NY/T 2377-2013
基本信息
标准号： NY/T 2377-2013
中文名称：葡萄病毒检测技术规范
标准类别：农业行业标准(NY)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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NY/T 2377-2013 葡萄病毒检测技术规范
NY/T2377-2013
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ICS65.020
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 2377—2013
葡萄病毒检测技术规范
Code of practice for the detection of grapevine viruses2013-09--10发布
2014-01-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标难按照GB/T1.1—2009给出的规则起草，本标准由农业部种植业管埋司提出。本标准内全国果品标推化技术委员会（SAC/TC510)归口。NY/T2377—2013
本标准起草单位：中国农业科学院果树研究所、农业部果品及故木质量监督检验测试中心（兴城）。本标准主要起草人：董雅风张尊平、范旭东、任芳、刘凤之、聂继云。1
1范围
葡萄病毒检测技术规范
NY/T 2377—2013
本标:准规定葡蒂主要病毒检测技术的术语和定义、检测对象、检测方法和检测结果的判定。本标准适用丁葡帮接穗、插条、苗木、组培苗、田间植株中主要葡萄病的检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文作的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注口期的版本适用于本文件。凡足不注月期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。NY/T1843葡萄无病毒母本树和苗木3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3. 1
葡萄无性繁殖材料grapcvineasexualpropagationmaterials用丁嫁接繁殖葡萄苗木的接穗或扦插繁殖葡萄苗木的插条。3.2
葡萄苗木grapevine nursery stock采用品种接穗渐砧木嫁接繁育的葡萄嫁接苗，以及通过扦插.组织培养等方法繁育的葡萄白根苗，3.3
葡萄组培苗grapevine nursery stock frorn tissue culture指利用葡外殖体，在无菌和适宜的人上条件下，培育的完整植株。3.4
指示植物indicatorplant
是指被某种或某类病毒侵染后,在适宜的环境条件下，能够表现典型症状的寄毛植物。3.5
酶联免疫吸附测定 enzyme-linkcd imamunosorbent assay (ELISA]在固相支持物上（酶联板）包被病毒特异性抗体.加人待测样品后，再用标记的病毒抗体进行免疫识别.最后过酶与底物的颜色反应检测病毒是否存在的一种血清学检测方法。3.6
逆转录聚合酶链式反应reverse lranscripliue-polyrnerase chain reactian (RT-PCR)利用逆转录酶将RNA逆转录为cDNA，再以此为模板并以耐热DNA聚合酶和一对引物（与待测目标核酸分子序列同源的DNA片段)通过高温（DNA分子变性)和低温（引物和目标核酸分了复性并被耐热DVA聚合酶延伸)交替循坏增待测日标核酸分广的方法。4检测对象
4.1葡i扇州病毒（Grapevinefaneaf virus,GFLV)4. 2葡蕉i卷叶相关病毒 1(Grapenine Leafrnll-assnciated virus 1,GIRa 1)4.3葡i卷相美病奔2(Grupeine leafrutl-ussuriateurirus2,GLRaV-2）1
NY/T2377--2013
葡萄卷叶相关病毒3(Grapernineleafroll-ussociatedvirux3.GLRaV-3）4.4
4. 5葡萄卷川相关病毒 1(Grapevine leafroll-assoricuted irus 4,GLRaV-4)葡荐卷叶相关病毒 5(Grabevine leu froll as3ociated irus 5,GLRaV5)4.6
葡萄卷[相关病毒 7(Grufenne leafrnll-associated virus 7.GLRaV-7)4.7
4.8葡萄病毒A(GrapevinevirusA,CVA)4. 9葡萄病毒 B(Grupevine wirus B,GVB)4. 10葡萄斑点病毒(Gruperine fteck tnrus,(GFkV)4.11沙地葡萄茎症痘病毒(Grufenne rupestris stem pitting-associuted virus，GRSPaV)5检测方法
5.1指示植物嫁接法
5.1.1葡扇叫病毒、葡费卷+相关病寿、葡萄病奔A和葡替斑点病毒均可采用指示植物进行检测。5.1.2采用绿枝嫁接和硬技嫁接方法，将待检样品嫁接到指示植物·或将指小植物嫁接到待检样品上，每个纽合复3株~-5 株。
5.1.3生长季节定期观察指示植物的症状表现，其体操作方法和指示植物症状表现参见附录A。5.2酶联免疫吸附法(ELISA)
5.2.1葡萄叶病毒，葡萄卷叶相关疯毒1，葡萄卷叶机关病毒2.葡萄卷叶相关病毒3，的萄卷吓相关病毒5，葡萄卷叶相关病毒7.葡萄病毒A，葡药病毒B和葡帮斑点病毒等能够获得稳定川靠抗血清的病毒，可来用EIISA力法进行检测。5.2.2适宜的检测时期和取样部位参见附录B。5.2.3具休检测程序参见附录C
5.3逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)5.3.1葡粥扇叶病毒，葡萄卷叫相美病毒1,葡萄卷叶相关病毒2，葡卷叶相关病毒3,葡萄卷叶相关病毒4，葡萄卷川机关病毒5，葡萄卷叫相关病毒7,葡萄病毒A，葡萄病毒B,葡斑点病毒和沙地葡萄落痘病毒均叫采用RTPCR方汰避行检测。5.3.2适宜的检测吋期和取样部位参见附录B5.3.3具体检测程参见附录D
6检测结果判定
根据附录A、附录C和附录I)判定检测结果。检测结果品阳性，即判定该样品携带相应的病毒：检测结果呈阴性，应进行复检、如采用2种以上的检测方法，口检测结果不一致，则以阳性结果为准，判定该样品携带相应的病毒。
对葡萄无病毒丹本树利范木进行检测时应根据NY/T1843的要求进行，2
A.1嫁接方法
A.1.绿技嫁接
附录A
(资料性附录）
指示植物嫁接检测
NY/T 2377—2013
上年培育盆裁指小植物或待检样品的扦插生根苗，翌年5月～6月，当站木和接穗均达半木质化时开始嫁接。嫁接时，砧木留3片4片叶剪，抹除夏芽及副梢，从断面中间乘直劈个2.5cm～3.0cm长的切！；选择与砧木粗度和成熟度相近的待检样品或指示植物作为接穗，抹除接穗1:的夏芽或剪去萌发的副梢,在芽下方0.5cm左右，从芽两侧向下削成长2.5cm~3.0cm长的平滑斜面，呈模形：削好的接穗马上捕入砧木的切中，使二者形成层对齐，接穗斜而露白0.5mm，用1.0cm~1.2cm宽的搏塑料条，从砧木接口下边向上缠绕，只将接芽露出，直缠到接穗顶端，封严接穗上的所有切口后再回缠打个活结。如果绿枝嫁接时间较早，气温偏低，可套小塑料袋增温，保湿，以提高成活率。A1.2硬技嫁接
早春萌芽前，以上年培育的盆裁指示植物或待检样品做砧木，剪留10cm~15cm长，用切接刀在砧木中心垂直向下旁2.5cm3.0cm长的切口；选择与砧木粗度相近的接穗，用清水浸泡24h后剪截，接穗上端距势眼约1.5cm处平前，再用切接刀在接穗芽下0.5cm~1cm处，从芽两侧向下削成长2.5cm-~3.0cm长的平滑斜面，呈模形；将削好的接穗一边的形成层与砧木形成层刘齐插人木的切口内，接穗削面在砧承劈几上露出1mm～2mm然后用塑料条从砖木切口的下向上螺旋式缔缆，将接口缠紧封严。
A.2嫁接数量与对照
检测时,须设阴、阳对照;同一指示植物与同一个样品组合（包括阴、阳对照)嫁接3抹~5A.3嫁接后的管理
嫁接后的盆苗置F防虫温空中，温度控制在20℃～26℃，并及时浇水，除去砧木上萌发的新梢，以促进接芽发。嫁接成活后，加强肥水管理和病出害防治。待指示植物长出嫩叶后，于生长季节定期观察，并记牵症状表现。有的病病在第2年才开始衣现症状，因此，至少观察2年。由于病毒症状表现受温度、指示植物长状态和病浓度等多种内素的影响，有必要在生长季节行多次调查，以保证鉴定结果准确可靠。
A.4结果判断
嫁接台中只要有1株表现典型症状（表A.1)，即判定该样品携带相应的筋需病声。表A.1葡萄病毒指示植物及症状表现病毒种类
葡菊扇叫病寺
葡萄卷叶相关病孝bZxz.net
葡毒病毒 A
指示植物
沙地葡葡圣乔治(Vitis rufestris rvSt、Gturge欧亚种葡萄（Vitis inifera）
Kolkr SLL
症状表现
叶片出现褪绿斑点、扇形叶
叶缘向下反卷，叶脉间变红
木质部产生茎沟椭，啡片黄斑
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病毒种类
表A.1（续）
指示植物
症状表现
叶脉透明
沙地截齿圣乔治(Vitis rupestris cv.St.Gurge）葡斑点病
指红色卧种，常用的有品丽珠（Cabernet.frane）、赤霞珠（Cahemetsuvigron）、黑比诺（Pinonnoir）、梅森（Mis-sion）巴贝（Barbera）等。
附录B
资料性附录
ELISA和RT-PCR检测适宜取样时期和部位EI.ISA和RT-PCR检测适宜取样时期和部位见表B.1。表 B.1ELISA 和 RT-PCR 检测适宜取样时期和部位病毒种类
葡萄扇叶病萨
葡萄卷叶相关病毒1，葡萄卷叶相关病毒2，前葡卷叶相关病毒3,葡葡卷叫相关病毒4葡老叶相关病5，葡菊卷叫相关病7葡萄病毒A
葡葡病毒L
葡谢斑点病毒
FL.ISA检测
适育时期
新梢4长期
休眠期
休眠期
休眠期
休瞩期
联样部位
成熟枝条闭皮部
成熟枝条韧皮帮
虚熟热枝条韧皮部
成熟枝条韧皮部
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RT-PCR检测
适宫时期
新梢生长期
休瞩期
休眠期
休眠期
休眠期
联样部位
成熟枝条韧皮部
成熟枝条制皮部
成熟枝条韧皮部
成熟枝条韧皮部
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C.1仅器设备和用具
C.1.1仪器设备
附录C
(资料性附录）
酶联免疫吸附检测(ELISA)
酶标仪、电了天平（感量0.0001g）、冰箱、恒溢箱（0%℃～50℃）、酸度计、离心机：C. 1. 2 用具
可调式移液器（2l、10μL、100μL200u、1000ul)及相成的吸头、酶标板、离心管、研钵等。C.2试剂
C. 2. 1包被缓冲液[0. 05 mnl/L磷酸盐缓冲液,pH9. 6)NazcO.
济于900mL蒸馏水中，搅拌至完全溶解，调节pH至9.6，定容至1000ml.。C.2.2冲洗缓冲液(PBST,PH7.4)
Na:HPO, + 121.()
Nal, PO, 2H,0
Twcen·20
溶}900ml.蒸馏水中，搅拌至完全溶解，调节pII至7.4，定容至1000ml.C.2.3样品提取缓冲液(不同抗血清，提取缓冲液不同，应根据血清试剂盒说明配制)聚乙烯吡略咯烷酮（PVP)
溶于100 ml,冲洗缓冲液(C.2.2)。C.2.4酶标抗体缓冲液(不同抗血清,提取缓冲液不同,应根据血清试剂盒说明配制)聚乙烯吡略咯烷(IVP)
牛血清白蛋白(RSA)
溶于100ml.冲洗缓冲液（C.2.2)。C.2.5底物缓冲液（pH9.8）
二乙醇胺
定容至100mL，用6mol/I.HCI调pH至9.8C.2.6底物（现用现配)
在10mL底物缓冲液(C.2.<)中加r10mg对硝基苯磷酸二钠盐（PNPP)。C. 2. 7 终止液(1 mul/L NaOll)NaOH
先用少量蒸馏水溶解后，定容至100 mL。注：所用试剂均为分析纯·酶标抗体为藏性磷酸酶标记的抗体。6
C.3检测
C.3.1加抗血清
NY/T2377—2013
用包被缓冲液(C.2.1)将病毒特异抗血清IgG稀释至工作浓度，加入到酶标板的微孔中，每孔100L：通常在37C保温2h（不同抗血消，保温时间和温度不同，应根据i清试剂盒说明确定），用PRS1C,2.2)板3次~4次
c.3.2加抗原样品
根据检测病寿种类，取嫩叶或一年牛休眠枝条韧皮部，每1g样品加人5mL～10mL样品提取级冲腋（C.2.3.，研磨后，3000r/min离心5min。每个微孔板需同时设阳性、阴性和空白对照，对照和每个样品分别2个微孔，每个微孔加100uI上清液。4℃冰箱中放置过夜片，按C.3.1方法洗板。C.3.3加酶标抗体
用酶标抗休缓冲液（C.2.4)将碱性磷酸酶标记的特异抗血清IgG稀释至工作浓度，加人微孔中，每孔100L，按C.3.1保温和洗板。C.3.4加底物
舒个微孔加100μL底物（C.2.5），黑暗中室温放置15min-~30min。C.3.5止反应
每个假孔25μ终止液。
C.3.6结果判定
测定酶标板各微孔105nm吸光值。若待检样品2孔半均吸光值/性对照2孔平均吸光值≥2.则判定该样品为阳性；如果样品2孔平均吸光值/阴性对照2孔平均吸光值2，则判定该样品为阴性，NY/T 2377—2013
D.1仪器设备和材料
附录D
【资料性附录】
RT-PCR 检测
D. 1. 1 微量移液器:200 nl_~1 000 μL,20 μL~-200 μL、10 μl,~100 μI.0. 5 μL~10 μLD.1.2电子平：感量为0.01和0.0001g。D.1.3高速冷冻离心机
D.1. 4PCR仪
D.1.5水平凝胶电泳仪
D.1.6凝胶成像系统。
D.1.7DEPC水处理的吸头和离心管D.2试剂
D.2. 1 研磨缓冲液
1. 0 mol/L、硫氰酸瓣
0.2 mol/1. NaAC
25 mmo1/1.EDTA
2. 5% PVP-30
DEPC处埋水定容至 50 mL,4℃保存。使用前加人2%偏重亚硫酸钠。D.2.2清洗缓冲液
10. 0 mnol/1. Tris - HCI
0, 5 n1rol/LEDTA
50 mmol/1. NaCl
50%乙醇
0. 394 1 g
DEPC处理水定容笔250 mL，1℃存。D.2.350×TAE缓冲液
冰乙酸
13. 5mL (或37. 5L36%乙酸）
灭菌蒸馏水定穿至 250ml,pH为8.0。1.2.46×凝胶加样缓冲液
漠酚蓝
二甲莱市 FF
10%(W/V)照糖水济液
火菌蒸煽水定容至50ml.,1%冰箱保存。8
D.3检测
D. 3. 1 总 RNA 提取
采HI-二氧化硅吸附法提取总RNANY/T 2377--2013
a）称取100mg待检材料放人塑料袋，加人1ml.研磨缓冲藏磨碎：b）取500μl.浆置于1.nL.消毒离心管中（预先加人150μl.10%N-lauroylsarsine)，70℃保温10min、冰中放置5nin后，14000r/min离心10min；取300ul.上清液，加入150μ100%乙醇、300l6mol/1.碘化钠、30L10%硅悬浮液c
（pH2.0)，室温下振荡20min；
6000r/min离心1min.齐去上清，加人500mL清洗缓冲液重悬浮沉淀，6000r/min离心1d)
e)重复步骤d)；
f）将离心管反扣在纸巾上，室溢下自然干燥后，重新悬浮于无RNaNc和DNasc的水中，70℃保温4. min;
g）13000r/min离心3min,取1消液，保存一70℃超低溢冰箱中。也可采用商品性试剂盒或其他方法提取总RNA
D.3.2合成cDNA
5μ.总RNA与1μL0.1g/随机引物5*d（NNNNNN)3和9l.水混合，9℃变性5min片立即置丁冰中冷却2min。再加人含5ul.5×MMLV·RT缓冲液，1.25μl.10mmol/LdNTPs.0.5uL200U/u),M-MLV逆转录酶和3.25μl.火菌纯水的道转录混合液，经37°℃10nnin、42℃50ni1、70℃5min合成cDNA
D.3.3JCR扩增
PCR反应混液其25L，包括2.5μLcDNA、2.5μl，J0×PCR缓冲液、0.5μL10mmol/LdNTPs,C.5L10Inol/L正向和反向引物(表D.1),0.375μL2U/uLTagDNA聚个酶、18.125zL灭闲纯水。按如下程进行PCR扩增：94℃10min：94%305，退火（退火温度见表D.1)4）%，7250s其35个循环，最后72℃：延伸10min。根据各组引物的退火温度及扩增产物大小设计。D.3.4结果判定
检测时设阴性、阳性对照，采用1.5%晾脂糖凝胶电泳，180v电泳约301nin1.0.5g/ml.EB溶液染色10min～15min，观察到与阴性对照位置相同的目的条带的样品为阳性，携带所检病每，与阴性对照-样，卡观察到目的条带的样品为阴性，不携带所检病毒。表 1D. 1 葡萄病毒 RT- PCK 引物病毒名称
葡扇叶（GFI.V）
葡药卷叶H美病毒 1(GLRV-1)
葡萄卷叶仙关病毒2(GLRaV-2)
葡帮粪叶相关病幸3(GLRaV-3)
葡套时有关病毒4(LRaV)
葡萄卷叫杠关病毒5(GLRaV-5)
引物序列（5-3°）
PIAAATTGIITCAAGA
P2;ACCGGATTGACGIGGGIGAT
FI: TCTTTACCAACUUCGAGATGAA
P2:GTGTCTGGTGACGTGCTAAACU
PI：TIGACAGCAGXATTAAGCG
P2: CTGACATTATTGGTGCGACG
PI: CGCTAGGGUIGIGGAAGTATT
P2: GTTGTGLCGGGTACCAGATAT
PI:CTCAAACCAGCGGCTGTTG
P2.GTGATACCATATACATACOGAC
P1: COOGTGATACAAGGTAGGACA
P2:CAGACTTCACCTCCTGTTAC
退火温度()
产物（bp）
NY/T2377—2013
病萨名秘
葡卷叫柑关病毒7(GI.RaV-7)
葡萄病毒A(GVA)
葡萄病毒B(GVB)
葡萄斑点病毒（GFkV）
沙地葡萄茎点病毒（GRSPaV)
表D.1（续）
引物序列（5-3)
P1: TATATLCTAACGGAGATGGC
P2:ATGTTOCTCCACCAAAATCG
PI,AAGCCTGACCTAGTCATCTTGG
P2: GACAAATGGCACAGTA(X
PI: ATCAGCAAACACGCTIGAACOG
P?: GTGGTAAGAAUGTCTTCACAGC
PI: GTCXIUCTACACCTOCCIGTXAT
P2: CCICATCCGCGGAGTTATEGAAT
PI: GGCCAAGGTTCAGTTTG
F2: ACACCTGCTGTGAAAGC
退火温度(\)
产物(bp)
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Code of practice for the detection of grapevine viruses2013-09--10发布
2014-01-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标难按照GB/T1.1—2009给出的规则起草，本标准由农业部种植业管埋司提出。本标准内全国果品标推化技术委员会（SAC/TC510)归口。NY/T2377—2013
本标准起草单位：中国农业科学院果树研究所、农业部果品及故木质量监督检验测试中心（兴城）。本标准主要起草人：董雅风张尊平、范旭东、任芳、刘凤之、聂继云。1
1范围
葡萄病毒检测技术规范
NY/T 2377—2013
本标:准规定葡蒂主要病毒检测技术的术语和定义、检测对象、检测方法和检测结果的判定。本标准适用丁葡帮接穗、插条、苗木、组培苗、田间植株中主要葡萄病的检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文作的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注口期的版本适用于本文件。凡足不注月期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。NY/T1843葡萄无病毒母本树和苗木3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3. 1
葡萄无性繁殖材料grapcvineasexualpropagationmaterials用丁嫁接繁殖葡萄苗木的接穗或扦插繁殖葡萄苗木的插条。3.2
葡萄苗木grapevine nursery stock采用品种接穗渐砧木嫁接繁育的葡萄嫁接苗，以及通过扦插.组织培养等方法繁育的葡萄白根苗，3.3
葡萄组培苗grapevine nursery stock frorn tissue culture指利用葡外殖体，在无菌和适宜的人上条件下，培育的完整植株。3.4
指示植物indicatorplant
是指被某种或某类病毒侵染后,在适宜的环境条件下，能够表现典型症状的寄毛植物。3.5
酶联免疫吸附测定 enzyme-linkcd imamunosorbent assay (ELISA]在固相支持物上（酶联板）包被病毒特异性抗体.加人待测样品后，再用标记的病毒抗体进行免疫识别.最后过酶与底物的颜色反应检测病毒是否存在的一种血清学检测方法。3.6
逆转录聚合酶链式反应reverse lranscripliue-polyrnerase chain reactian (RT-PCR)利用逆转录酶将RNA逆转录为cDNA，再以此为模板并以耐热DNA聚合酶和一对引物（与待测目标核酸分子序列同源的DNA片段)通过高温（DNA分子变性)和低温（引物和目标核酸分了复性并被耐热DVA聚合酶延伸)交替循坏增待测日标核酸分广的方法。4检测对象
4.1葡i扇州病毒（Grapevinefaneaf virus,GFLV)4. 2葡蕉i卷叶相关病毒 1(Grapenine Leafrnll-assnciated virus 1,GIRa 1)4.3葡i卷相美病奔2(Grupeine leafrutl-ussuriateurirus2,GLRaV-2）1
NY/T2377--2013
葡萄卷叶相关病毒3(Grapernineleafroll-ussociatedvirux3.GLRaV-3）4.4
4. 5葡萄卷川相关病毒 1(Grapevine leafroll-assoricuted irus 4,GLRaV-4)葡荐卷叶相关病毒 5(Grabevine leu froll as3ociated irus 5,GLRaV5)4.6
葡萄卷[相关病毒 7(Grufenne leafrnll-associated virus 7.GLRaV-7)4.7
4.8葡萄病毒A(GrapevinevirusA,CVA)4. 9葡萄病毒 B(Grupevine wirus B,GVB)4. 10葡萄斑点病毒(Gruperine fteck tnrus,(GFkV)4.11沙地葡萄茎症痘病毒(Grufenne rupestris stem pitting-associuted virus，GRSPaV)5检测方法
5.1指示植物嫁接法
5.1.1葡扇叫病毒、葡费卷+相关病寿、葡萄病奔A和葡替斑点病毒均可采用指示植物进行检测。5.1.2采用绿枝嫁接和硬技嫁接方法，将待检样品嫁接到指示植物·或将指小植物嫁接到待检样品上，每个纽合复3株~-5 株。
5.1.3生长季节定期观察指示植物的症状表现，其体操作方法和指示植物症状表现参见附录A。5.2酶联免疫吸附法(ELISA)
5.2.1葡萄叶病毒，葡萄卷叶相关疯毒1，葡萄卷叶机关病毒2.葡萄卷叶相关病毒3，的萄卷吓相关病毒5，葡萄卷叶相关病毒7.葡萄病毒A，葡药病毒B和葡帮斑点病毒等能够获得稳定川靠抗血清的病毒，可来用EIISA力法进行检测。5.2.2适宜的检测时期和取样部位参见附录B。5.2.3具休检测程序参见附录C
5.3逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)5.3.1葡粥扇叶病毒，葡萄卷叫相美病毒1,葡萄卷叶相关病毒2，葡卷叶相关病毒3,葡萄卷叶相关病毒4，葡萄卷川机关病毒5，葡萄卷叫相关病毒7,葡萄病毒A，葡萄病毒B,葡斑点病毒和沙地葡萄落痘病毒均叫采用RTPCR方汰避行检测。5.3.2适宜的检测吋期和取样部位参见附录B5.3.3具体检测程参见附录D
6检测结果判定
根据附录A、附录C和附录I)判定检测结果。检测结果品阳性，即判定该样品携带相应的病毒：检测结果呈阴性，应进行复检、如采用2种以上的检测方法，口检测结果不一致，则以阳性结果为准，判定该样品携带相应的病毒。
对葡萄无病毒丹本树利范木进行检测时应根据NY/T1843的要求进行，2
A.1嫁接方法
A.1.绿技嫁接
附录A
(资料性附录）
指示植物嫁接检测
NY/T 2377—2013
上年培育盆裁指小植物或待检样品的扦插生根苗，翌年5月～6月，当站木和接穗均达半木质化时开始嫁接。嫁接时，砧木留3片4片叶剪，抹除夏芽及副梢，从断面中间乘直劈个2.5cm～3.0cm长的切！；选择与砧木粗度和成熟度相近的待检样品或指示植物作为接穗，抹除接穗1:的夏芽或剪去萌发的副梢,在芽下方0.5cm左右，从芽两侧向下削成长2.5cm~3.0cm长的平滑斜面，呈模形：削好的接穗马上捕入砧木的切中，使二者形成层对齐，接穗斜而露白0.5mm，用1.0cm~1.2cm宽的搏塑料条，从砧木接口下边向上缠绕，只将接芽露出，直缠到接穗顶端，封严接穗上的所有切口后再回缠打个活结。如果绿枝嫁接时间较早，气温偏低，可套小塑料袋增温，保湿，以提高成活率。A1.2硬技嫁接
早春萌芽前，以上年培育的盆裁指示植物或待检样品做砧木，剪留10cm~15cm长，用切接刀在砧木中心垂直向下旁2.5cm3.0cm长的切口；选择与砧木粗度相近的接穗，用清水浸泡24h后剪截，接穗上端距势眼约1.5cm处平前，再用切接刀在接穗芽下0.5cm~1cm处，从芽两侧向下削成长2.5cm-~3.0cm长的平滑斜面，呈模形；将削好的接穗一边的形成层与砧木形成层刘齐插人木的切口内，接穗削面在砧承劈几上露出1mm～2mm然后用塑料条从砖木切口的下向上螺旋式缔缆，将接口缠紧封严。
A.2嫁接数量与对照
检测时,须设阴、阳对照;同一指示植物与同一个样品组合（包括阴、阳对照)嫁接3抹~5A.3嫁接后的管理
嫁接后的盆苗置F防虫温空中，温度控制在20℃～26℃，并及时浇水，除去砧木上萌发的新梢，以促进接芽发。嫁接成活后，加强肥水管理和病出害防治。待指示植物长出嫩叶后，于生长季节定期观察，并记牵症状表现。有的病病在第2年才开始衣现症状，因此，至少观察2年。由于病毒症状表现受温度、指示植物长状态和病浓度等多种内素的影响，有必要在生长季节行多次调查，以保证鉴定结果准确可靠。
A.4结果判断
嫁接台中只要有1株表现典型症状（表A.1)，即判定该样品携带相应的筋需病声。表A.1葡萄病毒指示植物及症状表现病毒种类
葡菊扇叫病寺
葡萄卷叶相关病孝bZxz.net
葡毒病毒 A
指示植物
沙地葡葡圣乔治(Vitis rufestris rvSt、Gturge欧亚种葡萄（Vitis inifera）
Kolkr SLL
症状表现
叶片出现褪绿斑点、扇形叶
叶缘向下反卷，叶脉间变红
木质部产生茎沟椭，啡片黄斑
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病毒种类
表A.1（续）
指示植物
症状表现
叶脉透明
沙地截齿圣乔治(Vitis rupestris cv.St.Gurge）葡斑点病
指红色卧种，常用的有品丽珠（Cabernet.frane）、赤霞珠（Cahemetsuvigron）、黑比诺（Pinonnoir）、梅森（Mis-sion）巴贝（Barbera）等。
附录B
资料性附录
ELISA和RT-PCR检测适宜取样时期和部位EI.ISA和RT-PCR检测适宜取样时期和部位见表B.1。表 B.1ELISA 和 RT-PCR 检测适宜取样时期和部位病毒种类
葡萄扇叶病萨
葡萄卷叶相关病毒1，葡萄卷叶相关病毒2，前葡卷叶相关病毒3,葡葡卷叫相关病毒4葡老叶相关病5，葡菊卷叫相关病7葡萄病毒A
葡葡病毒L
葡谢斑点病毒
FL.ISA检测
适育时期
新梢4长期
休眠期
休眠期
休眠期
休瞩期
联样部位
成熟枝条闭皮部
成熟枝条韧皮帮
虚熟热枝条韧皮部
成熟枝条韧皮部
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RT-PCR检测
适宫时期
新梢生长期
休瞩期
休眠期
休眠期
休眠期
联样部位
成熟枝条韧皮部
成熟枝条制皮部
成熟枝条韧皮部
成熟枝条韧皮部
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C.1仅器设备和用具
C.1.1仪器设备
附录C
(资料性附录）
酶联免疫吸附检测(ELISA)
酶标仪、电了天平（感量0.0001g）、冰箱、恒溢箱（0%℃～50℃）、酸度计、离心机：C. 1. 2 用具
可调式移液器（2l、10μL、100μL200u、1000ul)及相成的吸头、酶标板、离心管、研钵等。C.2试剂
C. 2. 1包被缓冲液[0. 05 mnl/L磷酸盐缓冲液,pH9. 6)NazcO.
济于900mL蒸馏水中，搅拌至完全溶解，调节pH至9.6，定容至1000ml.。C.2.2冲洗缓冲液(PBST,PH7.4)
Na:HPO, + 121.()
Nal, PO, 2H,0
Twcen·20
溶}900ml.蒸馏水中，搅拌至完全溶解，调节pII至7.4，定容至1000ml.C.2.3样品提取缓冲液(不同抗血清，提取缓冲液不同，应根据血清试剂盒说明配制)聚乙烯吡略咯烷酮（PVP)
溶于100 ml,冲洗缓冲液(C.2.2)。C.2.4酶标抗体缓冲液(不同抗血清,提取缓冲液不同,应根据血清试剂盒说明配制)聚乙烯吡略咯烷(IVP)
牛血清白蛋白(RSA)
溶于100ml.冲洗缓冲液（C.2.2)。C.2.5底物缓冲液（pH9.8）
二乙醇胺
定容至100mL，用6mol/I.HCI调pH至9.8C.2.6底物（现用现配)
在10mL底物缓冲液(C.2.<)中加r10mg对硝基苯磷酸二钠盐（PNPP)。C. 2. 7 终止液(1 mul/L NaOll)NaOH
先用少量蒸馏水溶解后，定容至100 mL。注：所用试剂均为分析纯·酶标抗体为藏性磷酸酶标记的抗体。6
C.3检测
C.3.1加抗血清
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用包被缓冲液(C.2.1)将病毒特异抗血清IgG稀释至工作浓度，加入到酶标板的微孔中，每孔100L：通常在37C保温2h（不同抗血消，保温时间和温度不同，应根据i清试剂盒说明确定），用PRS1C,2.2)板3次~4次
c.3.2加抗原样品
根据检测病寿种类，取嫩叶或一年牛休眠枝条韧皮部，每1g样品加人5mL～10mL样品提取级冲腋（C.2.3.，研磨后，3000r/min离心5min。每个微孔板需同时设阳性、阴性和空白对照，对照和每个样品分别2个微孔，每个微孔加100uI上清液。4℃冰箱中放置过夜片，按C.3.1方法洗板。C.3.3加酶标抗体
用酶标抗休缓冲液（C.2.4)将碱性磷酸酶标记的特异抗血清IgG稀释至工作浓度，加人微孔中，每孔100L，按C.3.1保温和洗板。C.3.4加底物
舒个微孔加100μL底物（C.2.5），黑暗中室温放置15min-~30min。C.3.5止反应
每个假孔25μ终止液。
C.3.6结果判定
测定酶标板各微孔105nm吸光值。若待检样品2孔半均吸光值/性对照2孔平均吸光值≥2.则判定该样品为阳性；如果样品2孔平均吸光值/阴性对照2孔平均吸光值2，则判定该样品为阴性，NY/T 2377—2013
D.1仪器设备和材料
附录D
【资料性附录】
RT-PCR 检测
D. 1. 1 微量移液器:200 nl_~1 000 μL,20 μL~-200 μL、10 μl,~100 μI.0. 5 μL~10 μLD.1.2电子平：感量为0.01和0.0001g。D.1.3高速冷冻离心机
D.1. 4PCR仪
D.1.5水平凝胶电泳仪
D.1.6凝胶成像系统。
D.1.7DEPC水处理的吸头和离心管D.2试剂
D.2. 1 研磨缓冲液
1. 0 mol/L、硫氰酸瓣
0.2 mol/1. NaAC
25 mmo1/1.EDTA
2. 5% PVP-30
DEPC处埋水定容至 50 mL,4℃保存。使用前加人2%偏重亚硫酸钠。D.2.2清洗缓冲液
10. 0 mnol/1. Tris - HCI
0, 5 n1rol/LEDTA
50 mmol/1. NaCl
50%乙醇
0. 394 1 g
DEPC处理水定容笔250 mL，1℃存。D.2.350×TAE缓冲液
冰乙酸
13. 5mL (或37. 5L36%乙酸）
灭菌蒸馏水定穿至 250ml,pH为8.0。1.2.46×凝胶加样缓冲液
漠酚蓝
二甲莱市 FF
10%(W/V)照糖水济液
火菌蒸煽水定容至50ml.,1%冰箱保存。8
D.3检测
D. 3. 1 总 RNA 提取
采HI-二氧化硅吸附法提取总RNANY/T 2377--2013
a）称取100mg待检材料放人塑料袋，加人1ml.研磨缓冲藏磨碎：b）取500μl.浆置于1.nL.消毒离心管中（预先加人150μl.10%N-lauroylsarsine)，70℃保温10min、冰中放置5nin后，14000r/min离心10min；取300ul.上清液，加入150μ100%乙醇、300l6mol/1.碘化钠、30L10%硅悬浮液c
（pH2.0)，室温下振荡20min；
6000r/min离心1min.齐去上清，加人500mL清洗缓冲液重悬浮沉淀，6000r/min离心1d)
e)重复步骤d)；
f）将离心管反扣在纸巾上，室溢下自然干燥后，重新悬浮于无RNaNc和DNasc的水中，70℃保温4. min;
g）13000r/min离心3min,取1消液，保存一70℃超低溢冰箱中。也可采用商品性试剂盒或其他方法提取总RNA
D.3.2合成cDNA
5μ.总RNA与1μL0.1g/随机引物5*d（NNNNNN)3和9l.水混合，9℃变性5min片立即置丁冰中冷却2min。再加人含5ul.5×MMLV·RT缓冲液，1.25μl.10mmol/LdNTPs.0.5uL200U/u),M-MLV逆转录酶和3.25μl.火菌纯水的道转录混合液，经37°℃10nnin、42℃50ni1、70℃5min合成cDNA
D.3.3JCR扩增
PCR反应混液其25L，包括2.5μLcDNA、2.5μl，J0×PCR缓冲液、0.5μL10mmol/LdNTPs,C.5L10Inol/L正向和反向引物(表D.1),0.375μL2U/uLTagDNA聚个酶、18.125zL灭闲纯水。按如下程进行PCR扩增：94℃10min：94%305，退火（退火温度见表D.1)4）%，7250s其35个循环，最后72℃：延伸10min。根据各组引物的退火温度及扩增产物大小设计。D.3.4结果判定
检测时设阴性、阳性对照，采用1.5%晾脂糖凝胶电泳，180v电泳约301nin1.0.5g/ml.EB溶液染色10min～15min，观察到与阴性对照位置相同的目的条带的样品为阳性，携带所检病每，与阴性对照-样，卡观察到目的条带的样品为阴性，不携带所检病毒。表 1D. 1 葡萄病毒 RT- PCK 引物病毒名称
葡扇叶（GFI.V）
葡药卷叶H美病毒 1(GLRV-1)
葡萄卷叶仙关病毒2(GLRaV-2)
葡帮粪叶相关病幸3(GLRaV-3)
葡套时有关病毒4(LRaV)
葡萄卷叫杠关病毒5(GLRaV-5)
引物序列（5-3°）
PIAAATTGIITCAAGA
P2;ACCGGATTGACGIGGGIGAT
FI: TCTTTACCAACUUCGAGATGAA
P2:GTGTCTGGTGACGTGCTAAACU
PI：TIGACAGCAGXATTAAGCG
P2: CTGACATTATTGGTGCGACG
PI: CGCTAGGGUIGIGGAAGTATT
P2: GTTGTGLCGGGTACCAGATAT
PI:CTCAAACCAGCGGCTGTTG
P2.GTGATACCATATACATACOGAC
P1: COOGTGATACAAGGTAGGACA
P2:CAGACTTCACCTCCTGTTAC
退火温度()
产物（bp）
NY/T2377—2013
病萨名秘
葡卷叫柑关病毒7(GI.RaV-7)
葡萄病毒A(GVA)
葡萄病毒B(GVB)
葡萄斑点病毒（GFkV）
沙地葡萄茎点病毒（GRSPaV)
表D.1（续）
引物序列（5-3)
P1: TATATLCTAACGGAGATGGC
P2:ATGTTOCTCCACCAAAATCG
PI,AAGCCTGACCTAGTCATCTTGG
P2: GACAAATGGCACAGTA(X
PI: ATCAGCAAACACGCTIGAACOG
P?: GTGGTAAGAAUGTCTTCACAGC
PI: GTCXIUCTACACCTOCCIGTXAT
P2: CCICATCCGCGGAGTTATEGAAT
PI: GGCCAAGGTTCAGTTTG
F2: ACACCTGCTGTGAAAGC
退火温度(\)
产物(bp)
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