NY/T 2309-2013
基本信息
标准号： NY/T 2309-2013
中文名称：黄曲霉毒素单克隆抗体活性鉴定技术规程
标准类别：农业行业标准(NY)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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相关标签： 黄曲霉 毒素 单克隆 抗体 活性 鉴定 技术规程
标准分类号
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标准简介
NY/T 2309-2013 黄曲霉毒素单克隆抗体活性鉴定技术规程
NY/T2309-2013
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标准内容
ICS65.020
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 2309—2013
黄曲霉毒素单克隆抗体活性
鉴定技术规程
Technical rules for activity identification of monoclonalantibodies against aflatoxins2013-05-20发布
2013-08-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由农业部种植业管理司提出并归。NY/T2309—2013
木标准起草单位：中国农业科学院油料作物研究所、农业部油料及制品质本监督检验测试中心。本标推主要起草人李培武、李冉、」小霞、周游燕、张奇，I
1范围
黄曲霉毒素单克隆抗体活性鉴定技术规程本标准规定了黄曲莓毒素单克抗体的活性鉴定方法。本标准适用于黄曲霉毒素单克隆抗体的活性鉴定。2规范性引用文件
NY/T2309—2013
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注期的引用文件，仅注口期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用义件，其最新版本（包括所有的修改单)适用丁本文件。GB/T6582分析实验室用水规格和试验方法3试剂
除作另有说明，均使用分析纯试剂和GB/T6682规定的级水。3.1碳酸钠(NazC()）：分析纯
3.2碳酸氢钠(NaHCO3）:分析纯。3.3十二水合磷酸氢二钠(Na:HPO,12Hz0):分析纯。3.4磷酸氮钾(KII,P())分析纯。3.5氯化钠(NaCI)：分析纯。
3.6氯化钾(KCI)分析纯。
3.7柠檬酸(CH.0·H20)：分析纯。3.8过氧化氢尿素[VII)·Hz(:分析纯3.9黄曲霉毒素完个抗原：纯度≥98%，3.10卵清白蛋白（Ovalbumin，COVA）。3.113.3\,5,5-四中基联苯胺（3,3\5.5'-Tetrarnethylbcnzidine，TMB)3.12甲醇(CHOH)：分析纯
3.13无水乙醇(CH,CH:OH)：分析纯，3.14吐温20(Tween·20)。
3.15羊抗鼠IgG辣根过氧化物酶标二抗、3.16黄曲霉毒素标准品（黄曲霉毒素B、黄曲霉毒素B、黄州霉毒素G1、黄曲每素G黄曲霉毒素M-即 AFB、AFBAFG1.AFG2AFM):纯度99%3.17黄曲霉毒素标准储备液：准确称取黄曲霉毒索B，，黄曲霖寿素B、黄曲需毒素G，、黄l爺毒素G和黄曲霉毒素M标准样品.用甲醇(3.12)配制成0.100mg/mL的储备液。3.18黄曲霉毒素标准工作液：准确移取黄曲霖毒素B，、黄曲毒素3、黄曲盘毒素G1、黄曲霉毒素G2和黄曲霉毒素M,标推储备液，用甲醇稀释成T作液（浓度均为：0.0ng/mL、0.1g/mL、1/ml10 ng/ ml.和 [(0 ng/ ml)。
3.19磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)：称取2. 9gNaaIPO),·12II.O,0.2gKIHPO4、8.0gNaI和.2gK(l溶于纯水并定容至1I.超纯水中，调pII至7.4。3.20磷酸盐吐温缓冲液(PBST缓冲液)：称取 2.9gNazIIP,-12II:0、(.2gKH,PO、8.(gNaC1Www.bzxZ.net
NY/T2309—2013
和 0. 2 g KCI,加水并窄至 1 1.,调 pT至7. 4.最后再加人 0. 5 mL叶温-20年。3.21包被缓冲液：称取1.59gNzCO,和2.93gNaH(X),加水定容至1L3.22封闭液：称取1.5g卵清白蛋H(OVA)游于100mLP13ST缓冲液巾。3.23底物
3.23.1底物缓冲液：称取1.84gNHP0)4·12T120和0.93gCH,·H：0加水定窄至100ml.3.23.2底物A储存液：准确称取0.10I3.3°.5.5-四甲基联苯胺（TMB），定容至50mL.无水乙醇中，1“避光保存，
3.23.3底物13储存液：取3g过氧化氢豚.加水定容至100ml4“℃避光保存。3.23.4底物显色液：吸取9.元ml.底物缓冲液（3.23.1).底物A储存液（3.23.2)0.5ml，底物B储存液（3.23.3)32u，混.现配现用。3.24终正液：2mol/LHSO
4仪器设备
4.1酶标仪。
4.2天平：感量0.0001g
4.3酶标板：96孔。
4.4恒温培养箱。
5方法原理
采用间接竞争酶联免疫吸附测定方法(EL.1SA)方法对黄曲需毒素抗休与不同黄抽霉毒素的交叉反应率.以反应率表示抗体识别黄曲毒素的特异性：通过闻接非竞争EI.ISA方法对不间浓度抗原、抗休的结合强度过行检测，通过计算得到黄曲需毒素单克隧抗体亲和力。6活性测定(以黄曲霉毒素 M1 为例)6.1方法
6. 1. 1抗体特异性测定
6.1.1.1包被抗原和待检单克隆抗体工作浓度确定6.1.1.1.1包被：用包被缓冲液（3.21）配制抗原AFM-RSA溶液浓度到0.5ug/1nl.、0.25ug/ml.、0.125g/mL0.0625双g/ml，各浓度横向包被海标板，每孔加入100l.每个浓度2个重复，置温箱中37℃包被2h；
6.1.1.1.2过闭：磷酸盐功温缓冲液（3.20）2501.洗板3次，每孔期1人150封闭液（3.22），置恒温箱中37℃孵45min-磷酸盐叫温缓冲液（3.20)250L洗板3次：6.1.1.1.3抗原抗体反应：用磷酸盐缓冲液（3.19)配置待检单克隆抗体溶液创1mg/ml.按体积比1：5000、1：10C00、1：15000、1：20000)、1：30000逆行遥级稀释后配制成系抗体溶液.纵向每孔加人100μ1.每个浓度2个重复.置温箱中37℃孵育0.5.磷酸盐吐温级冲液250μL洗板3次；6.1.1.1.4酶标二抗反应：用磷酸缓冲液将羊抗鼠gG辣根过氧化物酶标二抗（3.15)稀释10000倍，孔加人100uL，置温箱中37℃孵育45min，磷酸盐吐温缓冲液250ul洗板5次：6.1.1.1.5显色：加底物显色液（3.23.4）.每孔加入100μl.置恒温箱中37℃作用15min；6.1.1.1.6终止显色：每孔加人501.终止液（3.24)6.1.1.1.7读数，加人终止液后10min内酶标仪测定O)150值：6.1.1.1.8工作浓度确定：选择0D2m值最接近1.0的包被抗原浓度及抗体浓度作为抗休特异性测2
定实验工作浓度。
6.1.1.2交叉反应测定
NY/T 2309—2013
6.1.1.2.1包被：用包被缓冲液（3.21)将包被原AFM,-T3SA按6.1.1.1.8中确定的抗原工作浓度：加入到96孔酶标板内，每孔100ul..臀恒温箱中37℃包被2h.磷酸盐吐温级冲液（.3.20）250，洗板3次；
6.1.1.2.2封闭：孔加人150ul.封闭液（3.22），置恒温箱中37℃孵育4.5mim.磷酸盐叶温缓冲液（3.20)250uL洗板3次；
6.1.1.2.3抗原抗体反应：分别移取50uL不同浓度的各种黄曲霉毒索标准工作液（3.18）与工作浓度抗体溶液（按6.1.1.1.8中确定的抗体工作浓度)50L混合，加入酶标板孔中，每个试验孔2个重复.置恒温箱中37℃孵育60I1ir1.同时设阴性对照孔（对照孔以磷酸盐缓冲液代替抗原工作液），磷酸盐叶温缓冲液(3.20)250μL洗板8次；
6.1.1.2.4酶标二抗反应：用磷酸盐缓冲液将抗鼠1gG辣根过鼠化物酶标二抗（.3.15）稀释10:000倍，每孔加入100山，置恒温箱中37℃孵育45min，磷酸盐叶温缓冲液（3.2C)250L洗板5次；6.1.1.2.5显：加底物显色液（3.23.4）.每孔加人100，置恒温箱中37℃作用15min；6.1.1.2.6终止显色：每孔加人50正终止液（3.24)；6.1.1.2.7读数：加人后10min内酶标仪测定OD)ao值。6.1.2抗体亲和力测定
6.1.2.1包被：包被原6.1.2.3抗原抗体反应：将单克降抗体用磷酸盐缓冲液（3.19)从101g/mL开始1：2梯度稀释.每孔加人100±1，置37℃温箱中孵育0.5h，每个浓度2个重复，磷盐叫温缓冲液（3.20)250L洗板3次；6.1.2.4酶标二抗反应：用磷酸盐缓冲液将羊抗鼠g辣根过氧化物酶标二抗(3.15)稀释10000倍，每孔加人100μl，置恒温箱中37℃孵育45min，磷酸盐吐温缓冲液（3.20)250μl.洗板5次；6.1.2.5显色：加底物显色液（3.23.4），每孔加人100L，置恒温箱t37℃作用15i1；6.1.2.6终止显色：每孔加人50uI.终止液（3.24）；6.1.2.7读数：加人后1011in内酶标仪测定（L.值。6.2结果计算
6.2.1抗体特异性结果计算：用酶标仪测定（)D):u值，以黄曲毒毒素浓度的对数值为横坐标、以抑制T分率（各浓度标准竞争抑制抗原孔（)D值与不加标准品孔（I）值的百分比）为纵坐标绘制标准曲线，以各曲线50%抑制百分率的质量浓度IC%计算交叉反应率，交义反应率越小，抗体特异性越高。按式(1)计算。
S:×1c0
式中：
S.—交叉反应率，单位为白分率(%)；y——AFM的IC值，
2——AFM以外黄曲舞毒素的IC.心值。.(1)
6.2.2抗体亲和力结果计算：以抗体浓度（1e1/L)的对数值为横坐标，以其对应的吸光度为纵坐标，叫在一个坐标系内作出4条S形Ⅲ线：设定S曲线的顶部为（Dx。在曲线中分别找出1条带线各白3
NY/T 2309—2013
5C%0D对应的抗体浓度。将4个浓度两两组根据式（2)计算单抗的亲和常数Ka（单位：1/mol)亲和常数越人.抗休亲和力越高
2Xn×(c
式中：
一单抗的亲和常数，单位为升每摩尔（1./mol)；一每组中两个抗原包被浓度的倍数；分别为每组中两个50%(D)m对应的抗体浓度.单位为摩尔每升（mo1/L)。测定结果取其两次测定的算术平均值，计算结果保留至小数点后位。2]
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中华人民共和国农业行业标准
NY/T 2309—2013
黄曲霉毒素单克隆抗体活性
鉴定技术规程
Technical rules for activity identification of monoclonalantibodies against aflatoxins2013-05-20发布
2013-08-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由农业部种植业管理司提出并归。NY/T2309—2013
木标准起草单位：中国农业科学院油料作物研究所、农业部油料及制品质本监督检验测试中心。本标推主要起草人李培武、李冉、」小霞、周游燕、张奇，I
1范围
黄曲霉毒素单克隆抗体活性鉴定技术规程本标准规定了黄曲莓毒素单克抗体的活性鉴定方法。本标准适用于黄曲霉毒素单克隆抗体的活性鉴定。2规范性引用文件
NY/T2309—2013
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注期的引用文件，仅注口期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用义件，其最新版本（包括所有的修改单)适用丁本文件。GB/T6582分析实验室用水规格和试验方法3试剂
除作另有说明，均使用分析纯试剂和GB/T6682规定的级水。3.1碳酸钠(NazC()）：分析纯
3.2碳酸氢钠(NaHCO3）:分析纯。3.3十二水合磷酸氢二钠(Na:HPO,12Hz0):分析纯。3.4磷酸氮钾(KII,P())分析纯。3.5氯化钠(NaCI)：分析纯。
3.6氯化钾(KCI)分析纯。
3.7柠檬酸(CH.0·H20)：分析纯。3.8过氧化氢尿素[VII)·Hz(:分析纯3.9黄曲霉毒素完个抗原：纯度≥98%，3.10卵清白蛋白（Ovalbumin，COVA）。3.113.3\,5,5-四中基联苯胺（3,3\5.5'-Tetrarnethylbcnzidine，TMB)3.12甲醇(CHOH)：分析纯
3.13无水乙醇(CH,CH:OH)：分析纯，3.14吐温20(Tween·20)。
3.15羊抗鼠IgG辣根过氧化物酶标二抗、3.16黄曲霉毒素标准品（黄曲霉毒素B、黄曲霉毒素B、黄州霉毒素G1、黄曲每素G黄曲霉毒素M-即 AFB、AFBAFG1.AFG2AFM):纯度99%3.17黄曲霉毒素标准储备液：准确称取黄曲霉毒索B，，黄曲霖寿素B、黄曲需毒素G，、黄l爺毒素G和黄曲霉毒素M标准样品.用甲醇(3.12)配制成0.100mg/mL的储备液。3.18黄曲霉毒素标准工作液：准确移取黄曲霖毒素B，、黄曲毒素3、黄曲盘毒素G1、黄曲霉毒素G2和黄曲霉毒素M,标推储备液，用甲醇稀释成T作液（浓度均为：0.0ng/mL、0.1g/mL、1/ml10 ng/ ml.和 [(0 ng/ ml)。
3.19磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)：称取2. 9gNaaIPO),·12II.O,0.2gKIHPO4、8.0gNaI和.2gK(l溶于纯水并定容至1I.超纯水中，调pII至7.4。3.20磷酸盐吐温缓冲液(PBST缓冲液)：称取 2.9gNazIIP,-12II:0、(.2gKH,PO、8.(gNaC1Www.bzxZ.net
NY/T2309—2013
和 0. 2 g KCI,加水并窄至 1 1.,调 pT至7. 4.最后再加人 0. 5 mL叶温-20年。3.21包被缓冲液：称取1.59gNzCO,和2.93gNaH(X),加水定容至1L3.22封闭液：称取1.5g卵清白蛋H(OVA)游于100mLP13ST缓冲液巾。3.23底物
3.23.1底物缓冲液：称取1.84gNHP0)4·12T120和0.93gCH,·H：0加水定窄至100ml.3.23.2底物A储存液：准确称取0.10I3.3°.5.5-四甲基联苯胺（TMB），定容至50mL.无水乙醇中，1“避光保存，
3.23.3底物13储存液：取3g过氧化氢豚.加水定容至100ml4“℃避光保存。3.23.4底物显色液：吸取9.元ml.底物缓冲液（3.23.1).底物A储存液（3.23.2)0.5ml，底物B储存液（3.23.3)32u，混.现配现用。3.24终正液：2mol/LHSO
4仪器设备
4.1酶标仪。
4.2天平：感量0.0001g
4.3酶标板：96孔。
4.4恒温培养箱。
5方法原理
采用间接竞争酶联免疫吸附测定方法(EL.1SA)方法对黄曲需毒素抗休与不同黄抽霉毒素的交叉反应率.以反应率表示抗体识别黄曲毒素的特异性：通过闻接非竞争EI.ISA方法对不间浓度抗原、抗休的结合强度过行检测，通过计算得到黄曲需毒素单克隧抗体亲和力。6活性测定(以黄曲霉毒素 M1 为例)6.1方法
6. 1. 1抗体特异性测定
6.1.1.1包被抗原和待检单克隆抗体工作浓度确定6.1.1.1.1包被：用包被缓冲液（3.21）配制抗原AFM-RSA溶液浓度到0.5ug/1nl.、0.25ug/ml.、0.125g/mL0.0625双g/ml，各浓度横向包被海标板，每孔加入100l.每个浓度2个重复，置温箱中37℃包被2h；
6.1.1.1.2过闭：磷酸盐功温缓冲液（3.20）2501.洗板3次，每孔期1人150封闭液（3.22），置恒温箱中37℃孵45min-磷酸盐叫温缓冲液（3.20)250L洗板3次：6.1.1.1.3抗原抗体反应：用磷酸盐缓冲液（3.19)配置待检单克隆抗体溶液创1mg/ml.按体积比1：5000、1：10C00、1：15000、1：20000)、1：30000逆行遥级稀释后配制成系抗体溶液.纵向每孔加人100μ1.每个浓度2个重复.置温箱中37℃孵育0.5.磷酸盐吐温级冲液250μL洗板3次；6.1.1.1.4酶标二抗反应：用磷酸缓冲液将羊抗鼠gG辣根过氧化物酶标二抗（3.15)稀释10000倍，孔加人100uL，置温箱中37℃孵育45min，磷酸盐吐温缓冲液250ul洗板5次：6.1.1.1.5显色：加底物显色液（3.23.4）.每孔加入100μl.置恒温箱中37℃作用15min；6.1.1.1.6终止显色：每孔加人501.终止液（3.24)6.1.1.1.7读数，加人终止液后10min内酶标仪测定O)150值：6.1.1.1.8工作浓度确定：选择0D2m值最接近1.0的包被抗原浓度及抗体浓度作为抗休特异性测2
定实验工作浓度。
6.1.1.2交叉反应测定
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6.1.1.2.1包被：用包被缓冲液（3.21)将包被原AFM,-T3SA按6.1.1.1.8中确定的抗原工作浓度：加入到96孔酶标板内，每孔100ul..臀恒温箱中37℃包被2h.磷酸盐吐温级冲液（.3.20）250，洗板3次；
6.1.1.2.2封闭：孔加人150ul.封闭液（3.22），置恒温箱中37℃孵育4.5mim.磷酸盐叶温缓冲液（3.20)250uL洗板3次；
6.1.1.2.3抗原抗体反应：分别移取50uL不同浓度的各种黄曲霉毒索标准工作液（3.18）与工作浓度抗体溶液（按6.1.1.1.8中确定的抗体工作浓度)50L混合，加入酶标板孔中，每个试验孔2个重复.置恒温箱中37℃孵育60I1ir1.同时设阴性对照孔（对照孔以磷酸盐缓冲液代替抗原工作液），磷酸盐叶温缓冲液(3.20)250μL洗板8次；
6.1.1.2.4酶标二抗反应：用磷酸盐缓冲液将抗鼠1gG辣根过鼠化物酶标二抗（.3.15）稀释10:000倍，每孔加入100山，置恒温箱中37℃孵育45min，磷酸盐叶温缓冲液（3.2C)250L洗板5次；6.1.1.2.5显：加底物显色液（3.23.4）.每孔加人100，置恒温箱中37℃作用15min；6.1.1.2.6终止显色：每孔加人50正终止液（3.24)；6.1.1.2.7读数：加人后10min内酶标仪测定OD)ao值。6.1.2抗体亲和力测定
6.1.2.1包被：包被原
6.2.1抗体特异性结果计算：用酶标仪测定（)D):u值，以黄曲毒毒素浓度的对数值为横坐标、以抑制T分率（各浓度标准竞争抑制抗原孔（)D值与不加标准品孔（I）值的百分比）为纵坐标绘制标准曲线，以各曲线50%抑制百分率的质量浓度IC%计算交叉反应率，交义反应率越小，抗体特异性越高。按式(1)计算。
S:×1c0
式中：
S.—交叉反应率，单位为白分率(%)；y——AFM的IC值，
2——AFM以外黄曲舞毒素的IC.心值。.(1)
6.2.2抗体亲和力结果计算：以抗体浓度（1e1/L)的对数值为横坐标，以其对应的吸光度为纵坐标，叫在一个坐标系内作出4条S形Ⅲ线：设定S曲线的顶部为（Dx。在曲线中分别找出1条带线各白3
NY/T 2309—2013
5C%0D对应的抗体浓度。将4个浓度两两组根据式（2)计算单抗的亲和常数Ka（单位：1/mol)亲和常数越人.抗休亲和力越高
2Xn×(c
式中：
一单抗的亲和常数，单位为升每摩尔（1./mol)；一每组中两个抗原包被浓度的倍数；分别为每组中两个50%(D)m对应的抗体浓度.单位为摩尔每升（mo1/L)。测定结果取其两次测定的算术平均值，计算结果保留至小数点后位。2]
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