NY/T 2258-2012
基本信息
标准号： NY/T 2258-2012
中文名称：香蕉黑条叶斑病原菌分子检测技术规范
标准类别：农业行业标准(NY)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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相关单位信息
标准简介
NY/T 2258-2012 香蕉黑条叶斑病原菌分子检测技术规范
NY/T2258-2012
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标准内容
1CS65.020
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 2258—2012
香蕉黑条叶斑病原菌分子检测技术规范Molecular detection for pathogen of banana black leaf streak disease2012-12-07发布
2013-03-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准按照GB/T7.1给山的规则起草。本标雅由农业部农垦局提出，
本标准由农业部热带作物及制品标推化委员会归口。本标准起草单位：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所。本标准主要起草人：谢艺贤、漆艳香、张欣、蒲金基、张贺、陆英、张辉强。NY/T2258—2012
1范围
香蕉黑条叶斑病原菌分子检测技术规范NY/T2258—2012
本标准规定了香蕉黑条叶斑病原菌（MycosphaerellafiiensisMorelet)分子检测方法。本标准适用于香蕉种苗及大田植株上的黑条叶斑病原菌的定性检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文凡是
件。凡是不注口期的引用文件，其最新版本（包括时的修改单）适用于本文件3基因分析检测实验率度术司
SN/T1193
3术语和定义
用于本
下列术语和定义适
香蕉黑条叶斑病
Oynana black lear Mreak disease由斐济球腔菌
该病害病原菌的分类地
核糖体基因内0综
haerellaensMoreelB
青主范围地理分布文
闻隔区
真核生物核摄
糖体基医内
聚合酶链式反应
模板基因序3
计的两条引物
酶的作用下以四种
GRESEARGN
种为害香
ribosomal DNA nternal transcribed spaeers,6DNA-ITS通带包话ITSE5.8
polymerasechainreactionPoR
宜的反
高温变性成为单链在聚合酶作用和适手超板DNA曲
一循环，使欲扩增的
4原理
上相应的段万不
序列发生退火而
为底物，引物得以延伸，然
新重复
检瘦性真菌病害。
，根据模板序列设
接着在DNA聚合
变性、退火和延伸这
根据香蕉黑条叶斑病原菌核糖体基国内转录间隔区DNA-ITS）特有减基序列设计特异性引物
进行PCR扩增。依据是否增获得预期中是否携带香蕉黑条叶斑病
bp的DNA片段，判断样
原菌。
仪器设备及试剂
见B.1和B.2。
6取样
按附录A描述的症状仔细检查香蕉叶片，发现香蕉黑条叶斑病疑似症状，即取叶片200g以上，装人牛皮纸袋中，送实验室检测，7显微观察
从疑似病样病斑上挑取或用透明胶粘取灰色霉状物制成临时玻片进行镜检，观察有无类似斐济球NY/T2258—2012
腔菌的分牛孢子存在。
8PCR检测
8.1PCK反应模板制备
8. 2 PCR 反应
在 PCR 薄壁管中分别加人以下试剂(2 μl.体系)后进行 PCR 反应:1μL 基因组 IDNA,10×PCR缓冲液(Mg2Plus)2.5μI,脱氧核糖核H酸(dNTP)混合物 2L:特异性引物(见表1)各0.5μL,Taq酶 C.2 μ,无菌超纯水 18.3μL。表 1PCR反应的引物及扩增产物
引物名称
引物序列
G'-GGC GCC CCC GGA GGC CGI CTA 35'- GGT CCGTGT TTC AAG ACG G- 3微期扩增产物
1009bp
反应条件：94℃预变性3mim;后30个循环为94℃变性45s至60s;62℃退火45s至60s;72伸1 min;最后72℃延伸5min取出PCR反应管,对反应产物进行电泳检测或4℃条件下保存,存放时间不超过24h
8.3反应体系中对照的设置
8.3.1阳性对照
用香燕黑条叶斑病原菌基因组DNA作为模板。8.3.2样品对照
用健球香蕉组培苗提取的基因组DNA作为模板。8.3.3PCR反应体系对照
用配制反应体系的无菌超纯水代替DNA模板，检测试剂是否变到污染。8.4PCR产物凝胶电泳检测
8.4.1凝胶制备
见 B. 4. 2。
8.4.2加样与电泳
8.5凝胶成像分析
将整块琼脂糖凝胶置于紫外凝胶成像仪系统观察窗内，根据DNA分了量标准估计扩增条带的人小，并拍照保存参见图1。
8.6防污染措施
检测过程中防污染措施按照SV/T1193中的规定执行。9结果判定
9. 1 PCR 反应体系正常与否判定如果样品对照或PCR反应体系对照出现目的条节，或阳性对照未出现自的扩增条带，表明PCR反应体系工作不正常,样品检测结果不能作为结果判定的依据，需重新准备PCR试剂和阳性对照.并重新进行样品的PCR检测,具体操作按照8.2～8.6的规定执行，如果阳性对照出现目的扩增条带,而样品对照和PCR反应体系对照均不山现该条带，丧明 PCR反应体系正常，样品PCR检测结果可以作为结果判定的依据。2
1 ckbp
说期：
M：DNA分了标准;
1一性刘照：
3 -~1 6~8-—-阳性样品;
2折5朗性样品；
9-一-样品对照；
10——PCR反应体系对照.
图1特异性引物PCR检测结果电泳图9.2待检样品阳性或阴性结果判定NY/T2258—2012
作PCR反应体系正常的条件下，如果待检样品未出现与阳性对照相同大小的的打增条带，则需要重新提取待检样品基因组DNA，进行PCR检测：具体操作按照8.1～8.5的规定执行，如果待检样品仍未出现与阳性对照柯同大小的的扩增条带，则判定该样品阴性，即待检样品未携带香蕉黑条叶斑病原菌。
在PCR反应体系正常的条件下，如果待检样品出现与阳性对照相同大小的且的扩增条带，则初步判断该样品为阳性。对初步判断为阳性的原始样品用PDA培养基逆行病原菌的分离培养和镜俭，对分离纯化的疑似分离菌株进行ICR检测,具体操作按照8.1~8.6的规定执行，如果出现与陷性对照相同尺小的片的扩增条带，则最终判定该样品为阳性，即符检样品携带香蕉黑条叶斑病原菌。否则，最终判定该样品为阴性、待检样品不携带香蕉黑条叶斑病原菌。10样品保存及销毂
经捡测确定携带香蕉黑条叶斑病原菌的阳性样品经液氮干燥后，于一70℃以下保存 30d以备复核，同时将分离菌株保存于PDA培养基，于4℃保存30d，保存的样品必须做好登记和标记工作。保存期过后的样品及用具应进行火活处理。3
NY/T2258—2012
A.1 有性态
附录A
（资料性附录】
香蕉黑条叶斑病原菌的背景资料学名：MycusphueretlafijiensisMorelet，异名：Mycsphuerellafijiensisvar.difformisJ. L. Muler &. R. H. Stover。A.2无性态
学名: Fudocercosporu fijitnsis(Morelet)Deithton,异名: Cercospuru fijiersts Morelet, Paracercuspurufijiensis(Morelet)Deithion。A.3中文名
斐济球腔菌。
A.4分类地位
子婆菌门（Asromyeoti）、座蜜菌纲（Dothideomycetes）、煤菌目（Capriodiales），球腔菌科（Myeo-sphacrcaceae）球腔菌属（Mycnsphaerella）A.5形态特征
该病原菌无子座.分生孢予梗3根一5根,簇生，无色，短.直立或弯曲,产抱细胞合轴生，顶端孢痕小,直径1,m～1. 5 um。分生孢子倒棒形,尤色,3个-~6 个隔膜，少数 6个～8个,顶端稍尖,基部腑点凹人,孢了大小(30~132）μm×（2.5～5）um。了囊果(座)深褐包,球形,具乳突状孔。子衰倒棒状，无侧丝：大小(28.0--34.5）um×（6.5～8.0）μm,内含子凝孢子8个双列。于囊孢子浅色，梭形或棍棒状，双胞，隔膜处缩，人小（14～20）umx（46）μm。A.6寄主范團
白然寄主为香蕉（Musa spp.）。A.7地理分布
亚洲的马来西亚、新加坡.菲律宾、印度尼西亚、印度和中国。非洲的科特迪、喀麦隆、加瑾、刚果、赞比亚、坦桑尼亚和布隆迪。大洋洲的新喀多尼亚、塔希提岛，巴布亚新几内亚、所罗门群岛、斐济、萨摩亚、汤加、澳人利亚。美洲的洪都拉斯、卡亚那、瓜德罗曾岛、西印度群岛中的向风群岛及美国（夏威夷）。A.8危害症状
初期在叶脉间li现长约1mm~2mm褪绿小斑，后扩展成大小约（10~15）m×（2~5）mm条斑或梭斑，病斑中央呈灰白色，边缘暗色，两侧被叶脉限制，外围具黄色晕阁。随者病情扩展，病斑扩大吴纺锤形或椭圆形、形成具有特征性的黑色条纹。田间湿度大时.病斑背面生灰色霉状物，病斑边缘组1
NY/T2258—2012
织呈水渍状，中央很快坏死，病部变干枯，呈浅灰色，病健处具明显的深褐色或黑色界线。多个病斑可汇合连成一片，叶片变黑褐色并迅速枯死，下垂倒挂在假茎上（见图A，1)。说明：
病害初期：
病害中期；
病害后期：
病害晚期。
图A.1香蕉叶片症状bzxz.net
A.9传播途径
病原菌主要通过繁殖材料（吸芽苗或球茎）、香蕉叶片、苞片等包装、填充材料以及香蕉果实作远距离传播。分生孢子及子囊孢子主要借助风雨传播。NY/T 2258—2012
B.1仪器
附录B
【规范性附录]
PCR捡测所需仪器、试剂、培养基与方法高速冷冻离心机（最大离心力25000×g）、PCR扩增仪，电泳仪、紫外凝胶成像仪等。B.2试剂
B. 2. 11 mol/ L Tris - HCI( pH 8. 0)称取121.1g=羟甲基氨基甲烷（Tris)溶解丁800mI.超纯水中，用盐酸(HCl)调pH至8.0,加超纯水定容全1000ml分装后高湿灭菌（121℃）20min，4℃或室温保存备用。B. 2. 2 10 mol/L NaO11
称取80.0g怎氧化钠（NaOH)溶解于160mL超纯水中，溶解店再加超纯水定容到200mlB. 2. 31 ol/ L EDTA - Na2 ( pH 8. 0)称取372.2g乙二铵四乙酸二钠（EDTANa），溶解丁70mL超纯水中.再加人适量NaOH溶液(B.2.2)，加热至完全溶解后，冷却至室温·再川Na()H溶液（B.2.2)调pH至8.0.加超纯水定容至100mL，分装后高温灭菌（121℃）20min，4℃或案温保存备用，B.2. 4CTAB提取液(pH 8. 0)
称取81.9g氯化钠（XaCI)溶解于800ml超纯水中，缀慢加人20g1六烷基-印基溴化铵（CTAB)，加热并搅拌，充分溶解后加人I00l.Tris-HICI(B2.1),4mIEIYIANa,（B.2.3），加超纯水定容至1000m分装后高温灭菌（121℃)20min，室温保存，研磨植物材料之前加3-硫基乙醇至2%。
B.2.5CTAB沉淀液
称取2.34gNaCI济解十800mL超纯水巾，缓慢加人50gCTAB，加热并搅拌，充分解后加超纯水定容至1000mL，分装后高温灭菌（121℃）20min，率温保存备用。B. 2. 61. 2 mol/L NaCI
称取70.2gNaCl溶解于800mL超纯水中，加超纯水定容至1000mL，分装后高温灭菌（121℃:)20min4%或室温保存备用。
B.2.7TE缓冲液(pH8.0)
分别量取10mI.Tri-HC（B.2.1)和1mLEDTANa(B.2.3),加超纯水定容至1000mL，分装后高温灭菌（121c)20mim,4℃或空温保存备用。B.2.8加样缓冲液
称取250.0ng澳酚监，加10ml.超纯水，在率温下溶解12h；称取250.0mg二中基苯睛蓝溶解丁10ml.超纯水中：称取50.0名热糖溶解于30mI.超纯水中。混合以1:3种液：加超纯水定容至100mL，4℃保存备川，
B.2.950×TAE电泳缓冲液(pH 8.0)称取242.2gTris.先用500ml超纯水加热搅拌溶解后，加人100mLEDTA-Vaz（B.2.3)，川冰乙酸调pH至8.0，然后加趋纯水定容到I000mL。室温保存备用.使用时用超纯水稀释成1×1AE。5
B. 2. 10 PCR 反应试剂
NY/T 2258—2012
10XPCR缓冲液（Mg一Plus)，dNTP(2.5mmol/L）、Taq聚合酶（5U/μl）、特异性物对（20μmol/L)。
B.2.11其他试剂
Tris饱和酚(pH7.8)，氯伤、异戊醇,异芮醇,70乙醇,DNA分了量标准、核酸染料。B.3PDA 培养基
取200g马铃箸，洗净去皮切碎，加超纯水9C0ml.煮沸0.5h纱布过滤，再圳20g葡带糖充分溶解后.加超纯水定容至1000mL，分装后，每100mL培养基中加入2.2g琼胶，高温灭菌（121%)20min，4℃或室温保存备用。
B.4方法
B.4.1PCR反应模板制备
植物材料准备：剪取待检材料病健交界处叶片组织1多，置于研钵中加液氮冷冻后充分研磨成粉。菌株菌丝样品准备：将阳性对照菌株及得检分离菌株接种到1DA培养基上,28℃培养10 d.用载吸片利取培养基表面的菌丝置于10ml.灭菌离心管中，-20℃保存备用。称取200mg菌丝样品.置于碰钵中加液氮冷冻后充分研磨成粉。基闪组DNA提取：称取100mgF粉置于1.5mlL离心管中，加入250lCTAB抽提液充分混勾后，于65℃水浴30min。离心（14000×g，10 min)取上清，加人等休积Tris饱和酚（pH7.8）：氯仿：异戊醇（25：24：1).充分混勾,离心（14000×g.10min），取上清加人2倍体积CIAB沉液，室湿温育60min：离心（14000×g：10min），弃上清，用350LNaCl(1.2mol/L)溶解泥淀，加,入等体积氯伤：异戊醇（24＊1),混勺：离心（14000×g，10min），取上清于另一新离心管-加人0.6体积异内醇沉淀核酸；离心（11000×g，10min）充上清，用75岁乙醇悬浮淀离心（14000×g，10min）,充上清重复该步骤一遍,干后将DNA溶解于150ml.TE缓冲液或 150 μL超纯水中，置于-一20℃保存备用采用LNA提取试剂盒的，操作步骤参照产品说明书。健康香蕉组培节基因组[VA按同样的方泌制备与保荐。B.4.2凝胶制备
用1×TAET作液配制1.0必琼脂糖凝胶，在微被灿中溶化混句.冷却全60℃左石;加人核酸染料，混勺，倒人胶槽，痛上样品梳；待凝胶凝固后.拔出固定在凝胶巾的样品梳.将带凝胶的胶板置于电泳槽中，使样品孔位于电场负极-向电泳槽中加入1XTAE电泳缓冲液（缓冲液越过凝胶表而即可）。B.4.3加样与电泳
取1μL.加样缓冲液与5uI.PCR反成产物.混匀，然后分别将其和DNA分了量标准加人到电泳槽的负极样品孔中：接通电源，电泳电压为5V/crm.当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移到凝胶1/2位置·切断电源，停止电泳
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中华人民共和国农业行业标准
NY/T 2258—2012
香蕉黑条叶斑病原菌分子检测技术规范Molecular detection for pathogen of banana black leaf streak disease2012-12-07发布
2013-03-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准按照GB/T7.1给山的规则起草。本标雅由农业部农垦局提出，
本标准由农业部热带作物及制品标推化委员会归口。本标准起草单位：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所。本标准主要起草人：谢艺贤、漆艳香、张欣、蒲金基、张贺、陆英、张辉强。NY/T2258—2012
1范围
香蕉黑条叶斑病原菌分子检测技术规范NY/T2258—2012
本标准规定了香蕉黑条叶斑病原菌（MycosphaerellafiiensisMorelet)分子检测方法。本标准适用于香蕉种苗及大田植株上的黑条叶斑病原菌的定性检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文凡是
件。凡是不注口期的引用文件，其最新版本（包括时的修改单）适用于本文件3基因分析检测实验率度术司
SN/T1193
3术语和定义
用于本
下列术语和定义适
香蕉黑条叶斑病
Oynana black lear Mreak disease由斐济球腔菌
该病害病原菌的分类地
核糖体基因内0综
haerellaensMoreelB
青主范围地理分布文
闻隔区
真核生物核摄
糖体基医内
聚合酶链式反应
模板基因序3
计的两条引物
酶的作用下以四种
GRESEARGN
种为害香
ribosomal DNA nternal transcribed spaeers,6DNA-ITS通带包话ITSE5.8
polymerasechainreactionPoR
宜的反
高温变性成为单链在聚合酶作用和适手超板DNA曲
一循环，使欲扩增的
4原理
上相应的段万不
序列发生退火而
为底物，引物得以延伸，然
新重复
检瘦性真菌病害。
，根据模板序列设
接着在DNA聚合
变性、退火和延伸这
根据香蕉黑条叶斑病原菌核糖体基国内转录间隔区DNA-ITS）特有减基序列设计特异性引物
进行PCR扩增。依据是否增获得预期中是否携带香蕉黑条叶斑病
bp的DNA片段，判断样
原菌。
仪器设备及试剂
见B.1和B.2。
6取样
按附录A描述的症状仔细检查香蕉叶片，发现香蕉黑条叶斑病疑似症状，即取叶片200g以上，装人牛皮纸袋中，送实验室检测，7显微观察
从疑似病样病斑上挑取或用透明胶粘取灰色霉状物制成临时玻片进行镜检，观察有无类似斐济球NY/T2258—2012
腔菌的分牛孢子存在。
8PCR检测
8.1PCK反应模板制备
8. 2 PCR 反应
在 PCR 薄壁管中分别加人以下试剂(2 μl.体系)后进行 PCR 反应:1μL 基因组 IDNA,10×PCR缓冲液(Mg2Plus)2.5μI,脱氧核糖核H酸(dNTP)混合物 2L:特异性引物(见表1)各0.5μL,Taq酶 C.2 μ,无菌超纯水 18.3μL。表 1PCR反应的引物及扩增产物
引物名称
引物序列
G'-GGC GCC CCC GGA GGC CGI CTA 35'- GGT CCGTGT TTC AAG ACG G- 3微期扩增产物
1009bp
反应条件：94℃预变性3mim;后30个循环为94℃变性45s至60s;62℃退火45s至60s;72伸1 min;最后72℃延伸5min取出PCR反应管,对反应产物进行电泳检测或4℃条件下保存,存放时间不超过24h
8.3反应体系中对照的设置
8.3.1阳性对照
用香燕黑条叶斑病原菌基因组DNA作为模板。8.3.2样品对照
用健球香蕉组培苗提取的基因组DNA作为模板。8.3.3PCR反应体系对照
用配制反应体系的无菌超纯水代替DNA模板，检测试剂是否变到污染。8.4PCR产物凝胶电泳检测
8.4.1凝胶制备
见 B. 4. 2。
8.4.2加样与电泳
8.5凝胶成像分析
将整块琼脂糖凝胶置于紫外凝胶成像仪系统观察窗内，根据DNA分了量标准估计扩增条带的人小，并拍照保存参见图1。
8.6防污染措施
检测过程中防污染措施按照SV/T1193中的规定执行。9结果判定
9. 1 PCR 反应体系正常与否判定如果样品对照或PCR反应体系对照出现目的条节，或阳性对照未出现自的扩增条带，表明PCR反应体系工作不正常,样品检测结果不能作为结果判定的依据，需重新准备PCR试剂和阳性对照.并重新进行样品的PCR检测,具体操作按照8.2～8.6的规定执行，如果阳性对照出现目的扩增条带,而样品对照和PCR反应体系对照均不山现该条带，丧明 PCR反应体系正常，样品PCR检测结果可以作为结果判定的依据。2
1 ckbp
说期：
M：DNA分了标准;
1一性刘照：
3 -~1 6~8-—-阳性样品;
2折5朗性样品；
9-一-样品对照；
10——PCR反应体系对照.
图1特异性引物PCR检测结果电泳图9.2待检样品阳性或阴性结果判定NY/T2258—2012
作PCR反应体系正常的条件下，如果待检样品未出现与阳性对照相同大小的的打增条带，则需要重新提取待检样品基因组DNA，进行PCR检测：具体操作按照8.1～8.5的规定执行，如果待检样品仍未出现与阳性对照柯同大小的的扩增条带，则判定该样品阴性，即待检样品未携带香蕉黑条叶斑病原菌。
在PCR反应体系正常的条件下，如果待检样品出现与阳性对照相同大小的且的扩增条带，则初步判断该样品为阳性。对初步判断为阳性的原始样品用PDA培养基逆行病原菌的分离培养和镜俭，对分离纯化的疑似分离菌株进行ICR检测,具体操作按照8.1~8.6的规定执行，如果出现与陷性对照相同尺小的片的扩增条带，则最终判定该样品为阳性，即符检样品携带香蕉黑条叶斑病原菌。否则，最终判定该样品为阴性、待检样品不携带香蕉黑条叶斑病原菌。10样品保存及销毂
经捡测确定携带香蕉黑条叶斑病原菌的阳性样品经液氮干燥后，于一70℃以下保存 30d以备复核，同时将分离菌株保存于PDA培养基，于4℃保存30d，保存的样品必须做好登记和标记工作。保存期过后的样品及用具应进行火活处理。3
NY/T2258—2012
A.1 有性态
附录A
（资料性附录】
香蕉黑条叶斑病原菌的背景资料学名：MycusphueretlafijiensisMorelet，异名：Mycsphuerellafijiensisvar.difformisJ. L. Muler &. R. H. Stover。A.2无性态
学名: Fudocercosporu fijitnsis(Morelet)Deithton,异名: Cercospuru fijiersts Morelet, Paracercuspurufijiensis(Morelet)Deithion。A.3中文名
斐济球腔菌。
A.4分类地位
子婆菌门（Asromyeoti）、座蜜菌纲（Dothideomycetes）、煤菌目（Capriodiales），球腔菌科（Myeo-sphacrcaceae）球腔菌属（Mycnsphaerella）A.5形态特征
该病原菌无子座.分生孢予梗3根一5根,簇生，无色，短.直立或弯曲,产抱细胞合轴生，顶端孢痕小,直径1,m～1. 5 um。分生孢子倒棒形,尤色,3个-~6 个隔膜，少数 6个～8个,顶端稍尖,基部腑点凹人,孢了大小(30~132）μm×（2.5～5）um。了囊果(座)深褐包,球形,具乳突状孔。子衰倒棒状，无侧丝：大小(28.0--34.5）um×（6.5～8.0）μm,内含子凝孢子8个双列。于囊孢子浅色，梭形或棍棒状，双胞，隔膜处缩，人小（14～20）umx（46）μm。A.6寄主范團
白然寄主为香蕉（Musa spp.）。A.7地理分布
亚洲的马来西亚、新加坡.菲律宾、印度尼西亚、印度和中国。非洲的科特迪、喀麦隆、加瑾、刚果、赞比亚、坦桑尼亚和布隆迪。大洋洲的新喀多尼亚、塔希提岛，巴布亚新几内亚、所罗门群岛、斐济、萨摩亚、汤加、澳人利亚。美洲的洪都拉斯、卡亚那、瓜德罗曾岛、西印度群岛中的向风群岛及美国（夏威夷）。A.8危害症状
初期在叶脉间li现长约1mm~2mm褪绿小斑，后扩展成大小约（10~15）m×（2~5）mm条斑或梭斑，病斑中央呈灰白色，边缘暗色，两侧被叶脉限制，外围具黄色晕阁。随者病情扩展，病斑扩大吴纺锤形或椭圆形、形成具有特征性的黑色条纹。田间湿度大时.病斑背面生灰色霉状物，病斑边缘组1
NY/T2258—2012
织呈水渍状，中央很快坏死，病部变干枯，呈浅灰色，病健处具明显的深褐色或黑色界线。多个病斑可汇合连成一片，叶片变黑褐色并迅速枯死，下垂倒挂在假茎上（见图A，1)。说明：
病害初期：
病害中期；
病害后期：
病害晚期。
图A.1香蕉叶片症状bzxz.net
A.9传播途径
病原菌主要通过繁殖材料（吸芽苗或球茎）、香蕉叶片、苞片等包装、填充材料以及香蕉果实作远距离传播。分生孢子及子囊孢子主要借助风雨传播。NY/T 2258—2012
B.1仪器
附录B
【规范性附录]
PCR捡测所需仪器、试剂、培养基与方法高速冷冻离心机（最大离心力25000×g）、PCR扩增仪，电泳仪、紫外凝胶成像仪等。B.2试剂
B. 2. 11 mol/ L Tris - HCI( pH 8. 0)称取121.1g=羟甲基氨基甲烷（Tris)溶解丁800mI.超纯水中，用盐酸(HCl)调pH至8.0,加超纯水定容全1000ml分装后高湿灭菌（121℃）20min，4℃或室温保存备用。B. 2. 2 10 mol/L NaO11
称取80.0g怎氧化钠（NaOH)溶解于160mL超纯水中，溶解店再加超纯水定容到200mlB. 2. 31 ol/ L EDTA - Na2 ( pH 8. 0)称取372.2g乙二铵四乙酸二钠（EDTANa），溶解丁70mL超纯水中.再加人适量NaOH溶液(B.2.2)，加热至完全溶解后，冷却至室温·再川Na()H溶液（B.2.2)调pH至8.0.加超纯水定容至100mL，分装后高温灭菌（121℃）20min，4℃或案温保存备用，B.2. 4CTAB提取液(pH 8. 0)
称取81.9g氯化钠（XaCI)溶解于800ml超纯水中，缀慢加人20g1六烷基-印基溴化铵（CTAB)，加热并搅拌，充分溶解后加人I00l.Tris-HICI(B2.1),4mIEIYIANa,（B.2.3），加超纯水定容至1000m分装后高温灭菌（121℃)20min，室温保存，研磨植物材料之前加3-硫基乙醇至2%。
B.2.5CTAB沉淀液
称取2.34gNaCI济解十800mL超纯水巾，缓慢加人50gCTAB，加热并搅拌，充分解后加超纯水定容至1000mL，分装后高温灭菌（121℃）20min，率温保存备用。B. 2. 61. 2 mol/L NaCI
称取70.2gNaCl溶解于800mL超纯水中，加超纯水定容至1000mL，分装后高温灭菌（121℃:)20min4%或室温保存备用。
B.2.7TE缓冲液(pH8.0)
分别量取10mI.Tri-HC（B.2.1)和1mLEDTANa(B.2.3),加超纯水定容至1000mL，分装后高温灭菌（121c)20mim,4℃或空温保存备用。B.2.8加样缓冲液
称取250.0ng澳酚监，加10ml.超纯水，在率温下溶解12h；称取250.0mg二中基苯睛蓝溶解丁10ml.超纯水中：称取50.0名热糖溶解于30mI.超纯水中。混合以1:3种液：加超纯水定容至100mL，4℃保存备川，
B.2.950×TAE电泳缓冲液(pH 8.0)称取242.2gTris.先用500ml超纯水加热搅拌溶解后，加人100mLEDTA-Vaz（B.2.3)，川冰乙酸调pH至8.0，然后加趋纯水定容到I000mL。室温保存备用.使用时用超纯水稀释成1×1AE。5
B. 2. 10 PCR 反应试剂
NY/T 2258—2012
10XPCR缓冲液（Mg一Plus)，dNTP(2.5mmol/L）、Taq聚合酶（5U/μl）、特异性物对（20μmol/L)。
B.2.11其他试剂
Tris饱和酚(pH7.8)，氯伤、异戊醇,异芮醇,70乙醇,DNA分了量标准、核酸染料。B.3PDA 培养基
取200g马铃箸，洗净去皮切碎，加超纯水9C0ml.煮沸0.5h纱布过滤，再圳20g葡带糖充分溶解后.加超纯水定容至1000mL，分装后，每100mL培养基中加入2.2g琼胶，高温灭菌（121%)20min，4℃或室温保存备用。
B.4方法
B.4.1PCR反应模板制备
植物材料准备：剪取待检材料病健交界处叶片组织1多，置于研钵中加液氮冷冻后充分研磨成粉。菌株菌丝样品准备：将阳性对照菌株及得检分离菌株接种到1DA培养基上,28℃培养10 d.用载吸片利取培养基表面的菌丝置于10ml.灭菌离心管中，-20℃保存备用。称取200mg菌丝样品.置于碰钵中加液氮冷冻后充分研磨成粉。基闪组DNA提取：称取100mgF粉置于1.5mlL离心管中，加入250lCTAB抽提液充分混勾后，于65℃水浴30min。离心（14000×g，10 min)取上清，加人等休积Tris饱和酚（pH7.8）：氯仿：异戊醇（25：24：1).充分混勾,离心（14000×g.10min），取上清加人2倍体积CIAB沉液，室湿温育60min：离心（14000×g：10min），弃上清，用350LNaCl(1.2mol/L)溶解泥淀，加,入等体积氯伤：异戊醇（24＊1),混勺：离心（14000×g，10min），取上清于另一新离心管-加人0.6体积异内醇沉淀核酸；离心（11000×g，10min）充上清，用75岁乙醇悬浮淀离心（14000×g，10min）,充上清重复该步骤一遍,干后将DNA溶解于150ml.TE缓冲液或 150 μL超纯水中，置于-一20℃保存备用采用LNA提取试剂盒的，操作步骤参照产品说明书。健康香蕉组培节基因组[VA按同样的方泌制备与保荐。B.4.2凝胶制备
用1×TAET作液配制1.0必琼脂糖凝胶，在微被灿中溶化混句.冷却全60℃左石;加人核酸染料，混勺，倒人胶槽，痛上样品梳；待凝胶凝固后.拔出固定在凝胶巾的样品梳.将带凝胶的胶板置于电泳槽中，使样品孔位于电场负极-向电泳槽中加入1XTAE电泳缓冲液（缓冲液越过凝胶表而即可）。B.4.3加样与电泳
取1μL.加样缓冲液与5uI.PCR反成产物.混匀，然后分别将其和DNA分了量标准加人到电泳槽的负极样品孔中：接通电源，电泳电压为5V/crm.当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移到凝胶1/2位置·切断电源，停止电泳
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