NY/T 2287-2012
基本信息
标准号： NY/T 2287-2012
中文名称：水稻细菌性条斑病菌检疫检测与鉴定方法
标准类别：农业行业标准(NY)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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相关标签： 水稻 细菌性 条斑 病菌 检疫 检测 鉴定 方法
标准分类号
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标准简介
NY/T 2287-2012 水稻细菌性条斑病菌检疫检测与鉴定方法
NY/T2287-2012
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标准内容
ICS65.020
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 2287—2012
水稻细菌性条斑病菌检疫检测与鉴定方法Detection and identification for Xanthomonas oryzae py.oryzicola(Fang et al.jSwings et al)2012-12-24发布
2013-03-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准按照GB1.1给出的规则起草。言
本标准出农业部种植业管理司提山。本标准出全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC 271)归口。NY/T 2287—2012
木标准起草单位：全国农业技术推广服务中心、汇苏省植物保护站、南京农业大学。本标准主要起草人：王福祥、龚伟荣、胡白石、刘慧、褚妹獭、李潇楠、胡婕、朱莉。1
1范围
水韬细菌性条斑病菌检疫检测与鉴定方法本标准规定了农业植物检疫中水稻细菌性条斑病菌检测鉴定的技术方法。本标准适用于水稻细菌性条斑病的检测鉴定，2规范性引用文件
NY/T 2287—2012
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适川于木文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版木(包括所有的修改单)适用于本文件。B/T6682分析实验案月水规格和试验方法GB8371-2009水稻种子产地检疫规程GB155692009农业植物调运检疫规程3原理
水稻细菌性条斑病是为害水稻的重要细菌病害，属国内植物检疫性有害生物。水稍细菌性条斑病菌的间症状、菌落形态特征，致病性测试、血清学反成和PCR反成等特征是检测与鉴定的重要依据：4试剂与材料
无水磷酸氢二钠（NaeHP()）、无水磷酸氢二铆（KIIP）、无水磷酸一氢钾（KH,PO）、碳酸钠（NaCO)）、碳酸氢钠（NaIICO）氯化钠（NaC1），氯化钾（KCI），氯化镁（MgCl）、无水亚硫酸钠（NlS0）氢氧化钠（NaOH)、氢氧化钾（KOH）、碘化钟（KI)，七水硫酸镁（MgS0：7IIz)、叠氮化钠（NaN:）、草酸铵_（NH)C,O]、对硝基苯磷酸二钠(PNPI)、无菌水、乙醇,市售抗体.市售酶标抗体,市售[CR试剂等。检验中所需的其他试剂与培养基，参见附录A，除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。5仪器及用具
超净1作台、电子天平、磁力搅拌器、斥灭菌锅、培养箱、水浴锅、生物显微镜、体式显微镜、小型粉碎机、高速台式离心机、酶标仪、电泳仪、紫外分光光度计、常规PCR仪、凝胶成像系统、冰箱、超低温冰箱，超纯水器或纯水器，恒温于燥箱、微量移液器等。6取样方法
6.1叶片取样
日间发现水稍细菌性条斑病典型或疑似症状的叶片时（见附录B)，直接菜样检验，6.2种子取样
对调运中的种子,接照GB15569—2009中6.2的要求抽样。7检验鉴定
7.1症状识别
在水稽生长期按照GB8371一2009中8.1的要求进行田间调查，与水稻细菌性条斑病为害的典型症状进行比较（见附录B)，符合典型症状的可进行症状鉴定。如发现疑似症状，可采用常规鉴定、1
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ELISA检测以及PCR检测。
7.2常规鉴定
7.2.1菌溢检查
切取日间采回的植株叶片病健交界处约20mm，平放在载玻片的水滴中，加盖玻片后，衣在低倍显微镜下观察并记录有无喷菌现象。7.2.2分离培养
在无菌条件下选取疑似症状叶片病健交界处组织约（3mm~5mm）×（3mm~5mm），用75%乙醇表面消毒15s，无菌水清洗2次~3次后放人0.2ml无菌水巾，用灭菌璃棒研碎，在温下浸泡10min~-30min。将悬浮液在NBY培养基平板I划线.电复3个~~5个平板，（27土2)℃C培养3d~5d.观察并记录病原菌形态特征和培养特性（见附录B)。7.2.3革兰氏鉴定
挑取少量分离到的病原菌配制成恐浮液，进行革兰氏染色汰染色或3%KOII溶解试验（参见附录C），观察记录病菌的形状，大小和染色反应。7.2.4致病性鉴定
将分离培养得到的纯培养菌株，用无菌水配制细菌悬浮液（10fu/ml），川无菌接种针针刺接种了感病水稍品种川片中部，每张叶片针刺2个点～3个点，每株接种2片叶～3片叶，接种10株。接种植株套袋保湿24h.12h光照/黑暗的循环条件下30%培养，接种48h72h后观察并记录水稻植株发病情况。
7.3ELISA捡测
水韬细菌性条斑病ELISA检测程序参见附录ID。如采用市售的试剂盒，按说明操作。7.4PCR检测
水稍细菌性条斑病常规PCR检测程序参见附录E，如采用市售的试剂盒，按说明操作。8结果判定和报告
8.1结果判定
8.1.1症状识别判定
出问植株发病症状符合附录B描述的水稀细菌性条斑病典型症状,判断为水稻细菌性条斑病。8.1.2常规鉴定结果判定
镜检有菌溢现象，分离培养物形态特征和培养特性符合水稻细菌性条斑病菌的形态特征（参见附录B),革兰氏染色阴性，敛病性鉴定产尘典型症状，确定病原菌灼水稻细菌性条斑病菌。8.1.3ELIS检测结果判定
在阴性对照OD值≤0.1,月阴性对照OD值大丁阴性对照（1)值2倍的前提下,样品孔OL)值大丁阴性对照（)D值2倍时，判定为阳性反应，即样品带水稻细菌性条斑病菌：否则判定为阴性反成，即样品不带水稍细菌性条斑病菌。
8.1.4PCR检测结果判定
观察电泳结果，阳附性对照在338bp处有条带出现，且阴性对照无条惜出现的前提下，待测样品在338hp处有条带出现，判断样品携带水稻细菌性条斑病菌；否则判定为阴性反应，即样品不带水稻细菌性条斑病菌
8.2结果报告
将实验室检验鉴定结果填人《植物有害生物样本鉴定报告》(见附录F)。9样品处理和样品、菌种保存
检验过程中使用的有关材料和用具，在使用完毕府须进行消毒和除害处理。经检验鉴定后的种子2
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样品应保存在4℃冰箱内，叶片和种子样品应保存在一20℃以下或冻干保存三个月保存期满后，进行灭活处理。分离得到的水稻细菌性条斑病菌菌株应妥善保存，防止扩散。3
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A.1革兰氏染色液
附录A
[资料性附录]
试剂及培养基的配制方法
A.1.1结晶紫液
A液：品紫2g，95%酒精20mlB液：（NH）2Cz0,0.8g，蒸馏水80mL。使用前将A、B液相混,静置 18 h后使用。
A.1.2碘液
121g，K12g，蒸馏水300mL，将KI溶于少显蒸馏水中，然后加人I2.待I2仑部溶解后，加水稀释至 300 .
A.1.3番红花红液
2.5%番红花红酒精溶液10ml，蒸馏水100mL。A.2样品提取液
取1.15gNazHPO、0.2gKCl、0.2gKH,PO4、8gNaCI、0.2gNaN用1000ml.蒸馅水溶解，并调整pH到7.4。
A. 3 ELISA检测
A.3.1洗涤液
取 1. 15 g Na.HPO,,0. 2 KCl.0. 2 g KII,PO4、8 g NaC1,0. 5 g 叶温 20.用 1 000 rnL 蒸馏水溶解, 并调整 pH 到 7. 4.
A.3.2封闭液
取5%脱脂奶粉用100mL样品提取液溶解。A.3.3包被液
取 2. 93 gNaIIX),,1. 59 gNal,(X),,0. 2 g NaN,用 1 000 mL蒸馏水溶解,并调 pH 到 9. 6,A.3.4抗体稀释液
取2.5g脱脂奶粉、加100ml.洗涤液溶解。A.3.5底物缓冲液
用80ml.灭菌蒸馏水将0.01gMgCls、0.02gNaN:、9.7mL二乙醇胺溶解后，调整pH到9.8，定容到100mL，
A.3.6底物溶液
取5 mgPNPP溶解丁5ml.底物缓冲液中。底物溶液需在孵育结束前l0 Imin制备.避光保存。A.3.7终止液
取12gNa0H,用100mL蒸馏水溶解。A.4 PCR
A.4.1PBS缓冲液
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在930mL蒸馅水中按次序慢慢加人1.15gNaHPO、0.2gKCl、0.2gKII,P,、8.0gNaC1、0.2gNaNs，调节pH至7.4，加蒸馅水至1000mL。A.4.2电泳缓冲液TBE
在1T.水中加人Tris碱54 g、硼酸 27.5 g、20 mL 0.5mol/I.EDTA(pH8. 0),使用时稀释为1×I:作液。
A.4.3琼脂糖凝胶
在0.5×TBET作液中加人1%的琼脂糖，融化，冷却至60℃倒人插入梳-了的制胶槽中，冷却凝固后点样电泳。
A.4.4样品缓冲液
取溴百里酚蓝0.025g，乙二醇3g，加10mL蒸馏水。A.5 NBY 培养基
取牛肉汁8.0g,酵母膏2.0g.K.IIP.2.0g,KIIzPO40.5g葡萄糖2.5g琼脂15g,水1L火菌后加1 mL.过滤灭菌的1mol/LMgSO·7H0游液NY/T2287—2012
B.1分类地位
附录B
【规范性附录】
水稻细菌性条斑病基本信息
水稻细菌性条斑病菌[XanthamonasoryzaeDv.oryzicota(Fangctal.)Swingyctal.，1990]属于原核牛物界（Procaryotae），薄壁菌门（Gracilicutes），假黄单胞菌科（Pscudomonaceac），黄单胞菌属（Xanthurumus），英文名Bactcrial leaif SureakofRicc。B.2形态特征
菌体短杆状，人小(0.4~0.6)am×(1.1~~2.0)μm无芽抱和英膜，菌体外其黏质的胞外多糖包围;单牛，很少成对.不士链状：极生鞭毛一根，毕兰氏染色阴性好气。B.3生物学特性
病菌最适生长温度25℃~28℃，生长温限8℃～38℃。在选择性培养基上开始生长或3d后观察菌落形态特征，NA培养基上，菌落平滑，不透明，有光泽，圆形，口起，边缘完整；初始为色，后变为浅黄色，培养3d后直径达到1mm-~2mm；在NBY培养基上.的菌落形态为：浅黄色，圆形，凸起，黏液状。B.4田间症状特征
整个水稻生育期的叶片均Ⅲ受害。病菌侵入后，开始显症为细小水渍状短条点斑，渐形成叶脉间透明条斑，后由于受脉限制，形成宽约0.25mm，长约1mm~5mm的条斑，随后，单个病斑可扩大到宽1mm，长10mm以上，颜色出黄转黄褐色，对光观察呈油渍状半透明。病情严重时，多个条斑融合、连接在一起，形成不规则的黄褐色至黄色斑块，导致病叶枯萎，变祸，最斥死亡，府期的症状与白叶估病有些相似。湿度大吋,病斑山现许多黄色菌脓，下燥后呈鱼籽状。B.5水稻细菌性条斑病与水稻白叶枯病田间症状特征比较水稍细菌性条斑病菌与水稻白叶枯病菌尚属黄单胞菌属（Xanthomonas）的细菌，田间症状主要区别死表B.1。
裹B1水稻细菌性条斑病与水稻白叶枯病田间症状特征比较水稻细菌性条斑病
发病部位
病斑形状
役人部位
对光透视病斑
发病时期
叶面任何部位
韧为暗缘色针头状油点，后扩成出黄绿色到黄稠色，受叶脉限制形成纸条病斑病菌工要从气孔及伤口侵人
半透明
山间禄度较低时，出可产牛菌脓。腊黄、露珠状,较小而豆書,不易脱落水稻整·个牛育期均可发病
水稻白叶枯病
从叶尖或叫缘开始
初为暗绿包短线状,继发展成黄绿色长条纹状,启为炭H色案斑，病健组织界线明显，分界处成波纹状病菌主要从伤口及水充侵入
不透萌
田间凝度大时、产生菌糜，蜜黄色、珠状、大而蛋少、易脱游
水稻秧苗期般很少出现症状
C.1常规革兰氏染色法
附录C
【资料性附录
水稻细菌性条斑病菌革兰氏染色鉴定一般包括初染、媒染，脱色、复染等四个步骤，具体操作方法为：NY/T 2287—2012
涂片固定后用草酸铵结品紫染1min，自来水冲洗，加碘液覆盖涂向染1min后水洗，并用吸水纸吸去水分。加95%酒精数滴，并轻轻播动进行脱色，30s后水洗，吸去水分。加番红花红液染10s后，自来水冲洗。十燥，镜检。
若菌体都呈紫色为革兰氏阳性菌，菌体呈红色为革兰氏阴性菌。C.23%KO溶解试验
在载玻片上加一小滴3%KOH液。用灭菌牙签挑取少量纯培养的菌落，放人3%K(FI液滴中，轻轻搅拌，5s～10$后慢慢向上提起，如有黏丝出现，则为革兰氏阴性菌；若无黏丝出现，即为革兰氏附性菌。
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D.1 制样
D. 1. 1叶片样品
附录D
【资料性附录】
水稻细菌性条斑病菌 ELISA检验程序将田间采回的植株口叶片先用无菌水洗2次，再用75%酒精表面消毒15s将样品剪成20mm2小片，装人烧杯中，按照供试样品质量（g）：样品提取液体积（.mL）=1：20的比例加人样品提取液，静置浸泡 10 min。
D.1.2种子样品
取样品种厂20g.用小型粉碎机粉碎10s，使谷壳破裂。将样品用样品提取液25nL包被液浸泡10min.
3病原菌分离物
用接种环挑取一环病原菌菌液，加入1mL样品提取液中混勾，经10000r/min离心2min，充1清液重复3次。
D.2包被
D.2. 1加样
在制备好的样品中加人300L.1×的包被缓冲液混合均匀，取100μ.加人酶联板各反应孔中，每个样品设一次重复，设置灭活菌液为阳性对照、水稀健康组织漫泡液和包被缓冲液为阴性对照，D.2.2封闭
将嗨联板置于37℃的恒温箱中至酶联板反应孔中的样品完全干燥。在每个反应孔中加入200μ封闭液，置于密封直可保湿的器中，25恒温孵育30min。D.2.3洗板
将反应孔中的液体例l，用洗涤液加满每个反应孔，静置1in～2min后，将洗涤液倾出，重复洗涤2次。洗板完成后将酶联板倒置十1净吸水纸上，吸干反成孔中的水分。D.3结合抗体
D.3.1加抗体
每孔加人100ul.用抗体稀释液按市售产品要求进行稀释的抗体，置于保湿容器中，25℃孵育1h。I.3.2洗板
参照I.2.3洗板方法进行。
D.4结合酶标抗体
D.4.1加酶标抗体
每孔加人100L接照使用说明-$要求稀释的酶标抗体。孵育方法同D.3.1。D.4.2洗板
参照D.2.3洗板方法进行。
D.5显色
每孔加人100μL底物溶液，25℃避光孵育30min～60min至阳性对照显色。终止反应
显色后在每孔中加人50μI.终正液。D.7测定
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用酶标仪在405nm波长下测结果，读取各孔溶液的光密度值（（D值），记录结果。9
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E.1制样
样品制备方法见 D. 1。
E.2PCR检测方法
E.2.1PCR引物
附录E
【资料性附录】
水稻细菌性条斑病菌 PCK检验程序上游物（XF）：5ATATTGGGCTGGTGGGTGATC-3、下游引物（Xo0cR）：5°TTGGTACGCGATGCCCTTTGCGACGG-3'；扩增产物为338bp。E2.2PCR反应体系
见表 E.1.
反虚组成
10X PCR huffr
25mmMgl
25 mm dNTP
20mg/ml.牛血清（蛋（LS4)
1%Tween 20
Primer(20 pm)
5 U/μI. Tau DNA 案个酶
模板DNA
E.2.3PCR反应条件
94℃5min,91℃30s.62℃30s,72℃1min(35个循环）：72℃10minE.3电泳
体积，ul.
坂PCR扩增产物5uL与样品缓冲液1uI.混合均句，用1%的琼脂糖凝胶电泳（80V1h)后，浪化乙锭（EB)染色(20min~30min)，在凝胶成像系统中观察，记录观察结果（图E.1)。M
样品，
他样品：
图E.1引物XnocF/Xoo:RPCR扩增产物电泳图
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水稻细菌性条斑病菌检疫检测与鉴定方法Detection and identification for Xanthomonas oryzae py.oryzicola(Fang et al.jSwings et al)2012-12-24发布
2013-03-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准按照GB1.1给出的规则起草。言
本标准出农业部种植业管理司提山。本标准出全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC 271)归口。NY/T 2287—2012
木标准起草单位：全国农业技术推广服务中心、汇苏省植物保护站、南京农业大学。本标准主要起草人：王福祥、龚伟荣、胡白石、刘慧、褚妹獭、李潇楠、胡婕、朱莉。1
1范围
水韬细菌性条斑病菌检疫检测与鉴定方法本标准规定了农业植物检疫中水稻细菌性条斑病菌检测鉴定的技术方法。本标准适用于水稻细菌性条斑病的检测鉴定，2规范性引用文件
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下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适川于木文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版木(包括所有的修改单)适用于本文件。B/T6682分析实验案月水规格和试验方法GB8371-2009水稻种子产地检疫规程GB155692009农业植物调运检疫规程3原理
水稻细菌性条斑病是为害水稻的重要细菌病害，属国内植物检疫性有害生物。水稍细菌性条斑病菌的间症状、菌落形态特征，致病性测试、血清学反成和PCR反成等特征是检测与鉴定的重要依据：4试剂与材料
无水磷酸氢二钠（NaeHP()）、无水磷酸氢二铆（KIIP）、无水磷酸一氢钾（KH,PO）、碳酸钠（NaCO)）、碳酸氢钠（NaIICO）氯化钠（NaC1），氯化钾（KCI），氯化镁（MgCl）、无水亚硫酸钠（NlS0）氢氧化钠（NaOH)、氢氧化钾（KOH）、碘化钟（KI)，七水硫酸镁（MgS0：7IIz)、叠氮化钠（NaN:）、草酸铵_（NH)C,O]、对硝基苯磷酸二钠(PNPI)、无菌水、乙醇,市售抗体.市售酶标抗体,市售[CR试剂等。检验中所需的其他试剂与培养基，参见附录A，除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。5仪器及用具
超净1作台、电子天平、磁力搅拌器、斥灭菌锅、培养箱、水浴锅、生物显微镜、体式显微镜、小型粉碎机、高速台式离心机、酶标仪、电泳仪、紫外分光光度计、常规PCR仪、凝胶成像系统、冰箱、超低温冰箱，超纯水器或纯水器，恒温于燥箱、微量移液器等。6取样方法
6.1叶片取样
日间发现水稍细菌性条斑病典型或疑似症状的叶片时（见附录B)，直接菜样检验，6.2种子取样
对调运中的种子,接照GB15569—2009中6.2的要求抽样。7检验鉴定
7.1症状识别
在水稽生长期按照GB8371一2009中8.1的要求进行田间调查，与水稻细菌性条斑病为害的典型症状进行比较（见附录B)，符合典型症状的可进行症状鉴定。如发现疑似症状，可采用常规鉴定、1
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ELISA检测以及PCR检测。
7.2常规鉴定
7.2.1菌溢检查
切取日间采回的植株叶片病健交界处约20mm，平放在载玻片的水滴中，加盖玻片后，衣在低倍显微镜下观察并记录有无喷菌现象。7.2.2分离培养
在无菌条件下选取疑似症状叶片病健交界处组织约（3mm~5mm）×（3mm~5mm），用75%乙醇表面消毒15s，无菌水清洗2次~3次后放人0.2ml无菌水巾，用灭菌璃棒研碎，在温下浸泡10min~-30min。将悬浮液在NBY培养基平板I划线.电复3个~~5个平板，（27土2)℃C培养3d~5d.观察并记录病原菌形态特征和培养特性（见附录B)。7.2.3革兰氏鉴定
挑取少量分离到的病原菌配制成恐浮液，进行革兰氏染色汰染色或3%KOII溶解试验（参见附录C），观察记录病菌的形状，大小和染色反应。7.2.4致病性鉴定
将分离培养得到的纯培养菌株，用无菌水配制细菌悬浮液（10fu/ml），川无菌接种针针刺接种了感病水稍品种川片中部，每张叶片针刺2个点～3个点，每株接种2片叶～3片叶，接种10株。接种植株套袋保湿24h.12h光照/黑暗的循环条件下30%培养，接种48h72h后观察并记录水稻植株发病情况。
7.3ELISA捡测
水韬细菌性条斑病ELISA检测程序参见附录ID。如采用市售的试剂盒，按说明操作。7.4PCR检测
水稍细菌性条斑病常规PCR检测程序参见附录E，如采用市售的试剂盒，按说明操作。8结果判定和报告
8.1结果判定
8.1.1症状识别判定
出问植株发病症状符合附录B描述的水稀细菌性条斑病典型症状,判断为水稻细菌性条斑病。8.1.2常规鉴定结果判定
镜检有菌溢现象，分离培养物形态特征和培养特性符合水稻细菌性条斑病菌的形态特征（参见附录B),革兰氏染色阴性，敛病性鉴定产尘典型症状，确定病原菌灼水稻细菌性条斑病菌。8.1.3ELIS检测结果判定
在阴性对照OD值≤0.1,月阴性对照OD值大丁阴性对照（1)值2倍的前提下,样品孔OL)值大丁阴性对照（)D值2倍时，判定为阳性反应，即样品带水稻细菌性条斑病菌：否则判定为阴性反成，即样品不带水稍细菌性条斑病菌。
8.1.4PCR检测结果判定
观察电泳结果，阳附性对照在338bp处有条带出现，且阴性对照无条惜出现的前提下，待测样品在338hp处有条带出现，判断样品携带水稻细菌性条斑病菌；否则判定为阴性反应，即样品不带水稻细菌性条斑病菌
8.2结果报告
将实验室检验鉴定结果填人《植物有害生物样本鉴定报告》(见附录F)。9样品处理和样品、菌种保存
检验过程中使用的有关材料和用具，在使用完毕府须进行消毒和除害处理。经检验鉴定后的种子2
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样品应保存在4℃冰箱内，叶片和种子样品应保存在一20℃以下或冻干保存三个月保存期满后，进行灭活处理。分离得到的水稻细菌性条斑病菌菌株应妥善保存，防止扩散。3
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A.1革兰氏染色液
附录A
[资料性附录]
试剂及培养基的配制方法
A.1.1结晶紫液
A液：品紫2g，95%酒精20mlB液：（NH）2Cz0,0.8g，蒸馏水80mL。使用前将A、B液相混,静置 18 h后使用。
A.1.2碘液
121g，K12g，蒸馏水300mL，将KI溶于少显蒸馏水中，然后加人I2.待I2仑部溶解后，加水稀释至 300 .
A.1.3番红花红液
2.5%番红花红酒精溶液10ml，蒸馏水100mL。A.2样品提取液
取1.15gNazHPO、0.2gKCl、0.2gKH,PO4、8gNaCI、0.2gNaN用1000ml.蒸馅水溶解，并调整pH到7.4。
A. 3 ELISA检测
A.3.1洗涤液
取 1. 15 g Na.HPO,,0. 2 KCl.0. 2 g KII,PO4、8 g NaC1,0. 5 g 叶温 20.用 1 000 rnL 蒸馏水溶解, 并调整 pH 到 7. 4.
A.3.2封闭液
取5%脱脂奶粉用100mL样品提取液溶解。A.3.3包被液
取 2. 93 gNaIIX),,1. 59 gNal,(X),,0. 2 g NaN,用 1 000 mL蒸馏水溶解,并调 pH 到 9. 6,A.3.4抗体稀释液
取2.5g脱脂奶粉、加100ml.洗涤液溶解。A.3.5底物缓冲液
用80ml.灭菌蒸馏水将0.01gMgCls、0.02gNaN:、9.7mL二乙醇胺溶解后，调整pH到9.8，定容到100mL，
A.3.6底物溶液
取5 mgPNPP溶解丁5ml.底物缓冲液中。底物溶液需在孵育结束前l0 Imin制备.避光保存。A.3.7终止液
取12gNa0H,用100mL蒸馏水溶解。A.4 PCR
A.4.1PBS缓冲液
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在930mL蒸馅水中按次序慢慢加人1.15gNaHPO、0.2gKCl、0.2gKII,P,、8.0gNaC1、0.2gNaNs，调节pH至7.4，加蒸馅水至1000mL。A.4.2电泳缓冲液TBE
在1T.水中加人Tris碱54 g、硼酸 27.5 g、20 mL 0.5mol/I.EDTA(pH8. 0),使用时稀释为1×I:作液。
A.4.3琼脂糖凝胶
在0.5×TBET作液中加人1%的琼脂糖，融化，冷却至60℃倒人插入梳-了的制胶槽中，冷却凝固后点样电泳。
A.4.4样品缓冲液
取溴百里酚蓝0.025g，乙二醇3g，加10mL蒸馏水。A.5 NBY 培养基
取牛肉汁8.0g,酵母膏2.0g.K.IIP.2.0g,KIIzPO40.5g葡萄糖2.5g琼脂15g,水1L火菌后加1 mL.过滤灭菌的1mol/LMgSO·7H0游液NY/T2287—2012
B.1分类地位
附录B
【规范性附录】
水稻细菌性条斑病基本信息
水稻细菌性条斑病菌[XanthamonasoryzaeDv.oryzicota(Fangctal.)Swingyctal.，1990]属于原核牛物界（Procaryotae），薄壁菌门（Gracilicutes），假黄单胞菌科（Pscudomonaceac），黄单胞菌属（Xanthurumus），英文名Bactcrial leaif SureakofRicc。B.2形态特征
菌体短杆状，人小(0.4~0.6)am×(1.1~~2.0)μm无芽抱和英膜，菌体外其黏质的胞外多糖包围;单牛，很少成对.不士链状：极生鞭毛一根，毕兰氏染色阴性好气。B.3生物学特性
病菌最适生长温度25℃~28℃，生长温限8℃～38℃。在选择性培养基上开始生长或3d后观察菌落形态特征，NA培养基上，菌落平滑，不透明，有光泽，圆形，口起，边缘完整；初始为色，后变为浅黄色，培养3d后直径达到1mm-~2mm；在NBY培养基上.的菌落形态为：浅黄色，圆形，凸起，黏液状。B.4田间症状特征
整个水稻生育期的叶片均Ⅲ受害。病菌侵入后，开始显症为细小水渍状短条点斑，渐形成叶脉间透明条斑，后由于受脉限制，形成宽约0.25mm，长约1mm~5mm的条斑，随后，单个病斑可扩大到宽1mm，长10mm以上，颜色出黄转黄褐色，对光观察呈油渍状半透明。病情严重时，多个条斑融合、连接在一起，形成不规则的黄褐色至黄色斑块，导致病叶枯萎，变祸，最斥死亡，府期的症状与白叶估病有些相似。湿度大吋,病斑山现许多黄色菌脓，下燥后呈鱼籽状。B.5水稻细菌性条斑病与水稻白叶枯病田间症状特征比较水稍细菌性条斑病菌与水稻白叶枯病菌尚属黄单胞菌属（Xanthomonas）的细菌，田间症状主要区别死表B.1。
裹B1水稻细菌性条斑病与水稻白叶枯病田间症状特征比较水稻细菌性条斑病
发病部位
病斑形状
役人部位
对光透视病斑
发病时期
叶面任何部位
韧为暗缘色针头状油点，后扩成出黄绿色到黄稠色，受叶脉限制形成纸条病斑病菌工要从气孔及伤口侵人
半透明
山间禄度较低时，出可产牛菌脓。腊黄、露珠状,较小而豆書,不易脱落水稻整·个牛育期均可发病
水稻白叶枯病
从叶尖或叫缘开始
初为暗绿包短线状,继发展成黄绿色长条纹状,启为炭H色案斑，病健组织界线明显，分界处成波纹状病菌主要从伤口及水充侵入
不透萌
田间凝度大时、产生菌糜，蜜黄色、珠状、大而蛋少、易脱游
水稻秧苗期般很少出现症状
C.1常规革兰氏染色法
附录C
【资料性附录
水稻细菌性条斑病菌革兰氏染色鉴定一般包括初染、媒染，脱色、复染等四个步骤，具体操作方法为：NY/T 2287—2012
涂片固定后用草酸铵结品紫染1min，自来水冲洗，加碘液覆盖涂向染1min后水洗，并用吸水纸吸去水分。加95%酒精数滴，并轻轻播动进行脱色，30s后水洗，吸去水分。加番红花红液染10s后，自来水冲洗。十燥，镜检。
若菌体都呈紫色为革兰氏阳性菌，菌体呈红色为革兰氏阴性菌。C.23%KO溶解试验
在载玻片上加一小滴3%KOH液。用灭菌牙签挑取少量纯培养的菌落，放人3%K(FI液滴中，轻轻搅拌，5s～10$后慢慢向上提起，如有黏丝出现，则为革兰氏阴性菌；若无黏丝出现，即为革兰氏附性菌。
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D.1 制样
D. 1. 1叶片样品
附录D
【资料性附录】
水稻细菌性条斑病菌 ELISA检验程序将田间采回的植株口叶片先用无菌水洗2次，再用75%酒精表面消毒15s将样品剪成20mm2小片，装人烧杯中，按照供试样品质量（g）：样品提取液体积（.mL）=1：20的比例加人样品提取液，静置浸泡 10 min。
D.1.2种子样品
取样品种厂20g.用小型粉碎机粉碎10s，使谷壳破裂。将样品用样品提取液25nL包被液浸泡10min.
3病原菌分离物
用接种环挑取一环病原菌菌液，加入1mL样品提取液中混勾，经10000r/min离心2min，充1清液重复3次。
D.2包被
D.2. 1加样
在制备好的样品中加人300L.1×的包被缓冲液混合均匀，取100μ.加人酶联板各反应孔中，每个样品设一次重复，设置灭活菌液为阳性对照、水稀健康组织漫泡液和包被缓冲液为阴性对照，D.2.2封闭
将嗨联板置于37℃的恒温箱中至酶联板反应孔中的样品完全干燥。在每个反应孔中加入200μ封闭液，置于密封直可保湿的器中，25恒温孵育30min。D.2.3洗板
将反应孔中的液体例l，用洗涤液加满每个反应孔，静置1in～2min后，将洗涤液倾出，重复洗涤2次。洗板完成后将酶联板倒置十1净吸水纸上，吸干反成孔中的水分。D.3结合抗体
D.3.1加抗体
每孔加人100ul.用抗体稀释液按市售产品要求进行稀释的抗体，置于保湿容器中，25℃孵育1h。I.3.2洗板
参照I.2.3洗板方法进行。
D.4结合酶标抗体
D.4.1加酶标抗体
每孔加人100L接照使用说明-$要求稀释的酶标抗体。孵育方法同D.3.1。D.4.2洗板
参照D.2.3洗板方法进行。
D.5显色
每孔加人100μL底物溶液，25℃避光孵育30min～60min至阳性对照显色。终止反应
显色后在每孔中加人50μI.终正液。D.7测定
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用酶标仪在405nm波长下测结果，读取各孔溶液的光密度值（（D值），记录结果。9
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E.1制样
样品制备方法见 D. 1。
E.2PCR检测方法
E.2.1PCR引物
附录E
【资料性附录】
水稻细菌性条斑病菌 PCK检验程序上游物（XF）：5ATATTGGGCTGGTGGGTGATC-3、下游引物（Xo0cR）：5°TTGGTACGCGATGCCCTTTGCGACGG-3'；扩增产物为338bp。E2.2PCR反应体系
见表 E.1.
反虚组成
10X PCR huffr
25mmMgl
25 mm dNTP
20mg/ml.牛血清（蛋（LS4)
1%Tween 20
Primer(20 pm)
5 U/μI. Tau DNA 案个酶
模板DNA
E.2.3PCR反应条件
94℃5min,91℃30s.62℃30s,72℃1min(35个循环）：72℃10minE.3电泳
体积，ul.
坂PCR扩增产物5uL与样品缓冲液1uI.混合均句，用1%的琼脂糖凝胶电泳（80V1h)后，浪化乙锭（EB)染色(20min~30min)，在凝胶成像系统中观察，记录观察结果（图E.1)。M
样品，
他样品：
图E.1引物XnocF/Xoo:RPCR扩增产物电泳图
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