NY/T 2289-2012
基本信息
标准号： NY/T 2289-2012
中文名称：小麦矮腥黑穗病菌检疫检测与鉴定方法
标准类别：农业行业标准(NY)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准简介
NY/T 2289-2012 小麦矮腥黑穗病菌检疫检测与鉴定方法
NY/T2289-2012
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标准内容
ICS65.020
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 2289-2012
小麦矮腥黑穗病菌检疫检测与鉴定方法Detection and identification of Tilletia controversa Kihn2012-12-24发布
2013-03-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准按照（GB/T1.1给山的规则起草。本标准由农业部种植业管理司提出。本标准巾全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)归口。本标雅起草单位：全国农业技术推广服务中心、四川省植物检疫站、重庆大学NY/T2289—2012
本标准主要起草人：王福祥、刘可、主中康、宁红、熊红利、殷幼平、刘慧、李滞楠、万佳。1
1范围
小麦矮腥黑穗病菌检疫检测与鉴定方法NY/T 2289--2012
本标准规定T农业植物检疫中小麦矮腺黑穗病菌（TiletiuconroersaKhn，FcK）样品采集，样品处理、实验形态学、实时荧光PCR检验及结果判定和除害处理的技术方法本标准适用于小麦种子、籽粒及产品、生长期植株小麦矮腥黑穗病菌的检疫检测和鉴定。2规范性引用文件
下列义件对于本文件的应用悬必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用下本文件。凡是不注日期的引用文件，其坂新版本（包括所有的修改单)适用十本件。GI7412小左种子产地检疫规程Www.bzxZ.net
GB15569农业植物调运检疫规程
GB/T18035.植物检疫小麦矮化腥熙穗病菌检疫鉴定方法3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
小麦矮腰暴穗病Dwarf bunt disease由小表矮握黑穗病菌（TilletiarontroxrsaKihn，TCK)引起的麦类真菌病害，特征表现为罹病植林矮化，病穗麦粒变为病原菌冬孢子构成的菌瘦，不能食用，导致严重的产量损失并影响小麦加工产品品质。
网脊高度值：Reticulum height指喔黑穗病菌冬孢了外胞壁向外突起的垂直高度，在光学尿微镜下表现为冬孢子外胞壁的刺状或齿状突起的垂直高度。
实时荧光定蛋PCRQ-PCR
也叫实时荧光聚合酶链式反应。悬一种能在体外微量扩增的特殊DNA片段.在扩增过程中由于荧光物质的释放而实时快速、灵嫩地检出模板INA存在的方法，3.4
Q-PCR 阅值Threshuld of Q-PCRPC'R反应实时荧光独度超过背景荧光强度的值或检测值。3.5
Q- PCR Ct 值 Cycle threshold value of Q- PCR实时荧光PCR反放检测样品的荧光信号达到设定阅值时所经历的循环数，3.6
典型的扩增曲线Typical amplitication curve一个典型的扩增曲线由三个阶段组成：荧光行景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。指数扩增阶段FCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系。NY/T 228920 12
荧光染料SYBRGreenI
非特异性结合双链IVA的一种荧光染料，其荧光信号随着dsDNA扩增产物的增加而增强。4原理
小麦矮醒黑穗病菌（TilletiacomtroruersaKuhn，TCK），屁扣子菌门Basidiomycota，冬孢菌纲Teliomyccrcs:黑粉菌Vstilaginales.胆黑粉菌科Tilletiaceae.腺黑粉菌属Titetia。病菌主要对小麦，大麦、黑麦等禾本科18属的农作物和杂草形成系统侵染，被侵染作物结实时形成菌，病菌以冬孢附着在种子外表或泥人粪爬、土囊中越夏·随着受害种子，土襄和肥料的远距离运输而传播：也可以菌瘦形式混杂于种了中，远距离传播。小麦矮腿熙穗病菌的冬抱子形态，Q-PCR反应结果是本标准快速鉴定该病原菌的依据。
4.1冬孢子形态
小麦矮腺黑穗病菌冬孢子早球形、椭网形或不规则形，具网状饰纹和无色到淡位的胶质梢，直径（含胶质鞘）为16.80um~~32.19um,通常为1sum~24gm冬孢子网脊高度值是小麦矮黑穗病菌和其近似种小去网黑穗病菌(TitletiαcαiresTul.，TCT)冬孢子最审要的区别特征,前者的网脊高度值为1,43μn0.14utm,后者为0,53un0.lum，冬孢子白发荧光和萌发生理试验也可以作为进一步鉴定的依据。
本标准采用QPCR炭光染料法进行检测，利用病菌特有DVA序列设计引物，在PCR扩增时加人荧光染料，炭光染料结合dsDVA扩增物而发出荧光，内荧光检测器实时检测。由于初始模板量的不同.反应管内的荧光物质达到设定的可检测阐值时所经历的Ct值不问，因此在模板定虽的情况下，CL值可以川于判定检测样品的初始菌量：实现定量(检测，5试剂与材料
除特别说明以外，本标准所所样品制备试剂均为分析纯。5.1冬孢子形态检验试剂
吐温-20(Twecn-20),乙鞍钾(CH,CO0K).H油(C,H;O,)、Z.醇(C2H,OH).柠檬酸(CHO)蒸馏水（H.)、磷酸氢二钠（VaHPO）5.2Q-PCR检验试剂
凝粉酶(Anylase)、液氮（）、磷酸盐缓冲波、冬孢了裂解液，DNA释放剂,DNA提取液、TE缓冲液、LNA洗涤液,SYBR Q-PCR反应混合液等,Q-PCR检验试剂配制方法参见附录 A。6仪器及用具
6.1冬孢子形态检验仪器及用具
微镜，测徽尺、低离心机、高压灭菌器、天平和可谢微量加样器。6.2Q-1CR检测仪器及用具
Q-PCR检测仪、高速台式冷冻离心机（离心力16000\以上)、带规冰箱（冷藏室1℃和冷冻室一20℃）微量可调移液器（10μl1001000ul)及配套带滤芯吸头，7样品采样及处理
7.1小麦种子或小麦籽粒、产品
7.1.在小麦种子调运检疫过程中,按照GB 15569的要求取样送实验室检验，2
7.1.2点接取小麦籽粒、产品及麦麸、加工下脚料等送实验空检验。7.1.3发现的菌爆吉接送实验室检验，7.2小麦植株
NY/T 2289—2012
小麦生长期.按GB7412的要求实施检疫，从田问采集可病株，送实验室检验·保证植株样品新鲜。
8实验室检验
8.1冬孢子形态检验
形态学检验不适用于小麦植株生长期矮喱黑穗病检验，已形成菌瘘的植株除外。冬孢了形态检验方法参见附录3.
8.2冬孢子自发荧光显微学检验
发现菌瘦时适H冬孢子自发爽光显微学鉴定方法。该方法不川于小麦植株牛长期矮醒熙穗病检验：已形成菌瘦的植株除外，冬孢子自发炭光显微学鉴定方法按GB/T18085的要求进行：8.3各孢子萌发生理学检验
当发现菌燃，但形态学和白发炭光显微学均不能止确鉴定时，可选择进行冬拖子萌发生理学鉴定方法进行检测。冬孢了萌发牛理学鉴定法按（3/下18085的要求进行：8.4Q-PCR检测
Q-PCR检测适丁小友植株，友粒、友麸或下脚料巾冬孢子的小麦矮腥黑穗病轮测，Q-PCR检测方法参见附录A。
9结果判定和报告
9.1冬孢子形态检验
小麦矮喔黑穗病菌冬挝子形态特征参见附录10个～30个成熟冬孢子的网脊高度平均值大或等丁1.43um时，确定为小麦理黑穗病菌；平均值小十或等于0.70pm时，不是小麦矮腥黑秘病菌平均值为0.71 μm~1.42m时,可来用冬孢子白发荧光品微学鉴定方法、冬孢子萌发生理学鉴定方法和Q-PCR检测作进一步鉴定，
9.2冬孢子自发荧光显微学鉴定方法冬孢子白发荧光显微学鉴定方法结果判定标准按GB/T18085的要求逆行。9.3冬孢子萌发生理学鉴定方法
冬孢子萌发生埋学鉴定方法结果判定标雅按GB/T{8085的要求进行9. 4 Q-PCR 检验
9.4.1有效性判定
阴性对照无Ct值并且元扩增曲线；阻性对照C1值28.0，并出现典型的S型扩增曲线：检测视为有效，否则元效
9.4.2结果判定
在检测有效的拍提下，测试样品无值和护增曲线，结果为阴性.即样品中无小麦矮腥黑穗病菌。测试样品Ct值35.出现典型的S型扩增曲线，结果为性.即样品带有小麦矮腥黑穗病菌。测试样品CI值为3540.将样品模板浓度加倍.再次进行实时炭光PCR检验；再次扩增片样品Ct值35，且出现典型的上升护增曲线，结果为阳性.即样品带有小麦矮握黑穗病菌；再次扩增后样品Ct值为35～10，结果为阴性，即释品中九小麦矮腥黑穗病菌，9.5结果报告
将实验室检验鉴定结果填人植物有害生物样本鉴定报告（见附录1))3
NY/T2289—2012
除害处理
检验过程中使用的有关材料和用具，在使用完毕后须参照相关规程进行消毒和除害处理；经检疫鉴定后的样品，应在样品适宜的条件下保存三个月。保存期满后，需进行灭活处理。A.1Q-PCR试剂及配制方法
A. 1.1 A液
附录A
(资料性附录)
Q-PCR检测方法
NY/T22892012
0.2 mol/L磷酸氢钠水溶液,取 NiII,P0·I.() 27. 6 品,加蒸馏水溶解,定容至 1 C(00 ml-。A.1.2B液
.2mol/L磷酸氢钠水溶液，取NaH[)：7H（)53.6g，也可用NaHP0,·121I.071.6g或Na.HP0,·2H.035.6 g.加蒸馏水溶解.定容至 1000 mL。A.1.3磷酸盐缓冲液(PBS)
A 液 I4 mI.-加 B液 36 ml 混勺:pHI7. 2 。A.1.4冬孢子裂解液
3 mol/L NaOH,取NaOH 6.0 g溶丁 450 ml.水中,加水定容至500 ml-A.1.5DNA释放剂
含有 2%CTAB,100 rnmol/L Tris-HCl,20 nmol/L EDTA,l.4 mmol/L NaCl.pH8. 0, 使用前加人终浓度0.5%的β-筑垫乙醇，
A.1.6DNA提取液
Tris饱和酚：氯仿:异成醇按25：241：1比例混合，A.1.7TE缓冲液
C. 1 mol/L Tris HCl (pH 7.4) 20 ml 加人 0.5 mol/L ELTA(pH 8. 0)/0 ml,,用超纯水定容至200 mL，4℃保存。
A.1.8DNA洗涤液
75为乙醇溶液，—20℃预冷。
A.1.9SYBRQ-PCR反应混合液(SYRGreenRealtimePCRMastermix)含 NTPs,Mg！,热启动 DNA 聚合酶,PCR 缀冲液,SYBR Green 1染料等,使用按市售产品要求进行，
A.2样品 DNA制备
A.2. 1麦粒、麦麸或下脚料中冬孢子 DNA 提取A.2. 1. 1自测有无菌痰
有齿瘦直接栋出,取菌瘦1/4粒捣碎加人灭菌的1.5 mI.离心管,加适量淀粉酶处理,离心去掉J:清液。加人灭菌的1.5mL离心管.每管加人600pl.冬孢了裂解液，65℃水浴30 min;取出离心管，1mol/LHCl中和，8000g离心1min：收集沉淀，用无菌水冲洗至pII为7~8。A.2.1.2未发现菌瘾的样品
过网月为40几、80尺、200[1的分样变简：收集200日样品备用。取过筛样品0.5·按B.2.1.1处理。
A.2.1.3冬孢子DNA提取
NY/T2289—2012
将沉淀（冬孢子)小心转置于载玻片上，取另一载玻片与其滑动摩擦碾压破碎冬孢子外擎，每隔段时间在显微镜下检查冬孢了至绝人多数孢子外壁破碎：加人10OI.DNA提取液于玻片上-将液体吸起转移到-支新离心管中，川400l.1NA提液分次清洗玻片，转移清洗液于上述离心管中，65℃水浴lh：将离心管11000g离心10min,吸取上清液加人微滤柱中100c)g离心1min，弃滤过液；向离心微滤杜中加人预冷的DVA洗涤液750，10000g离心！min，弃滤过液；发一次，将微滤柱10000g离心1min.除去残余乙醇：向微滤杜中加入50ul.TE缓冲液，10000g离心1min洗脱DVA，收集洗脱液、即为PR检测的待测模板NA：A.2.2小麦植株组织中菌丝体TNA提取取待检小麦植物组织样品1.！g剪碎丁灭菌预冻的研殊中加液氮充分研磨·加19mLPBS液混句4&000g离心15min;取沉淀转人1.5mI.离心管中，离心管中加人400l.1VA释放剂,65℃水浴保温1h：其间每需10min剧烈振荡混勺一次：加人等休积的DNA提取滋，10(:00g离心20min.取上层水相至微滤杜中（如有机相与水相间界面不清晰：可川I入A提取液再抽提一次），1：:(0）g离心1min,弃滤液:向微滤柱中加入预冷的D>A清洗液758μl，i0008 g离心1min，弃滤液重复清洗一次将微滤柱10000g离心1mim.除去残余乙醇：向微滤柱中册人50μlTF缓冲液，10000g离心1min.收集滤液.即为PCR检测的待测模板TDNA。A. 2. 3阳性对照和阴性对照 DNA 制备制备样品DXA时.同时使相应材料和法制备阳性对照DXA和阴性对照DNA。A.2.4模板DNA的保存
提取的模板IDN4最好在24h内使用：在1℃：条件下保存应不超过一周，在一20℃冻存不起过3Cd，避免反复冻融。
A.3检测方法
A.3.1特异性引物对
川无菌超纯水配制25,MTCK特异引物刘7CK-U和!TCK-［.母液:引物序列为:CQUTCKf一5' AGTGCTGAGGCCGAAAAGGI - 3',CQUITCKT -5'- TTCTGGGTCA CGA CGTAT - 3',所扩增的TCK特异性片段人小为200bp，A.3.2反应体系
PCR反应体积为25μI其中包括1XPCR荧光染料±混台反应液（含dNTF,Mg！热启动DNA聚台酶、缓冲液、dNTPS.SYBR Grec11染料）,0,4μmul/L引物对、CQUTCKI/CQUTCKr.同时设阳性对照和阴性对照。加样究成后，3 0只瞬时离心A.3.3扩增程序
Q-PCR仪扩增程序为:95℃1min:94℃15s,61℃:30s.72℃30 s,共10个循环.在每个循环的延伸阶段72℃附采集荧光10s;72℃..7min：不同Q-PcR仪扩增程序参数可能稍有变化A.3.4熔解曲线分析
熔解曲线的程序为：95%1min:55？，1min:从55:开始每升高0.5℃保持10s.连续升高80次到$5℃止，
B.1制样
B. 1. 1一般样品
附录B
（资料性附录）
冬孢子形态检验方法
NY/T 2289—2012
称取样品50倒人经干热火菌的250mL一角瓶内-加蒸水100mL和表而活性剂吐温一201滴~~2滴。将一角瓶封11店放在征复式震荡器上震荡洗涤5min。取下三角瓶,将洗涤悬浮液注人经干热火菌的10ml~20mL.刻度离心管内，1000r/min离心3min取出离心管，倾去上清液.再将三角瓶内测余洗涤态浮液加人刻离心管·混合离心，直至所有洗涤悬浮液离心完毕，留沉淀物：在沉淀物中加人1 ml.~3 ml.席尔氏浮载剂使之浮。B.1.2腥黑粉菌菌瘦样品
刮取少许冬孢子粉加适鼠席尔氏浮裁剂使之悬浮B.1.3席尔氏浮载剂配制
称取6g乙酸铆溶于300mL麦克凡氏缓冲液中，加H洲l120ml和乙醇180ml.混麦克凡氏缓冲液：配制0.1M的柠檬峻溶液。称取19.21柠檬酸溶上500ml.蒸馏水中,加蒸馏水至1 000 ml-。配制0.2M的磷酸氢_钠溶液，称取28.10g磷酸氢二钠济于500mI.蒸馏水中,加蒸馏水至 1 000 ml.。取 0.1 M的柠檬酸溶液 5. 5 ml. 和 0.2 M 的磷酸氢二钠溶液 191. 5 ml. 混合-得 pH为8的麦克凡氏缓冲液。
B.2 制片
用微量加样器吸取5u20l.沉淀物悬浮液惑孢下慰浮液至载玻片上.加盖玻片，以悬浮液不外溢为宜。
B.3镜检和测量
每份样品的沉淀物悬浮液至少镜检5张玻片，每片按视野依次全部检查。如发现可疑小麦矮腿黑穗病菌冬孢子（参见附录C）.在油镜（100×）下随机测量10个~30个成熟冬孢于的网咨高度值：如冬孢子数量不足，增加检查玻片数量·直至所有沉淀物悬浮液川毕。计算平均网脊高度值，NY/T2289—2012
C.1小麦矮腥黑穗菌菌瘦特征
附录C
（资料性附录）
小麦矮腥黑穗病菌形态特征
茵瘘有明显腥味，一般情况下呈黄褐或黑褐色，近圆而硬，不易压碎。菌瘦形状，大小差别很大，大似豌豆、小如米粒。
C.2冬孢子形态鉴定
TCK冬孢子直径16um25um，平均19.9um，外边为多边形的网状纹饰，偶见脑纹状：孢子网脊高度为0.8um~1.8m，平均1.43um，网日大小为3~5m，胶质鞘明显，无色至淡色的透明，常略廷伸至或超过网脊顶端.其厚度达1.5um～5am，有时胶质鞘不明显，见图C.1。不孕细胞球形.透明.胞壁光滑，大小为10um~18m，平均13.7μm.偶有胶质壳包围。冬抱子在4℃～5℃，散射光照条件下，置于2%的水琼脂上，三周后开始萌发。萌发时形成先菌丝，顶端产生担孢子数8～66个，见图C2。图C.1矮腥TCK冬孢子表面形态（400×），图中比例尺代表10um
图C.2矮腥TCK的冬孢子萌发（200×）图中比例尺代表40μm
【规范性附录】
植物有害生物样本鉴定报告
植物有害生物样木鉴定报告见丧I.1。表 D.1植物有害生物样本鉴定报告植物名称
植物土台期
样品米源
送捡单位
检测鉴定方法
检测鉴定结果：
备注：
鉴定人（签名）：
审核人签名)：
样品数量
送检期
鉴定单位盖章：
注：本单·式三份-检测单位、受检单位和检疫机构各一份。品种名称
取样部位
送检人
联系电话
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中华人民共和国农业行业标准
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小麦矮腥黑穗病菌检疫检测与鉴定方法Detection and identification of Tilletia controversa Kihn2012-12-24发布
2013-03-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准按照（GB/T1.1给山的规则起草。本标准由农业部种植业管理司提出。本标准巾全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)归口。本标雅起草单位：全国农业技术推广服务中心、四川省植物检疫站、重庆大学NY/T2289—2012
本标准主要起草人：王福祥、刘可、主中康、宁红、熊红利、殷幼平、刘慧、李滞楠、万佳。1
1范围
小麦矮腥黑穗病菌检疫检测与鉴定方法NY/T 2289--2012
本标准规定T农业植物检疫中小麦矮腺黑穗病菌（TiletiuconroersaKhn，FcK）样品采集，样品处理、实验形态学、实时荧光PCR检验及结果判定和除害处理的技术方法本标准适用于小麦种子、籽粒及产品、生长期植株小麦矮腥黑穗病菌的检疫检测和鉴定。2规范性引用文件
下列义件对于本文件的应用悬必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用下本文件。凡是不注日期的引用文件，其坂新版本（包括所有的修改单)适用十本件。GI7412小左种子产地检疫规程Www.bzxZ.net
GB15569农业植物调运检疫规程
GB/T18035.植物检疫小麦矮化腥熙穗病菌检疫鉴定方法3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
小麦矮腰暴穗病Dwarf bunt disease由小表矮握黑穗病菌（TilletiarontroxrsaKihn，TCK)引起的麦类真菌病害，特征表现为罹病植林矮化，病穗麦粒变为病原菌冬孢子构成的菌瘦，不能食用，导致严重的产量损失并影响小麦加工产品品质。
网脊高度值：Reticulum height指喔黑穗病菌冬孢了外胞壁向外突起的垂直高度，在光学尿微镜下表现为冬孢子外胞壁的刺状或齿状突起的垂直高度。
实时荧光定蛋PCRQ-PCR
也叫实时荧光聚合酶链式反应。悬一种能在体外微量扩增的特殊DNA片段.在扩增过程中由于荧光物质的释放而实时快速、灵嫩地检出模板INA存在的方法，3.4
Q-PCR 阅值Threshuld of Q-PCRPC'R反应实时荧光独度超过背景荧光强度的值或检测值。3.5
Q- PCR Ct 值 Cycle threshold value of Q- PCR实时荧光PCR反放检测样品的荧光信号达到设定阅值时所经历的循环数，3.6
典型的扩增曲线Typical amplitication curve一个典型的扩增曲线由三个阶段组成：荧光行景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。指数扩增阶段FCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系。NY/T 228920 12
荧光染料SYBRGreenI
非特异性结合双链IVA的一种荧光染料，其荧光信号随着dsDNA扩增产物的增加而增强。4原理
小麦矮醒黑穗病菌（TilletiacomtroruersaKuhn，TCK），屁扣子菌门Basidiomycota，冬孢菌纲Teliomyccrcs:黑粉菌Vstilaginales.胆黑粉菌科Tilletiaceae.腺黑粉菌属Titetia。病菌主要对小麦，大麦、黑麦等禾本科18属的农作物和杂草形成系统侵染，被侵染作物结实时形成菌，病菌以冬孢附着在种子外表或泥人粪爬、土囊中越夏·随着受害种子，土襄和肥料的远距离运输而传播：也可以菌瘦形式混杂于种了中，远距离传播。小麦矮腿熙穗病菌的冬抱子形态，Q-PCR反应结果是本标准快速鉴定该病原菌的依据。
4.1冬孢子形态
小麦矮腺黑穗病菌冬孢子早球形、椭网形或不规则形，具网状饰纹和无色到淡位的胶质梢，直径（含胶质鞘）为16.80um~~32.19um,通常为1sum~24gm冬孢子网脊高度值是小麦矮黑穗病菌和其近似种小去网黑穗病菌(TitletiαcαiresTul.，TCT)冬孢子最审要的区别特征,前者的网脊高度值为1,43μn0.14utm,后者为0,53un0.lum，冬孢子白发荧光和萌发生理试验也可以作为进一步鉴定的依据。
本标准采用QPCR炭光染料法进行检测，利用病菌特有DVA序列设计引物，在PCR扩增时加人荧光染料，炭光染料结合dsDVA扩增物而发出荧光，内荧光检测器实时检测。由于初始模板量的不同.反应管内的荧光物质达到设定的可检测阐值时所经历的Ct值不问，因此在模板定虽的情况下，CL值可以川于判定检测样品的初始菌量：实现定量(检测，5试剂与材料
除特别说明以外，本标准所所样品制备试剂均为分析纯。5.1冬孢子形态检验试剂
吐温-20(Twecn-20),乙鞍钾(CH,CO0K).H油(C,H;O,)、Z.醇(C2H,OH).柠檬酸(CHO)蒸馏水（H.)、磷酸氢二钠（VaHPO）5.2Q-PCR检验试剂
凝粉酶(Anylase)、液氮（）、磷酸盐缓冲波、冬孢了裂解液，DNA释放剂,DNA提取液、TE缓冲液、LNA洗涤液,SYBR Q-PCR反应混合液等,Q-PCR检验试剂配制方法参见附录 A。6仪器及用具
6.1冬孢子形态检验仪器及用具
微镜，测徽尺、低离心机、高压灭菌器、天平和可谢微量加样器。6.2Q-1CR检测仪器及用具
Q-PCR检测仪、高速台式冷冻离心机（离心力16000\以上)、带规冰箱（冷藏室1℃和冷冻室一20℃）微量可调移液器（10μl1001000ul)及配套带滤芯吸头，7样品采样及处理
7.1小麦种子或小麦籽粒、产品
7.1.在小麦种子调运检疫过程中,按照GB 15569的要求取样送实验室检验，2
7.1.2点接取小麦籽粒、产品及麦麸、加工下脚料等送实验空检验。7.1.3发现的菌爆吉接送实验室检验，7.2小麦植株
NY/T 2289—2012
小麦生长期.按GB7412的要求实施检疫，从田问采集可病株，送实验室检验·保证植株样品新鲜。
8实验室检验
8.1冬孢子形态检验
形态学检验不适用于小麦植株生长期矮喱黑穗病检验，已形成菌瘘的植株除外。冬孢了形态检验方法参见附录3.
8.2冬孢子自发荧光显微学检验
发现菌瘦时适H冬孢子自发爽光显微学鉴定方法。该方法不川于小麦植株牛长期矮醒熙穗病检验：已形成菌瘦的植株除外，冬孢子自发炭光显微学鉴定方法按GB/T18085的要求进行：8.3各孢子萌发生理学检验
当发现菌燃，但形态学和白发炭光显微学均不能止确鉴定时，可选择进行冬拖子萌发生理学鉴定方法进行检测。冬孢了萌发牛理学鉴定法按（3/下18085的要求进行：8.4Q-PCR检测
Q-PCR检测适丁小友植株，友粒、友麸或下脚料巾冬孢子的小麦矮腥黑穗病轮测，Q-PCR检测方法参见附录A。
9结果判定和报告
9.1冬孢子形态检验
小麦矮喔黑穗病菌冬挝子形态特征参见附录10个～30个成熟冬孢子的网脊高度平均值大或等丁1.43um时，确定为小麦理黑穗病菌；平均值小十或等于0.70pm时，不是小麦矮腥黑秘病菌平均值为0.71 μm~1.42m时,可来用冬孢子白发荧光品微学鉴定方法、冬孢子萌发生理学鉴定方法和Q-PCR检测作进一步鉴定，
9.2冬孢子自发荧光显微学鉴定方法冬孢子白发荧光显微学鉴定方法结果判定标准按GB/T18085的要求逆行。9.3冬孢子萌发生理学鉴定方法
冬孢子萌发生埋学鉴定方法结果判定标雅按GB/T{8085的要求进行9. 4 Q-PCR 检验
9.4.1有效性判定
阴性对照无Ct值并且元扩增曲线；阻性对照C1值28.0，并出现典型的S型扩增曲线：检测视为有效，否则元效
9.4.2结果判定
在检测有效的拍提下，测试样品无值和护增曲线，结果为阴性.即样品中无小麦矮腥黑穗病菌。测试样品Ct值35.出现典型的S型扩增曲线，结果为性.即样品带有小麦矮腥黑穗病菌。测试样品CI值为3540.将样品模板浓度加倍.再次进行实时炭光PCR检验；再次扩增片样品Ct值35，且出现典型的上升护增曲线，结果为阳性.即样品带有小麦矮握黑穗病菌；再次扩增后样品Ct值为35～10，结果为阴性，即释品中九小麦矮腥黑穗病菌，9.5结果报告
将实验室检验鉴定结果填人植物有害生物样本鉴定报告（见附录1))3
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除害处理
检验过程中使用的有关材料和用具，在使用完毕后须参照相关规程进行消毒和除害处理；经检疫鉴定后的样品，应在样品适宜的条件下保存三个月。保存期满后，需进行灭活处理。A.1Q-PCR试剂及配制方法
A. 1.1 A液
附录A
(资料性附录)
Q-PCR检测方法
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0.2 mol/L磷酸氢钠水溶液,取 NiII,P0·I.() 27. 6 品,加蒸馏水溶解,定容至 1 C(00 ml-。A.1.2B液
.2mol/L磷酸氢钠水溶液，取NaH[)：7H（)53.6g，也可用NaHP0,·121I.071.6g或Na.HP0,·2H.035.6 g.加蒸馏水溶解.定容至 1000 mL。A.1.3磷酸盐缓冲液(PBS)
A 液 I4 mI.-加 B液 36 ml 混勺:pHI7. 2 。A.1.4冬孢子裂解液
3 mol/L NaOH,取NaOH 6.0 g溶丁 450 ml.水中,加水定容至500 ml-A.1.5DNA释放剂
含有 2%CTAB,100 rnmol/L Tris-HCl,20 nmol/L EDTA,l.4 mmol/L NaCl.pH8. 0, 使用前加人终浓度0.5%的β-筑垫乙醇，
A.1.6DNA提取液
Tris饱和酚：氯仿:异成醇按25：241：1比例混合，A.1.7TE缓冲液
C. 1 mol/L Tris HCl (pH 7.4) 20 ml 加人 0.5 mol/L ELTA(pH 8. 0)/0 ml,,用超纯水定容至200 mL，4℃保存。
A.1.8DNA洗涤液
75为乙醇溶液，—20℃预冷。
A.1.9SYBRQ-PCR反应混合液(SYRGreenRealtimePCRMastermix)含 NTPs,Mg！,热启动 DNA 聚合酶,PCR 缀冲液,SYBR Green 1染料等,使用按市售产品要求进行，
A.2样品 DNA制备
A.2. 1麦粒、麦麸或下脚料中冬孢子 DNA 提取A.2. 1. 1自测有无菌痰
有齿瘦直接栋出,取菌瘦1/4粒捣碎加人灭菌的1.5 mI.离心管,加适量淀粉酶处理,离心去掉J:清液。加人灭菌的1.5mL离心管.每管加人600pl.冬孢了裂解液，65℃水浴30 min;取出离心管，1mol/LHCl中和，8000g离心1min：收集沉淀，用无菌水冲洗至pII为7~8。A.2.1.2未发现菌瘾的样品
过网月为40几、80尺、200[1的分样变简：收集200日样品备用。取过筛样品0.5·按B.2.1.1处理。
A.2.1.3冬孢子DNA提取
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将沉淀（冬孢子)小心转置于载玻片上，取另一载玻片与其滑动摩擦碾压破碎冬孢子外擎，每隔段时间在显微镜下检查冬孢了至绝人多数孢子外壁破碎：加人10OI.DNA提取液于玻片上-将液体吸起转移到-支新离心管中，川400l.1NA提液分次清洗玻片，转移清洗液于上述离心管中，65℃水浴lh：将离心管11000g离心10min,吸取上清液加人微滤柱中100c)g离心1min，弃滤过液；向离心微滤杜中加人预冷的DVA洗涤液750，10000g离心！min，弃滤过液；发一次，将微滤柱10000g离心1min.除去残余乙醇：向微滤杜中加入50ul.TE缓冲液，10000g离心1min洗脱DVA，收集洗脱液、即为PR检测的待测模板NA：A.2.2小麦植株组织中菌丝体TNA提取取待检小麦植物组织样品1.！g剪碎丁灭菌预冻的研殊中加液氮充分研磨·加19mLPBS液混句4&000g离心15min;取沉淀转人1.5mI.离心管中，离心管中加人400l.1VA释放剂,65℃水浴保温1h：其间每需10min剧烈振荡混勺一次：加人等休积的DNA提取滋，10(:00g离心20min.取上层水相至微滤杜中（如有机相与水相间界面不清晰：可川I入A提取液再抽提一次），1：:(0）g离心1min,弃滤液:向微滤柱中加入预冷的D>A清洗液758μl，i0008 g离心1min，弃滤液重复清洗一次将微滤柱10000g离心1mim.除去残余乙醇：向微滤柱中册人50μlTF缓冲液，10000g离心1min.收集滤液.即为PCR检测的待测模板TDNA。A. 2. 3阳性对照和阴性对照 DNA 制备制备样品DXA时.同时使相应材料和法制备阳性对照DXA和阴性对照DNA。A.2.4模板DNA的保存
提取的模板IDN4最好在24h内使用：在1℃：条件下保存应不超过一周，在一20℃冻存不起过3Cd，避免反复冻融。
A.3检测方法
A.3.1特异性引物对
川无菌超纯水配制25,MTCK特异引物刘7CK-U和!TCK-［.母液:引物序列为:CQUTCKf一5' AGTGCTGAGGCCGAAAAGGI - 3',CQUITCKT -5'- TTCTGGGTCA CGA CGTAT - 3',所扩增的TCK特异性片段人小为200bp，A.3.2反应体系
PCR反应体积为25μI其中包括1XPCR荧光染料±混台反应液（含dNTF,Mg！热启动DNA聚台酶、缓冲液、dNTPS.SYBR Grec11染料）,0,4μmul/L引物对、CQUTCKI/CQUTCKr.同时设阳性对照和阴性对照。加样究成后，3 0只瞬时离心A.3.3扩增程序
Q-PCR仪扩增程序为:95℃1min:94℃15s,61℃:30s.72℃30 s,共10个循环.在每个循环的延伸阶段72℃附采集荧光10s;72℃..7min：不同Q-PcR仪扩增程序参数可能稍有变化A.3.4熔解曲线分析
熔解曲线的程序为：95%1min:55？，1min:从55:开始每升高0.5℃保持10s.连续升高80次到$5℃止，
B.1制样
B. 1. 1一般样品
附录B
（资料性附录）
冬孢子形态检验方法
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称取样品50倒人经干热火菌的250mL一角瓶内-加蒸水100mL和表而活性剂吐温一201滴~~2滴。将一角瓶封11店放在征复式震荡器上震荡洗涤5min。取下三角瓶,将洗涤悬浮液注人经干热火菌的10ml~20mL.刻度离心管内，1000r/min离心3min取出离心管，倾去上清液.再将三角瓶内测余洗涤态浮液加人刻离心管·混合离心，直至所有洗涤悬浮液离心完毕，留沉淀物：在沉淀物中加人1 ml.~3 ml.席尔氏浮载剂使之浮。B.1.2腥黑粉菌菌瘦样品
刮取少许冬孢子粉加适鼠席尔氏浮裁剂使之悬浮B.1.3席尔氏浮载剂配制
称取6g乙酸铆溶于300mL麦克凡氏缓冲液中，加H洲l120ml和乙醇180ml.混麦克凡氏缓冲液：配制0.1M的柠檬峻溶液。称取19.21柠檬酸溶上500ml.蒸馏水中,加蒸馏水至1 000 ml-。配制0.2M的磷酸氢_钠溶液，称取28.10g磷酸氢二钠济于500mI.蒸馏水中,加蒸馏水至 1 000 ml.。取 0.1 M的柠檬酸溶液 5. 5 ml. 和 0.2 M 的磷酸氢二钠溶液 191. 5 ml. 混合-得 pH为8的麦克凡氏缓冲液。
B.2 制片
用微量加样器吸取5u20l.沉淀物悬浮液惑孢下慰浮液至载玻片上.加盖玻片，以悬浮液不外溢为宜。
B.3镜检和测量
每份样品的沉淀物悬浮液至少镜检5张玻片，每片按视野依次全部检查。如发现可疑小麦矮腿黑穗病菌冬孢子（参见附录C）.在油镜（100×）下随机测量10个~30个成熟冬孢于的网咨高度值：如冬孢子数量不足，增加检查玻片数量·直至所有沉淀物悬浮液川毕。计算平均网脊高度值，NY/T2289—2012
C.1小麦矮腥黑穗菌菌瘦特征
附录C
（资料性附录）
小麦矮腥黑穗病菌形态特征
茵瘘有明显腥味，一般情况下呈黄褐或黑褐色，近圆而硬，不易压碎。菌瘦形状，大小差别很大，大似豌豆、小如米粒。
C.2冬孢子形态鉴定
TCK冬孢子直径16um25um，平均19.9um，外边为多边形的网状纹饰，偶见脑纹状：孢子网脊高度为0.8um~1.8m，平均1.43um，网日大小为3~5m，胶质鞘明显，无色至淡色的透明，常略廷伸至或超过网脊顶端.其厚度达1.5um～5am，有时胶质鞘不明显，见图C.1。不孕细胞球形.透明.胞壁光滑，大小为10um~18m，平均13.7μm.偶有胶质壳包围。冬抱子在4℃～5℃，散射光照条件下，置于2%的水琼脂上，三周后开始萌发。萌发时形成先菌丝，顶端产生担孢子数8～66个，见图C2。图C.1矮腥TCK冬孢子表面形态（400×），图中比例尺代表10um
图C.2矮腥TCK的冬孢子萌发（200×）图中比例尺代表40μm
【规范性附录】
植物有害生物样本鉴定报告
植物有害生物样木鉴定报告见丧I.1。表 D.1植物有害生物样本鉴定报告植物名称
植物土台期
样品米源
送捡单位
检测鉴定方法
检测鉴定结果：
备注：
鉴定人（签名）：
审核人签名)：
样品数量
送检期
鉴定单位盖章：
注：本单·式三份-检测单位、受检单位和检疫机构各一份。品种名称
取样部位
送检人
联系电话
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