NY/T 2292-2012
基本信息
标准号： NY/T 2292-2012
中文名称：亚洲梨火疫病监测技术规范
标准类别：农业行业标准(NY)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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出版信息
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标准简介
NY/T 2292-2012 亚洲梨火疫病监测技术规范
NY/T2292-2012
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标准内容
ICS 65.020.01
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 2292-2012
亚洲梨火疫病监测技术规范
Guidelines for quarantine surveillance ofErwinia pyrifoliae Kim et al.2012-12-24发布
中华人民共和国农业部
2013-03-01实施
本标准按照GB/T1.1给出的规则起草。本标准巾农业部种植业管理司提，本标准出全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)归Ⅱ。NY/T 2292—2012
本标准起草单位：全国农业技术推广服务中心、浙汇省植物保扩检疫局，浙江大学本标准主要起草人：冯晓东、许志刚、林云彪、李红叶、胡白石、楼兵·于、王荣洲范围
亚洲梨火疫病监测技术规范
NY/T 2292—2012
本标准规定「农业植物检疫中业洲梨火疫病的监测区域、监测吋期、监测力法等，本标准适用于全国范用内亚洲梨火疫病的监测。2原理
2.1分类地位
亚洲梨火疫病菌FrreriniapyrifoiaeKimrtal.属丁肠杆菌科Entorobaeteriaceat，欧文氏菌属Frnia。病原菌呈短杆状，周生鞭毛，兼性好氧，不形成芽孢，不合成氧化郸，不还原硝酸盐。28℃在YPDA培养基仁牛长24 h~48 h后,可形成2mm的形的色菌落,菌落凸起不透明]：该病菌主要为害亚洲梨(Pvruspfolia），出其危害引起的亚洲梨火疫病为亚洲梨树t的再要检疫性病害，2.2监测原理wwW.bzxz.Net
亚洲架火疫病的出间症状、生理生化反应、致病性测试和PCR反应特征等是监测，检测与鉴定的重要依据
3仪器设备
显微镜、培养箱、搓床、高压火菌器、微量移液器、PCR仪、凝胶成像仪、离心机、电泳槽和电泳仪等。4药品和培养基
4.1药品
牛肉授旁,蛋弥，酵母提段物.蔗糖和琼脂等。所有试剂均为分析纯。4.2培养基
4.2.1NA培养基
牛肉浸膏 3%,蛋白陈5 -酵舟提取物 1 号,蔗糖 10 g.琼脂 15 g,蒸馅水定容歪 000 ml,pIT调至7.0-~7.2,121火菌20 min.
4.2.2YPDA培养基
酵母提取物 5 g:白陈 10 g,葡萄糖 10 ,琼脂粉 20 g,蒸馏水定窄至1 000 mL,121℃火菌 20 min。5疫情监测
5.1监测植物
梨、苹果、棠梁、山楂等蔷薇科植物，土要监测亚洲梨5.2监测区域
重点监测疫情发生高风险区域，如亚洲梨集中种植区，境外引种繁基地、集散地及周围其他寄主作物种植仅
5.3监测时期
裂树升花期开始到果实膨大中期结束。5.4监测方法
5.4.1访问调查
NY/T2292—2012
向当地植保员、农技员、果衣等相关人员询间调查当地梨，苹果、黑莓等业洲梨火疫病寄主植物种植和疯也害发情况，特别是苗木来源果园有无业洲梨火疫病疑似症状（参见附录A)及其发生地点、发生时间、危害情况等伴息·分析是否行在可疑发生区，5.4.2踏查
对访问调查过程中发现的可疑发生区和其他有代表性的梨、苹果，黑莓等种植用块进行踏查，观察田间有无亚洲架火疫病发病症状（参览附录A），必时可采用系统监测定点调查。查发现可疑病制症状立即进行称记，对疑似病株先照相后取样.样品送机关实验室逊行诊断鉴定。5.4.3定点监测
选择有代表性的用块进行定点调食，在监测时期每15寸调查一次。采用5点取样法，每个点随机调查10株,统计病株率，同时随机选5株疑似发病植株（不足5株则全选.每株分东南西4个方位各调查2个嫩梢,共调查8个嫩梢,计算病梢率，并做好记录。6疫情鉴定
6.1田间鉴定
主要检查嫩梢、花、果和枝干。与亚洲梨火疫病的典型症状进行比较，并注意与真菌性枯枝、小靠出蚝心危害、蝉害枯梢等病虫害进行区分（参见附录A），符合典型症状的可判定为亚洲梨火疫病如发现疑似症状，可采用实验室鉴定方法进行进-一步鉴定。6.2实验室鉴定·
从现场采回的样品要求进行实验室鉴定，首先是镜检看有无喷菌现象，如有喷菌现象应作进一步的分离培养，按种试验或PCR检测鉴定（参见附录B）：ICR鉴定电泳结果，阳性对照在476.hP处有条带阳现，月阴性对照无条出现的前提下，待测样品在467bp处有条带出现的，判定为亚洲裂火疫病，6.3鉴定报告
将实验室检验鉴定结果填人&植物有害生物样本鉴定报告》（见附录（)。7监测报告
监测结果记人亚测梨火疫病间调食监测记录表》（见附录D)，植物检疫机构对监测结果进行整理总形成监测报告
8样品与菌株的保荐
样品应保存2个月，发现亚洲梨火疫病的伴品应保存不少于6个刀，保存期满后，需经灭菌处埋分离并鉴定为亚洲染火疫病菌的菌株可采用适当的方式长期保存A.1亚洲梨火疫病典型症状
A.1.1花簇枯死
附录A
（资料性附录）
亚洲梨火疫病典型症状与易混病虫害症状NY/T2292-—2012
病菌最先侵染花器产生水渍状斑，花器不久萎焉变黑枯死。病菌沿发病花器的花梗向下扩展至果枝，再扩展至花簇中的其他花朵或幼果，以及叶柄和叶脉，直至整张叶片，最后整个花簇枯死发黑。在潮湿条件下.花梗、果柄和叶柄等组织上有菌脓渗出（见图A.1)。图A.1亚洲梨火疫病为害花簇
（图片引自http://old.padilgov.au/pbt/index.php?q-node/2o&-pbtID=114）A.1.2枯梢和枯枝
病菌侵染当年生新梢.以春梢为主，侵人点最初表现为表皮变黑，病斑向上下扩展迅速，很快引起校梢萎枯死，呈“拐杖状”，枯叶不脱落。枝梢枯菱发展根快，条件适宜时，儿天内即可扩展达15cm~30cm以上，造成整枝死亡。病枝通常变黑·潮湿时·枝条，叶柄出现菌脓。有时病害仅局限在簇芽或新梢，在簇芽或新梢与二年生枝梢交界处形成溃疡斑：有时病菌沿着新梢向下扩展，直至骨干枝，引起整个骨干枝的枯死
A.1.3溃疡斑
病菌沿着花簇或新梢向下扩展到上一级的枝梢和枝干，当遇到不适条件时病斑停止扩展，树皮坏死干缩，下陷，而形成层继续生长，引起病健交界处出现裂痕·形成大小不一的溃疡斑。溃疡斑环死部位通常不深，仅限于皮层。这些溃疡斑可成为病菌的越冬场所，第二年，春暖花开时，病菌开始繁殖，通过风、雨昆虫等介体传播，号起新的侵染。病菌也可直接侵染校于，发病后形成类似的溃疡斑A. 2易混病虫害症状
A.2.1真菌性枯枝
常见的有拟茎点霉属（Phomopsissp.）真菌引起的干枯病。病害发展较慢，棕褐色或深褐色，无菌脓，但病部后期可见黑色、半埋生的小黑点（病菌分生孢子器）。这些小黑点多在枯梢病枯死的溃疡斑上3
NY/T 2292—2012
形成，
4.2.2小虫蛙心危害
可引起簇芽和新梢发黑萎為。发病的簇芽基部常伴有泡沫状物，侣无菌脓.轻轻-一拉菱蕉簇芽极易脱落，仃细观察可发现梢内部被蛇空，有虫体或伴有虫粪，而亚洲梨火疫病新梢和簇芽枯死后发黑，于拉叶片、幼果和嫩梢均不易脱落A.2.3蝉害枯梢
夏秋率调查耐常觅·在枯梢下部枝条上有明显的蝉产卵痕。4
R.1喷菌现象
附录B
【资料性附录】
亚洲梨火疫病实验室监定
NY/T 2292—2012
用灭菌了切取病健交界处小坎新鲜病纽织薄片，以变色的叶片中脉为最佳，平放在载玻片上，加蒸馅水一滴、盖上盖玻片并驱除气泡后立即放在低倍镜下现察。注意光线要弱，并除净病织周的气泡，可见切口处有大量细菌成烟筹状从病丝织中溢出B.2分离培养
用75为酒精棉球擦洗新鲜病组织进行表而消毒，晾，用火菌刀片取1块~2块大约0.5n×0.5cm病枝梢的皮层组织，或0.5cm叶柄或花（果）柄置-FC.5mlL的儿菌水中.静止30min后，囊荡摇勾，-一环病纽织慰浮液在NA培养基表面划线，置于28℃培养，24h所即川分离看到病原细菌菌落，如在电镜下观察：细菌为短杆状，鞭毛数根周生。B.3幼果接种试验
取幼果（直径大约3cm~-5cm）洗净晾丁，用灭萌刀片横切果实，置垫有火菌滤纸的培养血上（加少量的无菌水）。取火菌牙签从培养24h-35h的菌落上蘸取少量的细菌刺伤接种到幼果的果肉组织，一个横切而接种3个~~4个点。接种后，置25℃保湿，诱导发病和菌脓形成。大约2.1h后，接种点上即可见高度隆起的乳门色菌脓，最后组织变褐坏死，但不发臭，清水对照没有明显变化，如接种软腐病菌喇软腐发臭。
B.4PCR鉴定
B.4.1DNA模板制备方法
B.4.1.1直接使用病组织浸出液做PCR模板，B.4.1.2病组织没山液经固体或液体培养基预培养，开取泥合菌液做PCR模板。B.4.1.3提取病组织样品总DNA作PCR模板B.4.1.4经分离培养，取纯化的培养菌稀释液作PCR模板。B.4.2PCR检测引物
亚洲梨火疫病的特导性引物见表B.1。表B.1检测亚洲裂火疫病的引物
引物名称
Hrec Fl
Hre- Ri
B.4.3PCR体系
引物序列
S:GACGSTTGCAUIGGAAAXX-3
5'-CCGGTAGGTAATCAAGGCCAC - ST扩增片段大小(bp)
在PCR管中加人10×PCR缓冲液2.5LMgC2（25mM）1.5L、dNTP(2.5mM)1l上游引物（20M)0.25下游引物（20μM)C.25T酶5/0.25。反应总体系为25加人相应浓度的DNA模板之后，剩余体积用无菌超纯水补足。5
NY/T2292--2012
PCR检测程序
见表 13.2。
物名称
FIrC -FI/HrC- K1
PCR电泳结果
说明：
亚洲梨火疫病菌PCR检测程序
01T:5:92%30 62% 30 $,72℃3:30个循环:72℃ 5 m145
78910111213[4151617 18192021 2223tirainiu pnjafine:
2然—其他参试用株；
一对生对照
利用HrcC-F1/HreC-R1引物进行 PCR检测结果图.
附泉C
(规范性附录】
植物有害生物样本鉴定报告
植物有害生物样本鉴定报告见表C.1。表C.1植物有害生物样本鉴定报告样品缩号
梳物生育期
样品来源
送检单位
尬测整定方法：
检测鉴定结果：
备注：
鉴定人（签名》：
审核人（签名）：
植物名称
样品数
送检口期
鉴定单位盖章：
品种名称
最样部位
送检人
联系电话
注：本单一式三份.检测单位、受检单位和检疫机构各一份月
NY/T 2292--2012
NY/T2292—2012
附录D
（规范性附录）
亚洲梨火疫病田间调查监测记录表亚洲梨火疫病用间调查监测记录见表L.1表I).1亚洲梨火疫病田间调查监测记录表调查单位：
作物品种
谢存点
调株数
疑以症状表现株数
谢查耐间：
监测（按测结剂
调查人(然字)：
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中华人民共和国农业行业标准
NY/T 2292-2012
亚洲梨火疫病监测技术规范
Guidelines for quarantine surveillance ofErwinia pyrifoliae Kim et al.2012-12-24发布
中华人民共和国农业部
2013-03-01实施
本标准按照GB/T1.1给出的规则起草。本标准巾农业部种植业管理司提，本标准出全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)归Ⅱ。NY/T 2292—2012
本标准起草单位：全国农业技术推广服务中心、浙汇省植物保扩检疫局，浙江大学本标准主要起草人：冯晓东、许志刚、林云彪、李红叶、胡白石、楼兵·于、王荣洲范围
亚洲梨火疫病监测技术规范
NY/T 2292—2012
本标准规定「农业植物检疫中业洲梨火疫病的监测区域、监测吋期、监测力法等，本标准适用于全国范用内亚洲梨火疫病的监测。2原理
2.1分类地位
亚洲梨火疫病菌FrreriniapyrifoiaeKimrtal.属丁肠杆菌科Entorobaeteriaceat，欧文氏菌属Frnia。病原菌呈短杆状，周生鞭毛，兼性好氧，不形成芽孢，不合成氧化郸，不还原硝酸盐。28℃在YPDA培养基仁牛长24 h~48 h后,可形成2mm的形的色菌落,菌落凸起不透明]：该病菌主要为害亚洲梨(Pvruspfolia），出其危害引起的亚洲梨火疫病为亚洲梨树t的再要检疫性病害，2.2监测原理wwW.bzxz.Net
亚洲架火疫病的出间症状、生理生化反应、致病性测试和PCR反应特征等是监测，检测与鉴定的重要依据
3仪器设备
显微镜、培养箱、搓床、高压火菌器、微量移液器、PCR仪、凝胶成像仪、离心机、电泳槽和电泳仪等。4药品和培养基
4.1药品
牛肉授旁,蛋弥，酵母提段物.蔗糖和琼脂等。所有试剂均为分析纯。4.2培养基
4.2.1NA培养基
牛肉浸膏 3%,蛋白陈5 -酵舟提取物 1 号,蔗糖 10 g.琼脂 15 g,蒸馅水定容歪 000 ml,pIT调至7.0-~7.2,121火菌20 min.
4.2.2YPDA培养基
酵母提取物 5 g:白陈 10 g,葡萄糖 10 ,琼脂粉 20 g,蒸馏水定窄至1 000 mL,121℃火菌 20 min。5疫情监测
5.1监测植物
梨、苹果、棠梁、山楂等蔷薇科植物，土要监测亚洲梨5.2监测区域
重点监测疫情发生高风险区域，如亚洲梨集中种植区，境外引种繁基地、集散地及周围其他寄主作物种植仅
5.3监测时期
裂树升花期开始到果实膨大中期结束。5.4监测方法
5.4.1访问调查
NY/T2292—2012
向当地植保员、农技员、果衣等相关人员询间调查当地梨，苹果、黑莓等业洲梨火疫病寄主植物种植和疯也害发情况，特别是苗木来源果园有无业洲梨火疫病疑似症状（参见附录A)及其发生地点、发生时间、危害情况等伴息·分析是否行在可疑发生区，5.4.2踏查
对访问调查过程中发现的可疑发生区和其他有代表性的梨、苹果，黑莓等种植用块进行踏查，观察田间有无亚洲架火疫病发病症状（参览附录A），必时可采用系统监测定点调查。查发现可疑病制症状立即进行称记，对疑似病株先照相后取样.样品送机关实验室逊行诊断鉴定。5.4.3定点监测
选择有代表性的用块进行定点调食，在监测时期每15寸调查一次。采用5点取样法，每个点随机调查10株,统计病株率，同时随机选5株疑似发病植株（不足5株则全选.每株分东南西4个方位各调查2个嫩梢,共调查8个嫩梢,计算病梢率，并做好记录。6疫情鉴定
6.1田间鉴定
主要检查嫩梢、花、果和枝干。与亚洲梨火疫病的典型症状进行比较，并注意与真菌性枯枝、小靠出蚝心危害、蝉害枯梢等病虫害进行区分（参见附录A），符合典型症状的可判定为亚洲梨火疫病如发现疑似症状，可采用实验室鉴定方法进行进-一步鉴定。6.2实验室鉴定·
从现场采回的样品要求进行实验室鉴定，首先是镜检看有无喷菌现象，如有喷菌现象应作进一步的分离培养，按种试验或PCR检测鉴定（参见附录B）：ICR鉴定电泳结果，阳性对照在476.hP处有条带阳现，月阴性对照无条出现的前提下，待测样品在467bp处有条带出现的，判定为亚洲裂火疫病，6.3鉴定报告
将实验室检验鉴定结果填人&植物有害生物样本鉴定报告》（见附录（)。7监测报告
监测结果记人亚测梨火疫病间调食监测记录表》（见附录D)，植物检疫机构对监测结果进行整理总形成监测报告
8样品与菌株的保荐
样品应保存2个月，发现亚洲梨火疫病的伴品应保存不少于6个刀，保存期满后，需经灭菌处埋分离并鉴定为亚洲染火疫病菌的菌株可采用适当的方式长期保存A.1亚洲梨火疫病典型症状
A.1.1花簇枯死
附录A
（资料性附录）
亚洲梨火疫病典型症状与易混病虫害症状NY/T2292-—2012
病菌最先侵染花器产生水渍状斑，花器不久萎焉变黑枯死。病菌沿发病花器的花梗向下扩展至果枝，再扩展至花簇中的其他花朵或幼果，以及叶柄和叶脉，直至整张叶片，最后整个花簇枯死发黑。在潮湿条件下.花梗、果柄和叶柄等组织上有菌脓渗出（见图A.1)。图A.1亚洲梨火疫病为害花簇
（图片引自http://old.padilgov.au/pbt/index.php?q-node/2o&-pbtID=114）A.1.2枯梢和枯枝
病菌侵染当年生新梢.以春梢为主，侵人点最初表现为表皮变黑，病斑向上下扩展迅速，很快引起校梢萎枯死，呈“拐杖状”，枯叶不脱落。枝梢枯菱发展根快，条件适宜时，儿天内即可扩展达15cm~30cm以上，造成整枝死亡。病枝通常变黑·潮湿时·枝条，叶柄出现菌脓。有时病害仅局限在簇芽或新梢，在簇芽或新梢与二年生枝梢交界处形成溃疡斑：有时病菌沿着新梢向下扩展，直至骨干枝，引起整个骨干枝的枯死
A.1.3溃疡斑
病菌沿着花簇或新梢向下扩展到上一级的枝梢和枝干，当遇到不适条件时病斑停止扩展，树皮坏死干缩，下陷，而形成层继续生长，引起病健交界处出现裂痕·形成大小不一的溃疡斑。溃疡斑环死部位通常不深，仅限于皮层。这些溃疡斑可成为病菌的越冬场所，第二年，春暖花开时，病菌开始繁殖，通过风、雨昆虫等介体传播，号起新的侵染。病菌也可直接侵染校于，发病后形成类似的溃疡斑A. 2易混病虫害症状
A.2.1真菌性枯枝
常见的有拟茎点霉属（Phomopsissp.）真菌引起的干枯病。病害发展较慢，棕褐色或深褐色，无菌脓，但病部后期可见黑色、半埋生的小黑点（病菌分生孢子器）。这些小黑点多在枯梢病枯死的溃疡斑上3
NY/T 2292—2012
形成，
4.2.2小虫蛙心危害
可引起簇芽和新梢发黑萎為。发病的簇芽基部常伴有泡沫状物，侣无菌脓.轻轻-一拉菱蕉簇芽极易脱落，仃细观察可发现梢内部被蛇空，有虫体或伴有虫粪，而亚洲梨火疫病新梢和簇芽枯死后发黑，于拉叶片、幼果和嫩梢均不易脱落A.2.3蝉害枯梢
夏秋率调查耐常觅·在枯梢下部枝条上有明显的蝉产卵痕。4
R.1喷菌现象
附录B
【资料性附录】
亚洲梨火疫病实验室监定
NY/T 2292—2012
用灭菌了切取病健交界处小坎新鲜病纽织薄片，以变色的叶片中脉为最佳，平放在载玻片上，加蒸馅水一滴、盖上盖玻片并驱除气泡后立即放在低倍镜下现察。注意光线要弱，并除净病织周的气泡，可见切口处有大量细菌成烟筹状从病丝织中溢出B.2分离培养
用75为酒精棉球擦洗新鲜病组织进行表而消毒，晾，用火菌刀片取1块~2块大约0.5n×0.5cm病枝梢的皮层组织，或0.5cm叶柄或花（果）柄置-FC.5mlL的儿菌水中.静止30min后，囊荡摇勾，-一环病纽织慰浮液在NA培养基表面划线，置于28℃培养，24h所即川分离看到病原细菌菌落，如在电镜下观察：细菌为短杆状，鞭毛数根周生。B.3幼果接种试验
取幼果（直径大约3cm~-5cm）洗净晾丁，用灭萌刀片横切果实，置垫有火菌滤纸的培养血上（加少量的无菌水）。取火菌牙签从培养24h-35h的菌落上蘸取少量的细菌刺伤接种到幼果的果肉组织，一个横切而接种3个~~4个点。接种后，置25℃保湿，诱导发病和菌脓形成。大约2.1h后，接种点上即可见高度隆起的乳门色菌脓，最后组织变褐坏死，但不发臭，清水对照没有明显变化，如接种软腐病菌喇软腐发臭。
B.4PCR鉴定
B.4.1DNA模板制备方法
B.4.1.1直接使用病组织浸出液做PCR模板，B.4.1.2病组织没山液经固体或液体培养基预培养，开取泥合菌液做PCR模板。B.4.1.3提取病组织样品总DNA作PCR模板B.4.1.4经分离培养，取纯化的培养菌稀释液作PCR模板。B.4.2PCR检测引物
亚洲梨火疫病的特导性引物见表B.1。表B.1检测亚洲裂火疫病的引物
引物名称
Hrec Fl
Hre- Ri
B.4.3PCR体系
引物序列
S:GACGSTTGCAUIGGAAAXX-3
5'-CCGGTAGGTAATCAAGGCCAC - ST扩增片段大小(bp)
在PCR管中加人10×PCR缓冲液2.5LMgC2（25mM）1.5L、dNTP(2.5mM)1l上游引物（20M)0.25下游引物（20μM)C.25T酶5/0.25。反应总体系为25加人相应浓度的DNA模板之后，剩余体积用无菌超纯水补足。5
NY/T2292--2012
PCR检测程序
见表 13.2。
物名称
FIrC -FI/HrC- K1
PCR电泳结果
说明：
亚洲梨火疫病菌PCR检测程序
01T:5:92%30 62% 30 $,72℃3:30个循环:72℃ 5 m145
78910111213[4151617 18192021 2223tirainiu pnjafine:
2然—其他参试用株；
一对生对照
利用HrcC-F1/HreC-R1引物进行 PCR检测结果图.
附泉C
(规范性附录】
植物有害生物样本鉴定报告
植物有害生物样本鉴定报告见表C.1。表C.1植物有害生物样本鉴定报告样品缩号
梳物生育期
样品来源
送检单位
尬测整定方法：
检测鉴定结果：
备注：
鉴定人（签名》：
审核人（签名）：
植物名称
样品数
送检口期
鉴定单位盖章：
品种名称
最样部位
送检人
联系电话
注：本单一式三份.检测单位、受检单位和检疫机构各一份月
NY/T 2292--2012
NY/T2292—2012
附录D
（规范性附录）
亚洲梨火疫病田间调查监测记录表亚洲梨火疫病用间调查监测记录见表L.1表I).1亚洲梨火疫病田间调查监测记录表调查单位：
作物品种
谢存点
调株数
疑以症状表现株数
谢查耐间：
监测（按测结剂
调查人(然字)：
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