电泳
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取1μl.加样缓冲液与5uL PCR反应产物.混勾，然后分别将其和DNA分子量标准加人到电泳槽的负极样品孔中；接通电源，电泳电压为5V/cI1：当加样缓冲液中的漠酚蓝迁移到凝胶1/2位置，切断电源，停止电泳。
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2013-03-01实施
中华人民共和国农业部
本标准按照GB/T 1.1给出的规则起草。本标准由农业部农垦局提出。
本标准由农业部热带作物及制品标准化技术委员会财口。本标准起草单位：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所。本标准主要起草人：黄俊生、彭军、杨腊英、下国芬、梁昌聪、郭立佳、刘磊。NY/T2251—2012
1范围
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香蕉花叶心腐病和束顶病病原分子检测技术规范本标准规定了否燕花叶心腐病和束顶病病原的分子检测力法。本标准适川丁香蕉组培培养物、种苗及人回植株上的花叶心腐病和束项病病原的定性检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引川义件·仅注口期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件,其最新版机（包括所有的修改单)适用于本文件。$V/T1193基内检验实验室技术要求3术语和定义
下列术语和疑义适川丁存文件。3.1
黄瓜花叶病毒香蕉株系cucumhermosaicvirusCMV引起香蕉花叶心腐病的病原物。该病毒的分类地位、寄主范围、地理分布及其为害症状参见附求A
香蕉束顶病毒hanana bunchy top virus,BT引起香蕉束顶病的病原物。该病毒的分类地位、寄主范围、地理分布及其为症状参见附录A，3.3
coat protein gene,CP gene
外壳蛋白基因
编码病毒外尧蛋白的基因。
复制酶基因replicasegene
编码病毒复制酶的基因。
聚合酶链式反应 polymerase chain rcaction,PCR模板基因序列先经高温变性成为单链.在T)NA聚合酶作用和造宜的反应条件下、根据模板序列设计的两条引物分别与模板TNA两条链上相应的--段互补序列发生退火而互相结合·接着在DNA聚合酶的作用下以四种脱氧核糖核酸（dNTP)为底物使引物得以延仲.然后不断重复变性、退火和延伸这一循环、使欲扩增的基因片段以几何倍数扩增，3.6
逆转录聚合酶链式反应revcrse transeription-polymerasechain reactiun,RT-PCRRT-PCR尽死利用依赖十RNA的NA聚合酶将待测RNA逆转录为 cDNA：再以逆转录后的-段DXA作：为模板.以模板DNA两端序列丘补的一对特异性寡核节酸序列作为引物，在四种脱氧核糖核节磷酸存在下利用依赖于INA的T)VA合酶的催化作用。经过数十次变性、退火和延仲的反应循坏.使模板上介于两个引物之间的DXA片段得到特异性的技术扩增，再通过电泳等于段检测到被特异性扩增的片段，
NY/T 2251—2012
多重 PCRultiplex PCR
义称多平引物 PCR 或复合 ICR,F是在同一 PCR反应体系甲加上 2对以上引物,同时扩增出多条核酸片段的PCR反应，其反应原理、反应试剂和操作过程-与一般FCR相同。4原理
根据黄瓜花叶病毒否蕉株系外壳蛋白素因的特有碱基序列设计特异性引物（扩增片段557bp），进行RT-PCR扩增。依据是否扩增获得预期557hp的TDNA片段，判断样品中是否携带黄瓜花叶病毒香蕉株系。根据香蕉束顶病毒复制酶基因特有碱基序列设计异性引物（扩增片段748bp)，进行PCR扩增。依据是否扩增获得预期748bp的TDNA.片段，判断样中是否携带策项病毒。5器设备及试剂
见 1 和 R. 2。
6取样
6.1田间香蕉檀株
按附录A摘的症状仔细检查田间香蕉植株和吸芽，取预叶下第三片叶的中脉，联样量为5.0g10.0g，实验室检测用样量为0.1g。6.2香蕉组培培养物、种苗
取香蕉球整部位：取样量为.1.0多～5.0名，实验室检测用样量为0.1g。7CMV香薰株系和BBTV多量PCR检测7. 1总核酸提取
见B 4. 1..
7.2多重PCR友应Www.bzxZ.net
7.2.1cDNA第一链合成反应
在0.5ml,PCR薄壁管中,加入总核酸2μL.无RNA酶超纯水 3:5μL,在管中加CMV μrimer 2(10[μmol/L)1uL，轻轻滤勾、离心，70℃保温5min后立即冰浴至少1min。然后产格按照顺序依次加人卜列试剂的混合物：1a×PCR缓冲液（Mg+Plus)1L，RiNA酶抑制剂（40U/>0.5L，dNTP(10mmol/L)1 μL,二硫苏糖醇(DTT,0.1 mol/L)0.5:μL.轻轻混勾,离心,12C孵育-2 min~5min;加人高效RNA逆转录酶（200/）0.5，反应终体积为10L，在55C水浴中群育60min；于70C加热15min 以终止反应。合成的 cINA放置在一20℃保存备用。7.2.2PCR反应
在PCR薄壁管中分别加人以下试剂后进行FCR度应10jiLcDNA第一链合成产物，10×PCR缓冲被(Mg2|Plus)4μL,dATP混合物(10mmol/L)1μL,特异性[物(20 umol/L.,序列见表1)各0.25TagDNA聚合酶（5/u)0.2，无菌超纯水5.8，总反应体积为25l表 引物序列
BBTV primer 1
BBTV μriner 2
CMV primer 1
CMV priter2
引物序列
3-ATGTGGTATGCTGCATGTTC-3'
{5'- GGTTCATATTTCCCGCTTTGA 3-'- CACCCAAOCITIGIGGGTAG - S5'- CAACACTGCCAACTCAGCTC 3
正反义
扩增片段
557 boy
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反应条件:94C预变性3min;然后进行35个循环：94℃变性35s,60℃退火 30 s,72℃延伸45 s;最后72℃延伸7min。取出PCR反应管，对反成产物进行电泳检测或4（条件下保存，存放时间不超过24h,
7.3反应体系中对照的设置
7.3.1样品阳性对照
用温室栽培经过汁液摩擦接种且症状典型确定感染 CMV 的香蕉植株 RNA,并经 7.2.1合成的cDNA第一链作为MV香燕袜系检测体系的阳性对照。用温率栽培通过蚜虫传毒接种且症状典型确定感染BBTV的香燕植株基因组DNA作为BBTV捡测体系的阳性对照。
7.3.2样品阴性对照
用经过脱毒的健康香蕉组培苗提取的总核酸作为样品阴性对照。7.3.3PCR反应体系阴性对照
用配制反应体系的儿菌超纯水代替DNA模板，检测试剂是否受到污染。7.4PCR产物凝胶电泳检测
琼脂糖凝胶的制备及其电泳见B.4.2和B.4.3。7.5凝胶成像分析
将整块琼脂糖凝胶置于紫外凝胶成像仪系统观察窗内，根据DNA分子量标准估计扩增条带的大小，并拍照保存，参考图见图1。(k
2 000 bp
-PCR 反应体系阴性对照;
-样品潮性对照；
M-DL2000标准分了量：
1~ 2--PCR 体系中仅存在 LBLTV 模板的扩增结果;3-.1
1000hp
S00 hp
-PCR怀系中仅存作:CMV香蒸株系模板的扩增结果：
-FCR体系中同时有在BBTV,CMV 香5 ~ 6-
蕉株系麒板的扩增结果。
图1CMV香蕉株系和BBIV的多重PCR检测结果电泳图7.6防污染措施
检测过程中防污染措施按照SN/T1193中的规定执行。8结果判定
接表2.表3判定结果：
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表2CMV香蕉株系RT-HCR检测结果判定别定条件
RT-[R产物在557处是条带现(见图1PCR反底体
系阴性刘照
是/否
是/否
样品舒生
样铝阳性奇照
扩增片段大小
557 hr:
检测伴而
扩增片没人心
结果判
检测峰品是否含CMV香燕株系
川温室裁培经过汁液摩擦接种后，香焦生叶心腐病症状典型，确定感染CMV否黛株系·反之则:ACMV香燕株系
检测并品不含CMV香焦株系
检测续果无效.将实验中的所有试剂更倦·并草新提最检样品的总酸，进行多重PCR抢测表 3 BBIVPCR 检测结果判定
判定条竹
PLR 产物在 7.18 bp 处是否有案肾出现(死图 1)PCR反应体
系阴性对照
9结果记录
祥品阴性
是/香
样品可性对照
扩增片段大小
是/个
是/香
检测样品
扩增吗没大小
是/否
是/布
结果圳定
检测详品是传含 HBTV
温室裁培还过蚜山传毒接种后·香蕉策顶病毒症状典型.确定感染T3ITV.及之圳无HHTV格测样品不含EBT
检测结臭无效.将实验中的所有试剂更换-为币新提取检测样品的总陵，达行多重检测完整的实验记录包括：样品的米源、种类、时间、聪点和植株生长状况，检测时问、地点、方法和结果等、并有经于人和实验室检测人员的亲笔签名，PCR检测电泳结果图片须妥善保存备查。10样品保存及销毁
经检测确定携带（MV或BBTV的附性样品经液氮干燥后：十·-70℃以下保存30d以备复核，同时将已知感染病毒的香植株种植在温案保存，以备试验用，保存的样品必须做好登记和标记作。保存期过后的样品及用其成进行灭活处理。A.1学名
附录A
【资料性附录”
香蕉花叶心腐病、香蕉束顶病病原的背景资料A.1.1香蕉花叶心腐病病原
黄瓜花叶病毒香蕉株系学名：Cucumbernosatcuinus.写：CMVA.1.2香蕉束顶病病原
香焦束项病毒学名：Bananabunchytopirux，缩写：BrV4.2分类地位
A.2. 1CMV
雀麦花叶病毒科（Bromnvitidar）.黄瓜花叶病毒遇（（ucumntirus）A. 2.2 BHTV
矮缩病毒科(Naunaviridae）.否蕉束顶病毒属（Babut.irus)。A.3形态特征
A.3.1香蕉花叶心腐病病原
病毒粒子为等轴对称的：！面体，无包膜，直径约29nm。A.3.2香蕉束顶病病原
病毒粒体球状，直径约18mm。
A.4基因组
A4.1香蕉花叶心腐病病原
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三分体球彩 +ssRNA.RNA 1 长 3 337 nt,RNA2 长 3 050 nr.RNA 3 长 2 216 nt.RNA 4 为 RNA 3的亚基因组RA，长IOcOnt，
A.4.2香蕉束顶病病原
该病毒的基因组至少由6个组分所组成；每个组分是单链环状DNA（ssI)NA).并包装4个病寿粒体内;6个组分的 ssDNA长度均为1018bp1111bp;6个组分中有5个含有单个大的开阅读其中组份1编码复制酶，组份3编码外克强、组份4编码运动蛋白，其他3个组份不清，A5寄主范围
A.5.1香蕉花叶心腐病病原
除侵染香焦（Misaspu.）外，还可浸染大熊（Mzsuspp：）以及荫芦科（Cucurbitaccae）利茄科（So-lanaccac)多种作物和多种杂草
A.5.2香蕉束顶病病原
自然界主要侵染香焦Musap.）。A6地理分布
A.6.1香蕉花叶心腐病
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世界各香蕉种植区均有分布。
A6.2香蕉束顶病
世界各香蕉种植区均有分布。
A.7危害症状
A.7.1香蕉花叶心腐病
同一植株上通常是花叶和心腐症状同时存在，但有时也仅见花叶或心腐症状。植株早期感病，蕉株矮缩，甚至死亡；成株期感病生长衰弱，能抽蕾，但不能结成有经济价值的蕉果，为害极大。花叶症状为典型花叶斑驳状，叶片呈褪绿黄色条纹，尤以近顶部片叶最明显，叶脉微肿凸。心腐症状表现为假茎内侧初现黄褐色水渍状小点，后扩大并联合成黑褐色坏死条纹或坏死斑块，病株根、茎横剖面亦呈黑褐色坏死斑点或斑块（参见图A.1)。图A1香蕉花叶心腐病症状
A.7.2香蕉束顶病
主要症状表现为植株矮化，新生中叶片窄、短、直、硬，病叶质脆呈束状，在叶柄及茎秆上常见深色条纹，俗称“黑筋”。老化叶片叶缘退绿黄化，中脉周围浓绿（参见图A.2）。图A.2香蕉束顶病症状
A.8传播途径
A.8.1香蒸花叶心腐病
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黛园中自然传每媒介主要是蚜虫，病株和带病的种苗调运是远距离传播的途径。摩擦接种病株汁液也可近距离传播。
A.8.2香蕉束顶病
通过香燕交脉蚜（Pentalunianigramerrosa）以半持久性方式传播，带病毒的吸芽和种苗调运是远距高传播的途径，摩擦接种病株汁液不能传播。7
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B.1仪器设备
附录B
【规范性附录】
RT-IPCR和PCR检测所需仪器、试剂与方法PCR扩增仪、台式冷冻离心机、振荡仪、冰箱（2℃-8℃和一20C两种），超低温冰箱、恒温水浴锅、电子分析大平(感量为0.1 Tig)、II 、中泳系统、凝胶成像系统、量可调移液器（量程分别为0. : μl,~2 μl., 1 μ, 1 μl.,i0 μ[.-100 μl.,20 μl-- 200 μl100 r--1 000 μL)—套及配套吸头,离心管、刀片、PCR 管、研钵等;
B.2试剂
三羟中基氨基甲烷(Tris）.硼骏、氯化钠（NaCI)、I二烷基磺酸钠(SDS）二~胺叫乙酸钠（EI)TA)、酷酸钟（KAc）,醋酸钠（NaAc·3H:)、无水乙醇、曲拉通（Iri1onX-100）B-巯正乙婷、盐酸(HCI)冰酷酸(HAc）氢氧化钠(NaOH）、碳酸二乙酯(D)EPC）、二硫苏潴醇(DTT)等，B.3试剂的配制
B.3.1核酸抽提缓冲液
称取12.1Tri*，18.6gFT)T和29.2gNaC1放置」合适的容器中，加超纯水定容到1000ml.，灭菌冷却至案，再加人2Iml.3-筑基乙醇，室温保存备用。B.3.25 mol/L KAc溶液
称收=9.1KAc放置于合适的容器中，用去离于水定容100 mL，室温保存备用。B.3.310% SIS溶液
称取 10 g ST溶丁约 8 ml.去离子水中,68C加热溶解,用 HCI调节 pH 至7.2.去离子水定穿至100ml.室温保存备用。
B.3.43mol/L NaAt:溶液
称取0.8NaAc-3TI,溶1约10ml.去离子水币HA调节pH至5.2.去离子水定容到100ml，室温保存备H。
R. 3.5 0. 5 mol/L EDTA
称取T86.1EUTA济」800ml去离子水，用NaH调pH到8.0.去离了水定容至100CmL.室湖保存备用
B. 3. 61 rmol/ L Tris-HCl(pII 8. 0)称取121.1g1ri溶解于800ml.超纯水中,用HCl调pH至8.0.加超纯水定容至1000ml.灭菌店在4C卜保存备H。
B.3.710 mol/I.NaOH
在160ml.超纯水中加人80.0gNa0H.溶解后再加超纯水定容到200mlB.3.81mol/1. I1)TA-Naz (pH 8.0)称取372.2gHI)TA-Va2加人791m.超纯水中.加人适量NaOH溶液（B.3.7).加热至完全溶解后.冷却至率温.再用Na)H溶液（B.3.7)调pII至8.0.加超纯水定容至100ml，火菌后在4C下保存备用，
B. 3. 91. 2 mol/ L. NaCl
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称取70.2gNl.济解于800ml.超纯水中.加超纯水定容至1000ml灭菌后案温保存备川：B.3.10TE缓冲液(pH8.0)
分别量取10 ml.Tris-HCl(R 3.6)和1ml.ELTANa（B.3.8),加超纯水定容至10m，灭菌后在4℃:下保存备用。
B.3.11加样缓冲液
称取2500mg溴蓝.加10ml.超纯水，在案温下溶解12h;称取230.0mg二[基苯腈蓝：加1CmI.超纯水济解，称取50.0g熟，加30mL超纯水溶解，混合以上3种溶峻.加超纯水定容至10gmL:在1℃下保存备用。
B. 3. 1250 × TAE 电泳缓冲液(pH 8. D)称取242.2gTris，先用500mI超纯水加热搅拌溶解后.加人100ml.EF)1ANa:（B.3.8）,用HA调pH至8.0.然店加超纯水定容到1C00mI.使用时用超纯水稀释成1×TAEB.3.13PCR反应试剂
10XPCR缓冲液（Mg-Plus）、四种脱氙核糖核酸（clVTP.各2.mmol/1)、Ta案合酶（5U/l）、特异性引物对(20μmol/L)。
B.3. 14其他试剂
氯仿、异戊醇、异丙醇、70为艺醇、DVA分子量标准、核酸染料。B.3. 15说明
本标准所用试剂均为分析纯。除刃有说明，用于RNA提取和反成的试剂均用无RNA酶的水配制及叫无RVA酶的容器分装耗材（如离心管）均经过无RNA酶处理。同时以1所有试剂均须高温高压灭菌处现(121(.,1.1 kg/cm)20 minR.4方法
B.4.1总核酸提取
在灭菌的1.GmL离心管中加人被检样品、样品阳性对照、样品阴性对照，许按一定顺序缩号，每管加人0.1g检测样品，加液氮后用下净的研棒研磨·然后加抽提缓冲液1.5ml.充分泥匀（不能过小弧烈.以免产生乳化层，也叮以用手题倒混勾），按每750ul.拖提缓冲液人100l的比例加人10SLS65C水浴201mi130in,吸液时汁意更换吸头以避免交叉污染：加人500l.5mol/1.KAc.静置冰上20 Imin后，1500℃×g离心15min;取各管中的t清液400μl.转移至相应的2. 作ml.离心管中-期人0.1倍体积NaAc:3倍体积的无水醇颠倒混匀.一20℃放置至少2h以上4℃、1500×g离心15min(离心管开口保持朝离心机转轴方向放置）小心倒去上清，倒置于吸水纸上，吸下余液：加20%叫.70乙醇,颠倒洗涤；于1℃15000×g离心10mim.小心例去上清.倒置丁吸水纸上，尽量吸T余液;930×g离心10 s（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置）将1:消液全部倒掉，室温十燥3min:加人20μL无RNA悔超纯水轻轻滤句.济解管壁上的沉凝.10×吕离心5.泳「:保存备用提取的总核酸必须在2h内进行PCR检测，若需长期保存须效置70冰箱、采用RVA与DNA提取试剂盒的.操作步骤参照品说明书。健康香蕉组培脂基因纠TDVA按同样的方法制备与保存B.4.2凝胶制备
用1×TAET作液配制1.0外琼脂糖凝胶，在微波炉中溶化说句-冷却至60C左右：垢人核酸染料：混匀·倒人胶槽.捕L样品梳;待凝胶凝固后，拔出固定在凝胶中的样品梳：将带凝胶的胶板罩于电泳槽中-使样品孔位于电场负被·间电泳槽中期人1×TAE泳缓冲液（缓冲液越过凝胶表面即可）。B.4.3加样与电泳
NY/T 2251-2012
取1μl.加样缓冲液与5uL PCR反应产物.混勾，然后分别将其和DNA分子量标准加人到电泳槽的负极样品孔中；接通电源，电泳电压为5V/cI1：当加样缓冲液中的漠酚蓝迁移到凝胶1/2位置，切断电源，停止电泳。
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