NY/T 2286-2012
基本信息
标准号： NY/T 2286-2012
中文名称：番茄溃疡病菌检疫检测与鉴定方法
标准类别：农业行业标准(NY)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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标准简介
NY/T 2286-2012 番茄溃疡病菌检疫检测与鉴定方法
NY/T2286-2012
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标准内容
ICS65.020
中华人民共和国农业行业标准
NY/T2286—2012
番茄溃疡病菌检疫检测与鉴定方法Detection and identification for Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis(Smith)Davisetal.2012-12-24发布
2013-03-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准按照GB1.1给出的规则起草本标准由农业部种植业管理司提出。前言
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)归口。NY/T2286—2012
本标准起草单位：全国农业技术推广服务中心、贵州省植保植检站，贵州省植物保护研究所。本标准主要起草人：王福祥、张忠民、袁洁、熊红利、吴石平、杨学辉、江兆春、耿坤、郑松、毛东、刘新1范围
番茄溃疡病菌检疫检测与鉴定方法本标准规定了农业植物检疫中番茄溃疡病菌检疫检测及鉴定的技术方法。本标准适用于番茄溃疡病菌的检疫检测及鉴定。2规范性引用文件
NY/T2286—2012
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件仅注日期的版本适用于本文ASHING
件。凡是不注日期的引用交件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件GB/T6682分析实验室用水规格和试GB15569 农业植物调运检疫规
3术语和定义
下列术语和定义适府子
鸟眼斑免费标准bzxz.net
bird s eyg spots
茵便类备
番茄溃疡病
茄果实后果卖
渍疡斑
番茄溃疡病
状的髓腔的典型溃
4原理
中现国中
色晕圈
边缘方
形似鸟眼状的病
黄色至红褐色粉
和纯馆
拓育苗到收获期均可发生
番茄溃疡病
果系统病
（果奇或病残体为初侵染源，通过种手，伤口或植株）子远距离传播。病种
病菌主要以带菌种
水孔等自然孔口侵
植株和果实被侵染后，分别出现”溃疡斑利入植株，造成局部侵
或系统侵！
鸟眼斑”的典型为害症
菌落特征、酶联免疫双抗体夹心法（DA状。该病原菌为害番茄的典型症状、ELISA)以及聚合酶链式
反应（PCR）检测结果是鉴定该病菌的依据5试剂与材料
碳酸氢钠（NaHCO）、碳酸钠（Na.CO）、叠氨化钠（NaN）、无水磷酸氢二钠（NaHPO）、氯化钾（KCI）、无水磷酸二氢钾（KHPO）、无水磷酸氢二钾（KHPO）、氯化钠（NaCI）、无水亚硫酸钠(NazSO）氯化镁（MgCl）、七水硫酸镁（MgSO7HO）、硼酸（H.BO）等DAS-ELISA检测试剂（包被抗体、酶标抗体、包被缓冲液、PBST洗涤液、样品提取缓冲液、酶标抗体缓冲液、底物对硝基苯磷酸二钠、底物缓冲液、终止液）与mSCM选择培养基制备方法参见附录B。除另有规定，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。6仪器及用具
PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、酶标仪、恒温震荡仪、台式离心机、高压火菌器、超净工作台、生化1
NY/T2286—2012
培养箱、电子天平及其他用于病害研究的实验室必备用具。7取样方法
7.1田间植株取样
苗期至收获期如在田间发现疑似症状（参见附录A），采集病部3份-5份送实验室鉴定。如未发现疑似症状植株采用随机选点取样，每个点采集3个以上样品，样品注明采集时间、地点、采集人等信息。送实验室检验。
7.2调运种子和果实取样
散装或包装调运的番茄果实、种子，按GB15569进行取样，送实验室检验8检疫鉴定
8.1症状鉴定
直接观察样品是否具有番茄溃疡病典型症状（参见附录A）。8.2病原菌菌落特征鉴定
病原菌菌落特征鉴定方法见附录C8.3酶联免疫吸附测定法
酶联免疫吸附测定法参见附录D。如采用市售的试剂盒，按说明操作。8.4PCR检测
PCR检测鉴定方法参见附录E。如采用市售的试剂盒，按说明操作。9结果判定和报告
9.1结果判定
9.1.1根据症状进行结果判定
表现的症状完全符合番茄溃疡病典型症状的样品，判定为番茄溃疡病病菌。9.1.2室内鉴定结果判定
当植株或种子样品上表现的症状不典型时·需进行以下检测并根据检测结果判定样品是否带有番茄溃疡病病菌。
9.1.2.1根据菌落特征鉴定结果判定分离的病原菌在选择性培养基上的菌落特征符合C.3描述的典型特征，且革兰氏染色为阳性的样品，判定为样品带番茄溃疡病病菌。9.1.2.2根据酶联免疫吸附法鉴定结果判定在阴性对照OD值≤O.1，且阳性对照OD值大于阴性对照OD值2倍的前提下，样品孔OD值大于阴性对照OD值2倍时，判定为阳性反应，即样品带番茄溃疡病病菌。9.1.2.3根据PCR检测结果判定
观察电泳结果，在阳性对照在268bp处有条带出现，且阴性对照无条带出现的前提下，待测样品在268bp处有条带出现，判断样品带番茄溃疡病病菌9.1.2.4综合结果判定
当情况复杂时可进行综合判定，以上3种室内鉴定方法中有两种鉴定结果为阳性时，可判定为备茄溃疡病病菌
9.2结果报告
将实验室检验鉴定结果填人《植物有害生物样本鉴定报告》（见附录F）。2
10除害处理
NY/T2286—2012
检验过程中使用的有关材料和用具，在使用完毕后须进行消毒和除害处理。经检疫鉴定后的种子样品应保存在4℃冰箱内，叶片和果实样品应保存在一20℃以下或冻干保存三个月：保存期满后，进行灭活处理。
NY/T2286—2012
A.1学名和分类地位
附录A
（资料性附录）
番茄溃疡病基本信息
学名Clavibactermichigariensissubsp.michiganensis(Smith)Davisetal.，简称：CMM。分类地位：属厚壁菌门的微杆菌科（Microbacteriaceae），棒形杆菌属（Clavibacter）。A2典型症状
A2.1果实：番茄溃疡病菌侵染番茄果实后，果实上出现圆形病斑，中央浅褐色，边缘有白色晕圈，病斑直径3mm，形似鸟眼状的病斑。许多小病斑可联合成不规则的斑块，见图A.1。A.2.2植株：番茄溃疡病菌侵染番茄植株后，通常是一侧先发病，叶片边缘坏死、叶片萎焉至枯死、植株矮化、茎杆开裂，茎和叶柄上出现褐色条斑，下陷，病斑开裂而露出黄色至红褐色粉状的髓腔，形成典型溃疡症状，见图A.2。
图A.1番茄溃疡病果实上的典型症状A.3寄主范围
图A.2番茄溃疡病在茎杆上的典型症状自然寄主主要是番茄、龙葵、裂叶茄和其他茄科植物。接种可发病的寄主有乳茄、马铃薯、醋栗番茄、树番茄、心叶烟等。此外，还有小麦、大麦、黑麦、燕麦、向日葵、西瓜、黄瓜等，A.4病原形态及生物学特性
该病原细菌为好氧细菌，革兰氏染色阳性，菌体短杆状或棍棒形，无鞭毛，无芽孢。细胞大小为0.4m~0.7μm×0.7um1.2um，以单个或成对方式存在。碳水化合物氧化代谢，硝酸盐还原阴性，脲酶阴性，明胶液化缓慢，水解七叶苷，水解淀粉能力很弱或不水解。生长需要氨基酸、生物素、烟酸和硫胺素。最适生长温度是24℃～27℃，最高35℃。在土豆片上生长的菌落为锅黄色。在普通523细菌培养基上28℃培养.72h后出现针尖状菌落，96h菌落直径达1mm，1周后菌落圆形，略隆起，全缘不透明，NY/T2286—2012
黏稠，黄色，边缘整齐，光滑不透明，黏稠状，直径2mm~3mm。在选择性培养基mSCM上27℃培养11d，菌落圆形，呈浅米黄色，全缘，不透明，表面光滑，半流质状，直径1mm～3mm，培养基不变色。A5传播途径
病原菌的远距离传播主要是带菌种子。病原菌可随带病种子、病苗、病残体及土壤传播，形成初侵染，再以飞溅的水滴（如灌溉、雨水）等为载体，从修剪造成的伤口、毛孔或叶毛、根、气孔和其他自然孔口进人植物组织，完成再侵染。在田间或温室，病原菌通过水，培养料和修剪刀传播，伤口、果实上的病斑是通过风雨或喷灌时从病枝叶上滴下的带菌水滴传播的。A6地理分布
番茄细菌性溃疡病首先在北美发现，目前分布于加拿大、美国（包括夏威夷）、墨西哥、多米尼加、古巴、哥斯达黎加、巴拿马、格林纳达、瓜德罗普、马提尼克、哥伦比亚、秘鲁、巴西、智利、阿根廷；日本、印度、黎巴嫩、以色列、土耳其；挪威、芬兰、前苏联、前南斯拉夫、波兰、匈牙利、德国、奥地利、瑞土、荷兰、比利时、英国、爱尔兰、法国、葡萄牙、意大利、罗马尼亚、保加利亚、希腊：肯尼亚、突尼斯、摩洛哥、乌干达、赞比亚、马达加斯加、津巴布韦、南非：澳大利亚、新西兰，汤加。NY/T2286—2012
B.1DAS-ELISA检测试剂的配制
附录B
（资料性附录）
试剂与培养基的制备
B.1.1包被抗体，抗番茄溃疡病菌抗体，抗体稀释度按市售产品要求进行贮藏于4℃备用：B.1.2酶标抗体：用碱性磷酸酶标记的抗番茄溃疡病菌的免疫球蛋白抗体。按市售产品要求进行稀释，贮藏于4℃备用：
B.1.3包被缓冲液：取2.93gNaHCO1.59gNazCO.0.2gNaNa，用1000mL蒸馏水溶解，pH为9.6.贮藏于4℃备用；
B.1.4PBST洗涤液：取1.15gNaHPO.0.2gKCl.0.2gKHPO.、8.0gNaCI.0.5mL吐温-20.用1000mL蒸馏水溶解·pH为7.2；
B.1.5样品提取缓冲液：取20g聚乙烯吡略烷酮（PVP.K30）、2.0g蛋清蛋白、1.3gNazSO、0.2gNaN、20g叶温-20.用1000mL蒸馅水溶解pH为7.4，贮藏于4℃备用；B.1.6酶标抗体缓冲液：取2.0g牛血清蛋白，20.0g聚乙烯吡略烷酮（PVP，K30）0.2gNaN3.用1000mLPBST缓冲液溶解.贮藏于4℃备用；B.1.7底物缓冲液：取0.1gMgClz97mL二乙醇胺、0.2gNaNs.用800mL蒸馅水溶解pH为9.8.贮藏于4℃备用；
B.1.8终止液：12gNa0H溶于100mL蒸馏水，B.2
mSCM培养基的制备
将琼脂加人蒸馅水中加热溶解，再按配方比例将甘露糖、硫酸镁，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾和硼酸加入，另将酵母浸粉溶解在少量的蒸馏水中，分开灭菌，灭菌后再混勾，调节pH为7.0～7.2：放线菌酮、茶啶酸和烟酸分别过滤灭菌制成忙备液，待培养基冷却到50℃左右在无菌条件加人混匀，制成平板备用。培养基配方见表B,1。
表B.1mSCM培养基配方
酵母浸膏（粉
甘露糖
MgSO.7H.0
蒸馏水
放线菌酮
萘啶酸
1000mL
C.1样品制备
附录C
（规范性附录）
番茄溃疡病菌的菌落特征鉴定
NY/T2286—2012
植株及果实：对具有典型症状或疑似症状的植株茎、果实和叶片，经75%酒精表面消毒后，用无菌手术刀切取1小块变色维管束组织或典型病斑放人少量无菌水中，浸泡5min~20min，待菌悬液变浑浊后备用，
种子：取10g种子，放人100mL.的三角瓶中加人30mL无菌水，25℃200r/min恒温震荡5h。然后取10mL浸出液，用600g离心1min，取上清液在11000g离心2min，弃上清，加人100uL~200μL无菌水摇匀，制成菌悬液备用。C.2病原菌菌落培养鉴定
在无菌条件下用接种环蕴取已制备的菌悬液在mSCM选择性培养基平板上划线，25C27C培养11d后，观察是否出现典型菌落。C.3番茄溃疡病菌在选择性培养基mSCM上的菌落特征菌落圆形，呈浅米黄色、全缘不透明、表面光滑、半流质状、直径1mm-3mm，培养基不变色，见图C.l。
图C.1番茄溃疡病菌在mSCM上的菌落特征C.4革兰氏鉴定
C.4.1革兰氏染色法
C.4.1.1涂片固定。
C.4.1.2草酸铵结晶紫染1min。
C.4.1.3自来水冲洗。
C.4.1.4加碘液覆盖涂面染1min
C.4.1.5水洗，用吸水纸吸去水分。C.4.1.6加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30s后水洗，吸去水分。C.4.17
番红花红液（稀）染10S后，自米水冲洗。干燥，镜检，染色结果菌体呈紫色的为革兰氏阳NY/T2286—2012
性，菌体呈红色的为革兰氏阴性。C.4.2氢氧化钾法
C.4.2.1在洁净的载玻片上滴一滴3%氢氧化钾溶液。C.4.2.2用牙签蘸取菌体，放入上述氧氧化钾溶液中充分混匀5s~10s。C.4.2.3搅拌10s后用牙签挑取混匀的氢氧化钾菌液，能够拉出黏丝的菌株为革兰氏阴性菌，不能拉出黏丝的菌株为革兰氏阳性菌。8
D.1样品制备
样品制备方法见C.1。
D.2包被
附录D
（资料性附录）
番茄溃疡病双抗体夹心酶联免疫吸附测定NY/T2286—2012
将番益溃疡病的包被抗体按照试剂盒指定稀释比例用包被抗体缓冲液稀释，混包，加人酶联板中每孔内加人100uL，放人保湿盒内，25℃孵育4h或在4℃条件孵育16h~20h。D.3洗涤
孵育结束后，将反应孔中的试剂倒出，用PBST洗涤液冲洗3次~4次，每次15s，然后将微孔板倒扣在吸水纸上以控干孔中残留液体。D.4加入抗原（待测样品）
将100已制备的样品菌悬液加人到反应孔中，同时将阳性对照、阴性对照和空白对照滴加到相应的反应孔中.待测样品重复3次，然后放人恒湿盒中25℃孵育2h。D.5洗涤
按D.3的要求执行，用PBST洗涤液冲洗7次。D.6加入酶标抗体
将番茄溃疡病的酶标抗体按照试剂盒指定稀释比例用酶标抗体缓冲液稀释，混勾，加人酶联板中，混合均匀，于每个反应孔中加入100L，放人保湿盒内，25℃孵育2h。D.7洗涤
按D.3的要求执行，用PBST洗涤液冲洗8次。D.8加入底物试剂
孵育结束前的15min制备PNP底物溶液，加人PNP显色剂，混合均匀，加人酶联板，每孔100uL。放人保湿盒内，室温（20℃~25℃）避光30min~60min。D.9终止反应
于每孔中加入50μ终止液，终止反应。D.10测定
用酶标仪在405nm波长下测量结果，读取各孔溶液的光密度值（OD值），记录结果。9
NY/T2286—2012
E.1样品制备
附录E
（资料性附录）
番茄渍疡病菌PCR检测
待测模板DVA样品制备方法见C.1。E.2PCR反应
E.2.1引物序列
上游引物（bt1）5-CGTCAGGCGTCTGTTCT-3”：下游引物Cbt2f.5GATGCTCGCGTCCACT-3E.2.2PCR反应体系
番茄溃疡病PCR检测体系总体积25L,反应体系见表E.1。表E.1PCR反应体系
Buffer
Primer-f
Primerr
Taq酶
模板DNA
E.2.3PCR反应条件
储液浓度
反应终浓度
依次将PCR缓冲液、引物对、dNTPs、MgCl2、Tag酶、ddH,O和待测模板按照表E.1体系浓度要求加入PCR反应管，混合均匀后放入PCR扩增仪。PCR反应条件为：94℃预变性2.5min，94℃60s62℃30s.72℃45s.35个循环.72℃5min.4℃保存。
E.3PCR扩增产物凝胶电泳检测
取5LPCR扩增产物加入1uL6×上样缓冲液，以2%琼脂糖凝胶在TAE缓冲液中电泳，电泳后凝胶用0.5ug/mL溴化乙锭染色30min--45min，紫外成像后观察结果并记录结果见图E.1).
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番茄溃疡病菌检疫检测与鉴定方法Detection and identification for Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis(Smith)Davisetal.2012-12-24发布
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本标准按照GB1.1给出的规则起草本标准由农业部种植业管理司提出。前言
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)归口。NY/T2286—2012
本标准起草单位：全国农业技术推广服务中心、贵州省植保植检站，贵州省植物保护研究所。本标准主要起草人：王福祥、张忠民、袁洁、熊红利、吴石平、杨学辉、江兆春、耿坤、郑松、毛东、刘新1范围
番茄溃疡病菌检疫检测与鉴定方法本标准规定了农业植物检疫中番茄溃疡病菌检疫检测及鉴定的技术方法。本标准适用于番茄溃疡病菌的检疫检测及鉴定。2规范性引用文件
NY/T2286—2012
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件仅注日期的版本适用于本文ASHING
件。凡是不注日期的引用交件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件GB/T6682分析实验室用水规格和试GB15569 农业植物调运检疫规
3术语和定义
下列术语和定义适府子
鸟眼斑免费标准bzxz.net
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茵便类备
番茄溃疡病
茄果实后果卖
渍疡斑
番茄溃疡病
状的髓腔的典型溃
4原理
中现国中
色晕圈
边缘方
形似鸟眼状的病
黄色至红褐色粉
和纯馆
拓育苗到收获期均可发生
番茄溃疡病
果系统病
（果奇或病残体为初侵染源，通过种手，伤口或植株）子远距离传播。病种
病菌主要以带菌种
水孔等自然孔口侵
植株和果实被侵染后，分别出现”溃疡斑利入植株，造成局部侵
或系统侵！
鸟眼斑”的典型为害症
菌落特征、酶联免疫双抗体夹心法（DA状。该病原菌为害番茄的典型症状、ELISA)以及聚合酶链式
反应（PCR）检测结果是鉴定该病菌的依据5试剂与材料
碳酸氢钠（NaHCO）、碳酸钠（Na.CO）、叠氨化钠（NaN）、无水磷酸氢二钠（NaHPO）、氯化钾（KCI）、无水磷酸二氢钾（KHPO）、无水磷酸氢二钾（KHPO）、氯化钠（NaCI）、无水亚硫酸钠(NazSO）氯化镁（MgCl）、七水硫酸镁（MgSO7HO）、硼酸（H.BO）等DAS-ELISA检测试剂（包被抗体、酶标抗体、包被缓冲液、PBST洗涤液、样品提取缓冲液、酶标抗体缓冲液、底物对硝基苯磷酸二钠、底物缓冲液、终止液）与mSCM选择培养基制备方法参见附录B。除另有规定，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。6仪器及用具
PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、酶标仪、恒温震荡仪、台式离心机、高压火菌器、超净工作台、生化1
NY/T2286—2012
培养箱、电子天平及其他用于病害研究的实验室必备用具。7取样方法
7.1田间植株取样
苗期至收获期如在田间发现疑似症状（参见附录A），采集病部3份-5份送实验室鉴定。如未发现疑似症状植株采用随机选点取样，每个点采集3个以上样品，样品注明采集时间、地点、采集人等信息。送实验室检验。
7.2调运种子和果实取样
散装或包装调运的番茄果实、种子，按GB15569进行取样，送实验室检验8检疫鉴定
8.1症状鉴定
直接观察样品是否具有番茄溃疡病典型症状（参见附录A）。8.2病原菌菌落特征鉴定
病原菌菌落特征鉴定方法见附录C8.3酶联免疫吸附测定法
酶联免疫吸附测定法参见附录D。如采用市售的试剂盒，按说明操作。8.4PCR检测
PCR检测鉴定方法参见附录E。如采用市售的试剂盒，按说明操作。9结果判定和报告
9.1结果判定
9.1.1根据症状进行结果判定
表现的症状完全符合番茄溃疡病典型症状的样品，判定为番茄溃疡病病菌。9.1.2室内鉴定结果判定
当植株或种子样品上表现的症状不典型时·需进行以下检测并根据检测结果判定样品是否带有番茄溃疡病病菌。
9.1.2.1根据菌落特征鉴定结果判定分离的病原菌在选择性培养基上的菌落特征符合C.3描述的典型特征，且革兰氏染色为阳性的样品，判定为样品带番茄溃疡病病菌。9.1.2.2根据酶联免疫吸附法鉴定结果判定在阴性对照OD值≤O.1，且阳性对照OD值大于阴性对照OD值2倍的前提下，样品孔OD值大于阴性对照OD值2倍时，判定为阳性反应，即样品带番茄溃疡病病菌。9.1.2.3根据PCR检测结果判定
观察电泳结果，在阳性对照在268bp处有条带出现，且阴性对照无条带出现的前提下，待测样品在268bp处有条带出现，判断样品带番茄溃疡病病菌9.1.2.4综合结果判定
当情况复杂时可进行综合判定，以上3种室内鉴定方法中有两种鉴定结果为阳性时，可判定为备茄溃疡病病菌
9.2结果报告
将实验室检验鉴定结果填人《植物有害生物样本鉴定报告》（见附录F）。2
10除害处理
NY/T2286—2012
检验过程中使用的有关材料和用具，在使用完毕后须进行消毒和除害处理。经检疫鉴定后的种子样品应保存在4℃冰箱内，叶片和果实样品应保存在一20℃以下或冻干保存三个月：保存期满后，进行灭活处理。
NY/T2286—2012
A.1学名和分类地位
附录A
（资料性附录）
番茄溃疡病基本信息
学名Clavibactermichigariensissubsp.michiganensis(Smith)Davisetal.，简称：CMM。分类地位：属厚壁菌门的微杆菌科（Microbacteriaceae），棒形杆菌属（Clavibacter）。A2典型症状
A2.1果实：番茄溃疡病菌侵染番茄果实后，果实上出现圆形病斑，中央浅褐色，边缘有白色晕圈，病斑直径3mm，形似鸟眼状的病斑。许多小病斑可联合成不规则的斑块，见图A.1。A.2.2植株：番茄溃疡病菌侵染番茄植株后，通常是一侧先发病，叶片边缘坏死、叶片萎焉至枯死、植株矮化、茎杆开裂，茎和叶柄上出现褐色条斑，下陷，病斑开裂而露出黄色至红褐色粉状的髓腔，形成典型溃疡症状，见图A.2。
图A.1番茄溃疡病果实上的典型症状A.3寄主范围
图A.2番茄溃疡病在茎杆上的典型症状自然寄主主要是番茄、龙葵、裂叶茄和其他茄科植物。接种可发病的寄主有乳茄、马铃薯、醋栗番茄、树番茄、心叶烟等。此外，还有小麦、大麦、黑麦、燕麦、向日葵、西瓜、黄瓜等，A.4病原形态及生物学特性
该病原细菌为好氧细菌，革兰氏染色阳性，菌体短杆状或棍棒形，无鞭毛，无芽孢。细胞大小为0.4m~0.7μm×0.7um1.2um，以单个或成对方式存在。碳水化合物氧化代谢，硝酸盐还原阴性，脲酶阴性，明胶液化缓慢，水解七叶苷，水解淀粉能力很弱或不水解。生长需要氨基酸、生物素、烟酸和硫胺素。最适生长温度是24℃～27℃，最高35℃。在土豆片上生长的菌落为锅黄色。在普通523细菌培养基上28℃培养.72h后出现针尖状菌落，96h菌落直径达1mm，1周后菌落圆形，略隆起，全缘不透明，NY/T2286—2012
黏稠，黄色，边缘整齐，光滑不透明，黏稠状，直径2mm~3mm。在选择性培养基mSCM上27℃培养11d，菌落圆形，呈浅米黄色，全缘，不透明，表面光滑，半流质状，直径1mm～3mm，培养基不变色。A5传播途径
病原菌的远距离传播主要是带菌种子。病原菌可随带病种子、病苗、病残体及土壤传播，形成初侵染，再以飞溅的水滴（如灌溉、雨水）等为载体，从修剪造成的伤口、毛孔或叶毛、根、气孔和其他自然孔口进人植物组织，完成再侵染。在田间或温室，病原菌通过水，培养料和修剪刀传播，伤口、果实上的病斑是通过风雨或喷灌时从病枝叶上滴下的带菌水滴传播的。A6地理分布
番茄细菌性溃疡病首先在北美发现，目前分布于加拿大、美国（包括夏威夷）、墨西哥、多米尼加、古巴、哥斯达黎加、巴拿马、格林纳达、瓜德罗普、马提尼克、哥伦比亚、秘鲁、巴西、智利、阿根廷；日本、印度、黎巴嫩、以色列、土耳其；挪威、芬兰、前苏联、前南斯拉夫、波兰、匈牙利、德国、奥地利、瑞土、荷兰、比利时、英国、爱尔兰、法国、葡萄牙、意大利、罗马尼亚、保加利亚、希腊：肯尼亚、突尼斯、摩洛哥、乌干达、赞比亚、马达加斯加、津巴布韦、南非：澳大利亚、新西兰，汤加。NY/T2286—2012
B.1DAS-ELISA检测试剂的配制
附录B
（资料性附录）
试剂与培养基的制备
B.1.1包被抗体，抗番茄溃疡病菌抗体，抗体稀释度按市售产品要求进行贮藏于4℃备用：B.1.2酶标抗体：用碱性磷酸酶标记的抗番茄溃疡病菌的免疫球蛋白抗体。按市售产品要求进行稀释，贮藏于4℃备用：
B.1.3包被缓冲液：取2.93gNaHCO1.59gNazCO.0.2gNaNa，用1000mL蒸馏水溶解，pH为9.6.贮藏于4℃备用；
B.1.4PBST洗涤液：取1.15gNaHPO.0.2gKCl.0.2gKHPO.、8.0gNaCI.0.5mL吐温-20.用1000mL蒸馏水溶解·pH为7.2；
B.1.5样品提取缓冲液：取20g聚乙烯吡略烷酮（PVP.K30）、2.0g蛋清蛋白、1.3gNazSO、0.2gNaN、20g叶温-20.用1000mL蒸馅水溶解pH为7.4，贮藏于4℃备用；B.1.6酶标抗体缓冲液：取2.0g牛血清蛋白，20.0g聚乙烯吡略烷酮（PVP，K30）0.2gNaN3.用1000mLPBST缓冲液溶解.贮藏于4℃备用；B.1.7底物缓冲液：取0.1gMgClz97mL二乙醇胺、0.2gNaNs.用800mL蒸馅水溶解pH为9.8.贮藏于4℃备用；
B.1.8终止液：12gNa0H溶于100mL蒸馏水，B.2
mSCM培养基的制备
将琼脂加人蒸馅水中加热溶解，再按配方比例将甘露糖、硫酸镁，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾和硼酸加入，另将酵母浸粉溶解在少量的蒸馏水中，分开灭菌，灭菌后再混勾，调节pH为7.0～7.2：放线菌酮、茶啶酸和烟酸分别过滤灭菌制成忙备液，待培养基冷却到50℃左右在无菌条件加人混匀，制成平板备用。培养基配方见表B,1。
表B.1mSCM培养基配方
酵母浸膏（粉
甘露糖
MgSO.7H.0
蒸馏水
放线菌酮
萘啶酸
1000mL
C.1样品制备
附录C
（规范性附录）
番茄溃疡病菌的菌落特征鉴定
NY/T2286—2012
植株及果实：对具有典型症状或疑似症状的植株茎、果实和叶片，经75%酒精表面消毒后，用无菌手术刀切取1小块变色维管束组织或典型病斑放人少量无菌水中，浸泡5min~20min，待菌悬液变浑浊后备用，
种子：取10g种子，放人100mL.的三角瓶中加人30mL无菌水，25℃200r/min恒温震荡5h。然后取10mL浸出液，用600g离心1min，取上清液在11000g离心2min，弃上清，加人100uL~200μL无菌水摇匀，制成菌悬液备用。C.2病原菌菌落培养鉴定
在无菌条件下用接种环蕴取已制备的菌悬液在mSCM选择性培养基平板上划线，25C27C培养11d后，观察是否出现典型菌落。C.3番茄溃疡病菌在选择性培养基mSCM上的菌落特征菌落圆形，呈浅米黄色、全缘不透明、表面光滑、半流质状、直径1mm-3mm，培养基不变色，见图C.l。
图C.1番茄溃疡病菌在mSCM上的菌落特征C.4革兰氏鉴定
C.4.1革兰氏染色法
C.4.1.1涂片固定。
C.4.1.2草酸铵结晶紫染1min。
C.4.1.3自来水冲洗。
C.4.1.4加碘液覆盖涂面染1min
C.4.1.5水洗，用吸水纸吸去水分。C.4.1.6加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30s后水洗，吸去水分。C.4.17
番红花红液（稀）染10S后，自米水冲洗。干燥，镜检，染色结果菌体呈紫色的为革兰氏阳NY/T2286—2012
性，菌体呈红色的为革兰氏阴性。C.4.2氢氧化钾法
C.4.2.1在洁净的载玻片上滴一滴3%氢氧化钾溶液。C.4.2.2用牙签蘸取菌体，放入上述氧氧化钾溶液中充分混匀5s~10s。C.4.2.3搅拌10s后用牙签挑取混匀的氢氧化钾菌液，能够拉出黏丝的菌株为革兰氏阴性菌，不能拉出黏丝的菌株为革兰氏阳性菌。8
D.1样品制备
样品制备方法见C.1。
D.2包被
附录D
（资料性附录）
番茄溃疡病双抗体夹心酶联免疫吸附测定NY/T2286—2012
将番益溃疡病的包被抗体按照试剂盒指定稀释比例用包被抗体缓冲液稀释，混包，加人酶联板中每孔内加人100uL，放人保湿盒内，25℃孵育4h或在4℃条件孵育16h~20h。D.3洗涤
孵育结束后，将反应孔中的试剂倒出，用PBST洗涤液冲洗3次~4次，每次15s，然后将微孔板倒扣在吸水纸上以控干孔中残留液体。D.4加入抗原（待测样品）
将100已制备的样品菌悬液加人到反应孔中，同时将阳性对照、阴性对照和空白对照滴加到相应的反应孔中.待测样品重复3次，然后放人恒湿盒中25℃孵育2h。D.5洗涤
按D.3的要求执行，用PBST洗涤液冲洗7次。D.6加入酶标抗体
将番茄溃疡病的酶标抗体按照试剂盒指定稀释比例用酶标抗体缓冲液稀释，混勾，加人酶联板中，混合均匀，于每个反应孔中加入100L，放人保湿盒内，25℃孵育2h。D.7洗涤
按D.3的要求执行，用PBST洗涤液冲洗8次。D.8加入底物试剂
孵育结束前的15min制备PNP底物溶液，加人PNP显色剂，混合均匀，加人酶联板，每孔100uL。放人保湿盒内，室温（20℃~25℃）避光30min~60min。D.9终止反应
于每孔中加入50μ终止液，终止反应。D.10测定
用酶标仪在405nm波长下测量结果，读取各孔溶液的光密度值（OD值），记录结果。9
NY/T2286—2012
E.1样品制备
附录E
（资料性附录）
番茄渍疡病菌PCR检测
待测模板DVA样品制备方法见C.1。E.2PCR反应
E.2.1引物序列
上游引物（bt1）5-CGTCAGGCGTCTGTTCT-3”：下游引物Cbt2f.5GATGCTCGCGTCCACT-3E.2.2PCR反应体系
番茄溃疡病PCR检测体系总体积25L,反应体系见表E.1。表E.1PCR反应体系
Buffer
Primer-f
Primerr
Taq酶
模板DNA
E.2.3PCR反应条件
储液浓度
反应终浓度
依次将PCR缓冲液、引物对、dNTPs、MgCl2、Tag酶、ddH,O和待测模板按照表E.1体系浓度要求加入PCR反应管，混合均匀后放入PCR扩增仪。PCR反应条件为：94℃预变性2.5min，94℃60s62℃30s.72℃45s.35个循环.72℃5min.4℃保存。
E.3PCR扩增产物凝胶电泳检测
取5LPCR扩增产物加入1uL6×上样缓冲液，以2%琼脂糖凝胶在TAE缓冲液中电泳，电泳后凝胶用0.5ug/mL溴化乙锭染色30min--45min，紫外成像后观察结果并记录结果见图E.1).
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