NY/T 2252-2012
基本信息
标准号： NY/T 2252-2012
中文名称：槟榔黄化病病原物分子检测技术规范
标准类别：农业行业标准(NY)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准简介
NY/T 2252-2012 槟榔黄化病病原物分子检测技术规范
NY/T2252-2012
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标准内容
ICS65.020
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 2252—2012
槟榔黄化病病原物分子检测技术规范Molecular detection for pathogen of arecanut yellow leaf disease2012-12-07发布
2013-03-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准按照GB/T1.1给出的规则起草。木标准由农业部农垦局提出。
本标准由农业部热带作物及制品标准化委员会归口。本标准起草单位：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所。本标准主要起草人：罗大全、车海彦、温衍生、徐雪莲。NY/T 2252—2012
1范围
槟榔黄化病病原物分子检测技术规范本标准规定了槟榔黄化病病原物的检测方法。本标谁适用于槟榔植株中黄化病病原物的定性检测2术语和定义
下列术语和定义适用于本义件。2.1
植原体phytoplasma
NY/T2252—2012
苟生于植物韧皮部筛管和介体昆虫休内的，具有三层单位膜结构的无细胞壁的原核生物，一般引起植物叶片黄化和发育畸形等症状。2.2
槟榔黄化病arecanul yellow leaf disease由植原体引起的一种槟榔病害，该病害病原菌的分类地位，寄主范、危害症状及地理分布见D. 1~~D. 4。
聚合酶链式反应polymerase chain reaction,PCR模板基闪序列先经高温变性成为单链，在LNA聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别与模板LNA两条链上相成的一段互补序列发生退火而互相结合，接着在LDNA聚合酶的作用下以四种脱氧核糖核酸(dNTP)为底物，使引物得以延伸.然后不断重复变性、退火和延伸这一循环，使欲扩增的基因片段以几何倍数扩增。2.4
巢式聚合酶链式反应Dested PCR,巢式 PCR利用两套PCR引物对(巢式引物)进行两轮PCR扩增反应，首先用一·对外引物进行第一轮PCR扩增，然后再使用第--对引物扩增的DNA序列内部的一对内引物再次扩增，3原理
利用植原休通用引物R16mF2/R16mR1和R16F2m/R16R2,对待检样品进行巢式PCR扩增，依据扩增的片段序列的限制性片段长度多态性（restrictionfragmcntlcngthpolymorphism，RFLP）图谱是否与槟榔黄化植原体核糖体DNA<16SrDNA)序列的RFL.P图谱一致，判断样品中是否存在槟榔黄化植原体。
4巢式PCR检测所用仪器,试剂和方法见附录A
5巢式PCR检测
5.1田间取样
根据附录D.3和L,4的描述，初步确定槟榔植株是否为槟榔黄化病疑似病株，田间取疑似槟榔植1
NY/T 2252—2012
株及未表现症状的植株嫩叶约200g，放入自封袋中，送实验室检测。5.2槟榔植株叶片总DNA提取
取相应样品叶脉0.5-加入适量液氮研磨品粉状，再加人1mL.DVA提取缓冲液充分研磨，然后加人80μl10%十二烷基肌氨酸钠（Nl.S），混勺,55℃温育1h2h，4℃4300×g离心10min，取上消液：加人2/3上清液体积异丙醇，轻轻混勾.一20℃保持30min,1℃7700×g离心15min，弃上清：加入600LTE缓冲液、30μL10%十二烷基硫酸钠（SDS)和3L蛋白酶K(20mg/mL)，轻轻彻底悬浮沉淀，37C滤育30min～60min；加100μL5mol/LNaCl混，再加人84μL十六烷基三甲基化铵/氯化钠（CTAB/NaC1)溶液混勾.65℃温育10mi；加人等体积氯仿：异戊醇（24：1）混匀，4℃1300×g离心5min，再复直至无中问白色层，取上消液，加入等体积苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），混勾，4℃4300Xg离心5min；取上清液，加人2/3休积异内醇，混句，20℃保持30nin，1℃:17000×g离心10min.弃」清液：加人500ml.70%乙醇洗涤，4℃17000×g离心10min，洗涤两次；取沉淀，加入50ulTF缓冲液混勾溶解。灿人5μLRNA酶A（RNVaseA，10Ig/mL），37℃静置 30min，除去RNA，一20℃保行备用。
5.3引物序列
引物采用植原体16Sr1NA通用物R16mF2/R16mR1和R16F2n/R16R2，引物序列见表1表1巢式PCR检测的引物序列
引物名称
R161IF2
RIGrnRI
R16F2n
5.4PCR反应
引物序列5'-3″
CAIGCAAGTUGAACGGA
CTTAACCULAATCATCGAC
ACGACTGCTAAGACTGG
GOGGTGTGTACAAACCTG
待检样品检测反应均需同时以槟榔黄化植原休16SrDNA质粒（碱基序列参见附录D.8)作为阳性对照，未见症状的槟榔植株种子的胚组织提取的DNA作为阴性对照，无菌双蒸水作为空口对照，PCR反应体系见表2
表 2 ICR反应体系
10XPCR缓冲被
25 rnmol/L氯化镁
10 mmol/L dNTIP:
10μmol/1.J游引物
10kemol/1.下游引物
Tug LNA 聚合酶(5 U/μL)
模板DNA
补无菌双蒸水至
加样垒·μL
PCR反应条件为：94℃，预变性2min;94℃变性1min，45C退火45%~-60s，72℃延伸1min共迹行30-个循环.最后72℃伸10min。以R16mF2/Rl6mRl作为第，引物对，R16F2n/R16R2作为第二引物对，进行巢式PCR扩增，直接PCR以6.2中提取的总DNA为模板，巢式PCR以直接PCR产物稀释50倍后的样品为模板。PCR反应体系和反应条件与直接IC浪扩增相同。5.5PCR产物凝胶电泳检测
5.5.1凝胶制备
见A.3.1.
5.5.2加样与电泳
见A.3.2。
5.6RFLP图谱分析
NY/T 2252——2012
将第二轮PCR产物进行序列测定，利用植原体分类鉴定的在线工具iPhyClassificr(http：//plantpathology.ba.ars.usda.gov/cgi-bin/resource/iphyclassiliet,cgi)对测序结果进行RFIP图谱分析。5.7结果判定
巢式 PCR 检测结果判定见表 3。表3巢式PCR检测结果判定
判定条件
第，轮PCR产物在1.2kh处是否有条带出现(见图C.1)，检测样品序列的RFLP图谱分析结果与槟榔黄化病
空自对照
是/补
阴性对照
是/否
是/否
样品保存及销毅
阳性对照
是/否
是/否
抢测样品
是/香
植原体标准图谱(见图
G.2)是否一致
是/秀
是/否
结果判定
检测样品含槟榔黄化病植凉体
将检测样品参照附录 B,用透射
电子显微镜观察浩避行检测，若观察到植原你病原表示该样战含
槟榔黄化植原体；反之则不舍
检测样品不含黄化病植原体
检测结果无效,将实验中的所有
试剂更换，并重新捷取检测样品的DNA,进行巢式 PCR检测
经检测确定携带槟榔黄化植原休的阳性样品，应对样品置20℃以下保存30d以备复核，保存的样品做好标记和登记工作。
保存30d后的样品应进行灭活处理。3
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A.1仪器
附录A
（规范性附录）
巢式PCR检测所用仪器.试剂和方法台高速冷冻离心机，凝胶成像系统，CR仪，水平电泳装置等。A.2试剂
A 2. 11 mol/ L. Tris-HCI 缓冲液(pH 8. 0)称量121.1g三羟甲基氨基甲烷（Tris）置于11.烧杯中，加入约800ml.的超纯水，充分搅拌溶解：用盐酸（HCl)调节pF至8.0,将游液定容至1L，高温高压（121℃，1.1kg/cm）20min.室温保存。A 2. 2 0. 5 mol/L EDTA-Na2
称取186.1g乙一胺叫乙酸-钠 EDTA-Na2，置于1L烧杯中,加人药 800ml.的去离子水，充分搅拌.用氢氧化钠(Na()H)调节pH至8.0.加去离了水将济液定容至1L，高温高压灭菌（121℃，1.1kg/cm\)20tin，室温保存，
A.2.3DNA抽提缓冲液
分别量取10mL1mol/LTris-HCl(A.2.1)和20rnL0,5mol/LEMTA(A.2.2).置于100mL烧杯中.充分混句：再人1.161gNaC1,充分搅，用超纯水将溶液定容至100rnL，高温高压灭菌（121%，1.1kg/cm）20min，室温保存。使用前每毫升提取缓冲液中加人μL蛋白酶K溶液（20mg/ml.)。
A.2.4CIAB/NaCI溶液
称取4.1gNaC1置于10mL烧杯巾，加入约80ml.的超纯水，充分搅拌，然后缓慢加人10gC:1AB,同时加热并搅拌,用超纯水将溶液定容至100mL,高温高压灭菌(121℃,1.1kg/cm2)20 min,室温保存。
A.2.5TE缓冲液(pH8.0)
保存于室温或 4℃冰箱中，景取 1 ml. 1 mol/ L Tris -Cl(A. 2. 1)和 200 μl. a. 5 mol/ I FDTA（A.2.2)，依次加入100ml烧杯中，向烧杯中加入约80mL的去离水，均匀混合，将溶液定容至100mL后，高温高压灭菌（121℃1.1kz/cn\）20min，4℃或室温保存备用。A.2.6TAE电泳缓冲液[50×)[pH 8.0称取242.2gTris，先用500ml.超纯水加热悦胖溶解后，加入100mL0.5mo1/1.EDTA·Nag(A.2.2),用冰乙酸调 pII至8.0,然后加超纯水定容到1L率温保存，使用时用超纯水稀释成1×TAE.
A.2.7PCR反应试剂
10×PCR缓冲液TP（2.5mnol/L）、Taq聚合酶（5U/μL）、特性引物对（10mol/L）。A.2.8其他试剂
Tris饱和酚（pH≥7.8)、氯伤、异戊醇、异丙醇、70外乙醇、DNA分子量标准、梭酸染料等。A3方法
A3.1凝胶制备
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用1×TAE工作液配制1.0%琼脂糖凝胶，在微波炉中溶化混勺，冷却至60C左右：加入核酸染料，混勾，倒人胶槽，插上样品梳；待凝胶凝固后，拔出固定在凝胶中的样品梳，将带凝胶的胶板置于电泳槽中，使样品孔位于电场负极，向电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液（缓冲液越过凝胶表面即可）。A.3.2加样与电泳
取1μL加样缓冲液与5μI.PCR反应产物，混匀，然后分别将其和DNA分子量标准加入到电沫槽的负极样品孔中，接通电源，电泳电压为5V/cm，当加样缓冲液中的溴酚迁移到凝胶1/2位置，切断电源，停止电泳。
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附录B
（规范性附录）
透射电子显微镜观察诊断试剂配制及方法B.1透射电子显微镜观察诊断试剂配制B. 1. 12%酸储备液
将0.5g或1.0g装四氧化钱安瓶充分洗净，放入棕色试剂瓶中，在排毒柜内把安颜瓶敲破，即刻加人双蒸馏水，配制成2%水溶液，盖上盖子，溶解1d或更长时问。此液常作为储备液，于4°密谢保存。
B. 1. 20. 2 mol/ L磷酸盐缓冲液(PBS,pH 为 7. 4)0.2mol/L磷酸盐缓冲液的配制方法见表B.1。表B.10.2mol/L磷酸盐缓冲液配制方法Na HPO) - 2H,0
NaHI,PO · 2H,0)
双蒸水wwW.bzxz.Net
R. 1. 31%镀酸固定溶液
100 trul.
取2%钱酸水溶液12.5mL和0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH为7.4)12.5ml.别加入烧杯中.混勾，即为1%饿酸固定液，1保存备用。B.1.4环氧树脂
将环氧树脂（Epon812）5.0mL倒人烧杯中，置80℃温箱融化、然后加入顺丁烯二酸(DDSA)2.0，充分搅拌，待熔化景透明，至室温，再加人邻苯二甲酸二F酯(DBP)1.75ml.,仔细搅拌，然后慢慢逐滴加人一乙基苯胺(DMP30)0.4mI,边加边搅拌，至包埋剂呈红棕色。B. 1. 5聚乙烯醇缩甲醛( Formvar)膜将Formvar膜溶丁三氯中烷,配成0.2%～3%溶液,存于冰箱备用。制膜时取一块下净坡璃片插人溶液中，取出倾斜待三氯中烷挥发，用镊子沿玻璃边划痕，再将玻璃倾斜浸入蒸馏水中，游膜即从玻璃上脱落下来漂浮于水面，取十净的铜网摆上，压紧，再用一块滤纸覆盖其上，捞起后胃丁培养血干燥备用。
B.1.6乙酸双氧铀染色液
乙酸双氧铀2g加50%乙醇100ml,充分搅拌10min静置1l～2d,使未溶解部分白然沉淀,取上清液使用。溶液呈鲜黄色，若变淡谈表示失效，溶液宜用棕色瓶避光保存，8.1.7柠檬酸铅染色液
将硝酸铅1.33g,柠檬酸三钠1.76g和双蒸水依次加到50nL.窄量瓶中.用刀振荡30min,使溶液呈乳色，加入1mcl/1.NaOH8ml.，溶液变透明，再加双水定容50L.4C冰箱保存备用。B.2透射电子显微镜观察诊断
对采集的植物样品制备超薄切片，通过电镜观察植源体形态。B.2. 1 取材
选取待检槟榔植抹未展开的剑状合生嫩叶或未开放的花序，用刀片将嫩叶中脉或花序切成整齐的6
细条，切成1mm×1mm×3mm的长条。取健康槟榔嫩叶作对照B.2.2固定
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采用皮二醛钱酸双固定法。样品在2.5为戊醛进行前固定2h后，PRS(0.2mol/LpH7.4)清洗3次。然店用1%俄酸后固定2h,PBS清洗3次。B.2.3脱水
采用乙醇和丙酮系列梯度脱水。30%乙醇/15mit50%乙醇/15min→70%乙醇/15in80%乙醇/15min-+90%乙醇/15min100%乙醇/15min。样品可在70%乙醇中停留12h。B.2.4谦透
脱水后的组织块在内酮/树脂()：1)中渗透3d,再在全树脂中渗透1d。B.2.5包埋
用环氧树脂做包埋剂。将组织块放在胶囊中夹，滴人包剂。依次丁37℃下静置24h，45℃下静置24h，60℃下静置24h。
B.2.6 切片
在超薄切片机上将固化的纽织块作切片。选择好的切片，将切片用二甲苯蒸发展开，用载有Formvar膜的铜网捞起，置培养血内干燥、保存。B.2.7切片染色
采用乙酸双氙铀和柠檬酸铅双染色。取染色蜡盘数个，将乙酸双氮铀染液滴人蜡盘中。取带切片的铜网，插人染色滴中，染20min-～30min，然后取出铜网，蒸馏水洗去多余的染色液，滤纸吸十。将铜网再放入另.-蜡盘，滴入柠檬酸铅染液，使铜网翻抑在染色液滴上，染20min~30rnin.再用0.1mol/L氢氧化钠漂洗干净.滤纸吸干。
B.2.8透射电子显微镜观案
如果在透射电子显微镜下观察到的图像与C.3和I.5的描述是致的，说明有黄化病病原物，反之，则不带病原物。
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附录C
（规范性附录）
槟榔黄化病植原体巢式PCR电泳图，16SrDNA序列RFLP图谱和电镜观察图C.1槟榔黄化病植原体巢式PCR电图见图CSPUBLISHING
oisvanins
说明：
子是标准
嫩理中
槟神植株
全化精精原体
海电减体
槟御黄化病
NA康家
SRESEARCHCENTER
健康棕棉样品
空对服
槟榔黄化病植原体巢式PCR电泳图槟榔黄化植原体核糖体16S
DNA序列RFLP图谱见图C
图C.2槟榔黄化植原体核糖体16SrDNA序列RFLP图谱C.3槟榔黄化病植原体电镜观察图见图C.3。Lum
说明：
亚铃形植原体：
圆形植原体，
图C3槟榔黄化病植原体电镜观察图NY/T2252—2012
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D.1槟榔黄化病植原体
附录D
(资料性附录）
槟榔黄化病植原体背景资料
学名：Arecariutyellowleaf phytoplasma，AYLP分类地位：原核生物界（Prokaryiotos），细菌域（Bacteria），硬壁菌门（Firmicutes）；柔膜菌纲（Molli-cutes），无陷原体目（Acholcplasmalales），无胆附原体科（Achaleplasmatarcac)；植原体暂定属（Phytoplasma).
D.2寄主范围
槟榔。
13. 3危害症状
发病初期，植株下部例数第2张至第4张羽状叶片外缘1/4开始出现黄化，抽生的花穗较正常植株短小，无法正常展开，结果量大大减少，常常提前脱落。感病植株叶片黄化症状逐年加重，干早季节黄化症状更为究出，整株叫片无汰止常舒展生长，常伴有真菌引起的叶斑及梢枯；病叶叶鞘基部刚形成的小花苞水渍状败坏，严重时呈暗黑色，花苞基部有浅褐色夹心；感病后期病株根茎部坏死腐烂，感病植株带在项部叶片变黄一年后粘死，大部分感病株开始：表现黄化症状后5年至7年枯顶死亡。D.4地理分布
国外：印度（喀拉拉邦、奎隆等地)：国内：海南（屯昌、琼海、万宁、陵水、琼中，三亚、乐东、定安科保亭等市县）。D.5植原体形态特征
槟榔黄化病植原体形态为圆形、痫圆形等多种形态，菌体内有较丰富的纤维状体（即IJNA）细胞核区及较薄的质膜，没有细胞壁，其人小为180nm-~550nm，单位膜的厚度为9nm～13nm。D.6传播途径
染病种出的调运是该病害远距离传播的主要途径。田问可能通过昆虫介体传播，D.7槟榔黄化植原体16SrDNA序列槟榔黄化病植原体16SrDNA序列(GenBank登录号为FJ694685)见图D.1a10
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中华人民共和国农业行业标准
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槟榔黄化病病原物分子检测技术规范Molecular detection for pathogen of arecanut yellow leaf disease2012-12-07发布
2013-03-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准按照GB/T1.1给出的规则起草。木标准由农业部农垦局提出。
本标准由农业部热带作物及制品标准化委员会归口。本标准起草单位：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所。本标准主要起草人：罗大全、车海彦、温衍生、徐雪莲。NY/T 2252—2012
1范围
槟榔黄化病病原物分子检测技术规范本标准规定了槟榔黄化病病原物的检测方法。本标谁适用于槟榔植株中黄化病病原物的定性检测2术语和定义
下列术语和定义适用于本义件。2.1
植原体phytoplasma
NY/T2252—2012
苟生于植物韧皮部筛管和介体昆虫休内的，具有三层单位膜结构的无细胞壁的原核生物，一般引起植物叶片黄化和发育畸形等症状。2.2
槟榔黄化病arecanul yellow leaf disease由植原体引起的一种槟榔病害，该病害病原菌的分类地位，寄主范、危害症状及地理分布见D. 1~~D. 4。
聚合酶链式反应polymerase chain reaction,PCR模板基闪序列先经高温变性成为单链，在LNA聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别与模板LNA两条链上相成的一段互补序列发生退火而互相结合，接着在LDNA聚合酶的作用下以四种脱氧核糖核酸(dNTP)为底物，使引物得以延伸.然后不断重复变性、退火和延伸这一循环，使欲扩增的基因片段以几何倍数扩增。2.4
巢式聚合酶链式反应Dested PCR,巢式 PCR利用两套PCR引物对(巢式引物)进行两轮PCR扩增反应，首先用一·对外引物进行第一轮PCR扩增，然后再使用第--对引物扩增的DNA序列内部的一对内引物再次扩增，3原理
利用植原休通用引物R16mF2/R16mR1和R16F2m/R16R2,对待检样品进行巢式PCR扩增，依据扩增的片段序列的限制性片段长度多态性（restrictionfragmcntlcngthpolymorphism，RFLP）图谱是否与槟榔黄化植原体核糖体DNA<16SrDNA)序列的RFL.P图谱一致，判断样品中是否存在槟榔黄化植原体。
4巢式PCR检测所用仪器,试剂和方法见附录A
5巢式PCR检测
5.1田间取样
根据附录D.3和L,4的描述，初步确定槟榔植株是否为槟榔黄化病疑似病株，田间取疑似槟榔植1
NY/T 2252—2012
株及未表现症状的植株嫩叶约200g，放入自封袋中，送实验室检测。5.2槟榔植株叶片总DNA提取
取相应样品叶脉0.5-加入适量液氮研磨品粉状，再加人1mL.DVA提取缓冲液充分研磨，然后加人80μl10%十二烷基肌氨酸钠（Nl.S），混勺,55℃温育1h2h，4℃4300×g离心10min，取上消液：加人2/3上清液体积异丙醇，轻轻混勾.一20℃保持30min,1℃7700×g离心15min，弃上清：加入600LTE缓冲液、30μL10%十二烷基硫酸钠（SDS)和3L蛋白酶K(20mg/mL)，轻轻彻底悬浮沉淀，37C滤育30min～60min；加100μL5mol/LNaCl混，再加人84μL十六烷基三甲基化铵/氯化钠（CTAB/NaC1)溶液混勾.65℃温育10mi；加人等体积氯仿：异戊醇（24：1）混匀，4℃1300×g离心5min，再复直至无中问白色层，取上消液，加入等体积苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），混勾，4℃4300Xg离心5min；取上清液，加人2/3休积异内醇，混句，20℃保持30nin，1℃:17000×g离心10min.弃」清液：加人500ml.70%乙醇洗涤，4℃17000×g离心10min，洗涤两次；取沉淀，加入50ulTF缓冲液混勾溶解。灿人5μLRNA酶A（RNVaseA，10Ig/mL），37℃静置 30min，除去RNA，一20℃保行备用。
5.3引物序列
引物采用植原体16Sr1NA通用物R16mF2/R16mR1和R16F2n/R16R2，引物序列见表1表1巢式PCR检测的引物序列
引物名称
R161IF2
RIGrnRI
R16F2n
5.4PCR反应
引物序列5'-3″
CAIGCAAGTUGAACGGA
CTTAACCULAATCATCGAC
ACGACTGCTAAGACTGG
GOGGTGTGTACAAACCTG
待检样品检测反应均需同时以槟榔黄化植原休16SrDNA质粒（碱基序列参见附录D.8)作为阳性对照，未见症状的槟榔植株种子的胚组织提取的DNA作为阴性对照，无菌双蒸水作为空口对照，PCR反应体系见表2
表 2 ICR反应体系
10XPCR缓冲被
25 rnmol/L氯化镁
10 mmol/L dNTIP:
10μmol/1.J游引物
10kemol/1.下游引物
Tug LNA 聚合酶(5 U/μL)
模板DNA
补无菌双蒸水至
加样垒·μL
PCR反应条件为：94℃，预变性2min;94℃变性1min，45C退火45%~-60s，72℃延伸1min共迹行30-个循环.最后72℃伸10min。以R16mF2/Rl6mRl作为第，引物对，R16F2n/R16R2作为第二引物对，进行巢式PCR扩增，直接PCR以6.2中提取的总DNA为模板，巢式PCR以直接PCR产物稀释50倍后的样品为模板。PCR反应体系和反应条件与直接IC浪扩增相同。5.5PCR产物凝胶电泳检测
5.5.1凝胶制备
见A.3.1.
5.5.2加样与电泳
见A.3.2。
5.6RFLP图谱分析
NY/T 2252——2012
将第二轮PCR产物进行序列测定，利用植原体分类鉴定的在线工具iPhyClassificr(http：//plantpathology.ba.ars.usda.gov/cgi-bin/resource/iphyclassiliet,cgi)对测序结果进行RFIP图谱分析。5.7结果判定
巢式 PCR 检测结果判定见表 3。表3巢式PCR检测结果判定
判定条件
第，轮PCR产物在1.2kh处是否有条带出现(见图C.1)，检测样品序列的RFLP图谱分析结果与槟榔黄化病
空自对照
是/补
阴性对照
是/否
是/否
样品保存及销毅
阳性对照
是/否
是/否
抢测样品
是/香
植原体标准图谱(见图
G.2)是否一致
是/秀
是/否
结果判定
检测样品含槟榔黄化病植凉体
将检测样品参照附录 B,用透射
电子显微镜观察浩避行检测，若观察到植原你病原表示该样战含
槟榔黄化植原体；反之则不舍
检测样品不含黄化病植原体
检测结果无效,将实验中的所有
试剂更换，并重新捷取检测样品的DNA,进行巢式 PCR检测
经检测确定携带槟榔黄化植原休的阳性样品，应对样品置20℃以下保存30d以备复核，保存的样品做好标记和登记工作。
保存30d后的样品应进行灭活处理。3
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A.1仪器
附录A
（规范性附录）
巢式PCR检测所用仪器.试剂和方法台高速冷冻离心机，凝胶成像系统，CR仪，水平电泳装置等。A.2试剂
A 2. 11 mol/ L. Tris-HCI 缓冲液(pH 8. 0)称量121.1g三羟甲基氨基甲烷（Tris）置于11.烧杯中，加入约800ml.的超纯水，充分搅拌溶解：用盐酸（HCl)调节pF至8.0,将游液定容至1L，高温高压（121℃，1.1kg/cm）20min.室温保存。A 2. 2 0. 5 mol/L EDTA-Na2
称取186.1g乙一胺叫乙酸-钠 EDTA-Na2，置于1L烧杯中,加人药 800ml.的去离子水，充分搅拌.用氢氧化钠(Na()H)调节pH至8.0.加去离了水将济液定容至1L，高温高压灭菌（121℃，1.1kg/cm\)20tin，室温保存，
A.2.3DNA抽提缓冲液
分别量取10mL1mol/LTris-HCl(A.2.1)和20rnL0,5mol/LEMTA(A.2.2).置于100mL烧杯中.充分混句：再人1.161gNaC1,充分搅，用超纯水将溶液定容至100rnL，高温高压灭菌（121%，1.1kg/cm）20min，室温保存。使用前每毫升提取缓冲液中加人μL蛋白酶K溶液（20mg/ml.)。
A.2.4CIAB/NaCI溶液
称取4.1gNaC1置于10mL烧杯巾，加入约80ml.的超纯水，充分搅拌，然后缓慢加人10gC:1AB,同时加热并搅拌,用超纯水将溶液定容至100mL,高温高压灭菌(121℃,1.1kg/cm2)20 min,室温保存。
A.2.5TE缓冲液(pH8.0)
保存于室温或 4℃冰箱中，景取 1 ml. 1 mol/ L Tris -Cl(A. 2. 1)和 200 μl. a. 5 mol/ I FDTA（A.2.2)，依次加入100ml烧杯中，向烧杯中加入约80mL的去离水，均匀混合，将溶液定容至100mL后，高温高压灭菌（121℃1.1kz/cn\）20min，4℃或室温保存备用。A.2.6TAE电泳缓冲液[50×)[pH 8.0称取242.2gTris，先用500ml.超纯水加热悦胖溶解后，加入100mL0.5mo1/1.EDTA·Nag(A.2.2),用冰乙酸调 pII至8.0,然后加超纯水定容到1L率温保存，使用时用超纯水稀释成1×TAE.
A.2.7PCR反应试剂
10×PCR缓冲液TP（2.5mnol/L）、Taq聚合酶（5U/μL）、特性引物对（10mol/L）。A.2.8其他试剂
Tris饱和酚（pH≥7.8)、氯伤、异戊醇、异丙醇、70外乙醇、DNA分子量标准、梭酸染料等。A3方法
A3.1凝胶制备
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用1×TAE工作液配制1.0%琼脂糖凝胶，在微波炉中溶化混勺，冷却至60C左右：加入核酸染料，混勾，倒人胶槽，插上样品梳；待凝胶凝固后，拔出固定在凝胶中的样品梳，将带凝胶的胶板置于电泳槽中，使样品孔位于电场负极，向电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液（缓冲液越过凝胶表面即可）。A.3.2加样与电泳
取1μL加样缓冲液与5μI.PCR反应产物，混匀，然后分别将其和DNA分子量标准加入到电沫槽的负极样品孔中，接通电源，电泳电压为5V/cm，当加样缓冲液中的溴酚迁移到凝胶1/2位置，切断电源，停止电泳。
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附录B
（规范性附录）
透射电子显微镜观察诊断试剂配制及方法B.1透射电子显微镜观察诊断试剂配制B. 1. 12%酸储备液
将0.5g或1.0g装四氧化钱安瓶充分洗净，放入棕色试剂瓶中，在排毒柜内把安颜瓶敲破，即刻加人双蒸馏水，配制成2%水溶液，盖上盖子，溶解1d或更长时问。此液常作为储备液，于4°密谢保存。
B. 1. 20. 2 mol/ L磷酸盐缓冲液(PBS,pH 为 7. 4)0.2mol/L磷酸盐缓冲液的配制方法见表B.1。表B.10.2mol/L磷酸盐缓冲液配制方法Na HPO) - 2H,0
NaHI,PO · 2H,0)
双蒸水wwW.bzxz.Net
R. 1. 31%镀酸固定溶液
100 trul.
取2%钱酸水溶液12.5mL和0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH为7.4)12.5ml.别加入烧杯中.混勾，即为1%饿酸固定液，1保存备用。B.1.4环氧树脂
将环氧树脂（Epon812）5.0mL倒人烧杯中，置80℃温箱融化、然后加入顺丁烯二酸(DDSA)2.0，充分搅拌，待熔化景透明，至室温，再加人邻苯二甲酸二F酯(DBP)1.75ml.,仔细搅拌，然后慢慢逐滴加人一乙基苯胺(DMP30)0.4mI,边加边搅拌，至包埋剂呈红棕色。B. 1. 5聚乙烯醇缩甲醛( Formvar)膜将Formvar膜溶丁三氯中烷,配成0.2%～3%溶液,存于冰箱备用。制膜时取一块下净坡璃片插人溶液中，取出倾斜待三氯中烷挥发，用镊子沿玻璃边划痕，再将玻璃倾斜浸入蒸馏水中，游膜即从玻璃上脱落下来漂浮于水面，取十净的铜网摆上，压紧，再用一块滤纸覆盖其上，捞起后胃丁培养血干燥备用。
B.1.6乙酸双氧铀染色液
乙酸双氧铀2g加50%乙醇100ml,充分搅拌10min静置1l～2d,使未溶解部分白然沉淀,取上清液使用。溶液呈鲜黄色，若变淡谈表示失效，溶液宜用棕色瓶避光保存，8.1.7柠檬酸铅染色液
将硝酸铅1.33g,柠檬酸三钠1.76g和双蒸水依次加到50nL.窄量瓶中.用刀振荡30min,使溶液呈乳色，加入1mcl/1.NaOH8ml.，溶液变透明，再加双水定容50L.4C冰箱保存备用。B.2透射电子显微镜观察诊断
对采集的植物样品制备超薄切片，通过电镜观察植源体形态。B.2. 1 取材
选取待检槟榔植抹未展开的剑状合生嫩叶或未开放的花序，用刀片将嫩叶中脉或花序切成整齐的6
细条，切成1mm×1mm×3mm的长条。取健康槟榔嫩叶作对照B.2.2固定
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采用皮二醛钱酸双固定法。样品在2.5为戊醛进行前固定2h后，PRS(0.2mol/LpH7.4)清洗3次。然店用1%俄酸后固定2h,PBS清洗3次。B.2.3脱水
采用乙醇和丙酮系列梯度脱水。30%乙醇/15mit50%乙醇/15min→70%乙醇/15in80%乙醇/15min-+90%乙醇/15min100%乙醇/15min。样品可在70%乙醇中停留12h。B.2.4谦透
脱水后的组织块在内酮/树脂()：1)中渗透3d,再在全树脂中渗透1d。B.2.5包埋
用环氧树脂做包埋剂。将组织块放在胶囊中夹，滴人包剂。依次丁37℃下静置24h，45℃下静置24h，60℃下静置24h。
B.2.6 切片
在超薄切片机上将固化的纽织块作切片。选择好的切片，将切片用二甲苯蒸发展开，用载有Formvar膜的铜网捞起，置培养血内干燥、保存。B.2.7切片染色
采用乙酸双氙铀和柠檬酸铅双染色。取染色蜡盘数个，将乙酸双氮铀染液滴人蜡盘中。取带切片的铜网，插人染色滴中，染20min-～30min，然后取出铜网，蒸馏水洗去多余的染色液，滤纸吸十。将铜网再放入另.-蜡盘，滴入柠檬酸铅染液，使铜网翻抑在染色液滴上，染20min~30rnin.再用0.1mol/L氢氧化钠漂洗干净.滤纸吸干。
B.2.8透射电子显微镜观案
如果在透射电子显微镜下观察到的图像与C.3和I.5的描述是致的，说明有黄化病病原物，反之，则不带病原物。
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附录C
（规范性附录）
槟榔黄化病植原体巢式PCR电泳图，16SrDNA序列RFLP图谱和电镜观察图C.1槟榔黄化病植原体巢式PCR电图见图CSPUBLISHING
oisvanins
说明：
子是标准
嫩理中
槟神植株
全化精精原体
海电减体
槟御黄化病
NA康家
SRESEARCHCENTER
健康棕棉样品
空对服
槟榔黄化病植原体巢式PCR电泳图槟榔黄化植原体核糖体16S
DNA序列RFLP图谱见图C
图C.2槟榔黄化植原体核糖体16SrDNA序列RFLP图谱C.3槟榔黄化病植原体电镜观察图见图C.3。Lum
说明：
亚铃形植原体：
圆形植原体，
图C3槟榔黄化病植原体电镜观察图NY/T2252—2012
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D.1槟榔黄化病植原体
附录D
(资料性附录）
槟榔黄化病植原体背景资料
学名：Arecariutyellowleaf phytoplasma，AYLP分类地位：原核生物界（Prokaryiotos），细菌域（Bacteria），硬壁菌门（Firmicutes）；柔膜菌纲（Molli-cutes），无陷原体目（Acholcplasmalales），无胆附原体科（Achaleplasmatarcac)；植原体暂定属（Phytoplasma).
D.2寄主范围
槟榔。
13. 3危害症状
发病初期，植株下部例数第2张至第4张羽状叶片外缘1/4开始出现黄化，抽生的花穗较正常植株短小，无法正常展开，结果量大大减少，常常提前脱落。感病植株叶片黄化症状逐年加重，干早季节黄化症状更为究出，整株叫片无汰止常舒展生长，常伴有真菌引起的叶斑及梢枯；病叶叶鞘基部刚形成的小花苞水渍状败坏，严重时呈暗黑色，花苞基部有浅褐色夹心；感病后期病株根茎部坏死腐烂，感病植株带在项部叶片变黄一年后粘死，大部分感病株开始：表现黄化症状后5年至7年枯顶死亡。D.4地理分布
国外：印度（喀拉拉邦、奎隆等地)：国内：海南（屯昌、琼海、万宁、陵水、琼中，三亚、乐东、定安科保亭等市县）。D.5植原体形态特征
槟榔黄化病植原体形态为圆形、痫圆形等多种形态，菌体内有较丰富的纤维状体（即IJNA）细胞核区及较薄的质膜，没有细胞壁，其人小为180nm-~550nm，单位膜的厚度为9nm～13nm。D.6传播途径
染病种出的调运是该病害远距离传播的主要途径。田问可能通过昆虫介体传播，D.7槟榔黄化植原体16SrDNA序列槟榔黄化病植原体16SrDNA序列(GenBank登录号为FJ694685)见图D.1a10
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