NY/T 2417-2013
基本信息
标准号： NY/T 2417-2013
中文名称：副猪嗜血杆菌PCR检测方法
标准类别：农业行业标准(NY)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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出版信息
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标准简介
NY/T 2417-2013 副猪嗜血杆菌PCR检测方法
NY/T2417-2013
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标准内容
ICS 11.220
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 2417—2013Www.bzxZ.net
副猪嗜而杆菌PCR检测方法
Polymerase chain reaction (PCR) for detection ofHaemophilusparasuis
2013-09-10发布
2014-01-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/T181）归。本标准起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所。本标准主要起草人：逮忠新、贺英、储岳峰.赵萍、高瞩程。NY/T 2417--2013
「范围
副猪嗜而杆菌PCR检测方法
NY/T2417—2013
本标准规定了检测副猪嗜血杆菌（Haemophitusparasuis，HPs）的聚合酶链式反应（Polymerasechain reactian.PCR技术，
本标准适用于副猪嗜血杆菌病的病原学检测，2材料准备
2.1器材
PCR扩增仪、1.5mL离心管、2.0mL离心管、0.2mLICR反应管，水浴箱、台式高速温控离心机、电泳仪、移液器、移液器吸管、紫外凝胶成像仪、冰箱。2.2试剂
NET缓冲液（配制方法参见A.1)、TAE电缓冲液（配制方法蚕见A.2)、RNaseA酶、蛋H酶K.TugDNA聚合酶（5U/μuL)、10XFCR缀冲液（含Mg）、脱氧-磷酸核苷酸混合液（dNTPs-各2.5m11o1/uL）、125bDNA分子质量标准、无水乙醇、酚一氯仿一异戊醇（25：241）、一羟甲基氨基甲烷（Tris碱）、琼脂糖、乙二胺四乙酸二钠（NaEDI'A）、冰醋酸、氯化钠、溴酚燃、溴化乙锭、I二烷基硫酸钠（SES)、灭菌超纯水。
2.3引物
引物序列:FI : 5'-TAT CGGGAG AIG AAA GAC-3',F2 : 5'- GIA ATG TCT AAG GACTAG-3，Revx：5°-CCTCGC.GGCTTCGTC-3。引物在使用时用灭菌超纯水稀释为20μmol/L靶某网片段序列及引物在靶基因中的位置参见A.3。2.4样品采集
2.4.1气管分泌物
用火菌棉拭子取气管分泌物，放入无菌试管中，2.4.2肺脏
无菌采集肺脏病变部位或病变/非病变部位交界处的样品。2.4.3关节液
若有关节囊肿，在囊肿部位表面常规碘配消毒，用2mL或5ml.灭菌注射器穿刺，无菌吸取1mL~2 mL关节渗出液。
2.4.4采集的样品
成在4℃条件下立即送到实验室。2.5DNA提取
2.5.1样品处理
2.5.1.1气管分泌物拭子
将每支拭子浸入1ml.~2ml.NFT缓冲液中30min，反复挤压。将漫出液经4℃7500g离心15min后，弃上清。收集淀.用1mLNET缓冲液重裁。2.5.1.2肺组织
将肺纽织样品剪碎.按1g加人C.9mLNET缓冲液研磨后.用双层灭菌纱布过滤。收集过滤液于2mL灭菌离心管.4℃7500g离心15min.奔仁消，收集流淀，用1mLNET缓冲液重。NY/T 2417—2013
2.5.1.3关节液
将500L关节液和500uL.NFT缓冲液等体积混匀后，4℃7500g离心20tmin.弃E清，收集流淀，用1mLNET缓冲液重愿。
2.5.2DNA的提取方法
2.5.2.1取2.5.1中制备的样品悬液500uI，加人100μL20%的SIS（终浓度3.1%），混勺、在95℃~-100℃孵育10min后，迅速置于冰上冷却10min~-15min。2.5.2.2在样品中加入RNascA至终浓度为40μg/ml.50%水浴30min。然后，加人蛋白酶K至终浓度为200 μg/mL.50℃水浴30 mim。2.5.2.3加人等体积的酚氯仿异醇（25：24：1），手颠倒摇匀2次～3次，1℃9000g离心l0 minu
2.5.2.4转移上清液于另离心管中，2.5.2.5重复2.5.2.3、2.5.2.4操作过程，加入2.5倍休积的预冷无水乙醇，于颠倒摇匀2次～3次，一20℃沉淀30min℃12000g离心10min.充去液相。2.5.2.6用1mL70%乙醇漂洗，4℃12000g离心2mim.充上清，真空或室温下干燥DNA沉淀，2.5.2.7DNA沉淀用25uL~50uL无菌超纯水溶解作为模板，保存在-20%备用。3PCR试验
3. 1 反应体系
loXPCR buffer(含 Mg\i)
脱氧二磷酸核节酸混合液(dNTPs)物和物
Revx引物
模板（被检样品总DNA）
无菌超纯水
TaTINA聚合酶
各 0. 5μL
36. 5 μL
样品检测时.同时要设阳性对照和空白对照，阳性对照模板为靶基因（副猪嗜血杆菌16SIRNA基因片段)重组质粒，空白对照为灭菌超纯水。3.2PCR反应程序
94℃变性3min，然后35个循坏，分别为：94℃变性1min.56℃退火45s.72℃延伸1imin；最后72℃延伸10 min,4℃保存，
3.3电泳
3.3.11%琼脂糖凝胶板的制备
称取1多琼脂糖置于100ml.TAF电泳缓冲液中，加热融化。待温度降至 60℃左右时,加人10mg/ml.溴化乙锭（EB）3μl，~5μl.,均匀铺板，厚度为3mm~5mm3.3.2加样
PCR反应结束.取扩增产物5μ(包括被检样品.阳性对照、空白对照）、125bpIVA分子质量标准5 ul、1:样缓冲液1μl.进行琼脂糖凝胶电,3.3.3电泳条件
100V电泳30min。
3.3.4凝胶成像仪观察
扩增产物电泳结束后，用凝胶成像仪观察、拍照，记求试验结果2
4PCR试验结果判定
NY/T 2417—2013
4.1将扩增产物电泳后用凝胶成像仪观察，LNA分子质量标准、阳性对照、空白对照为如下结果时试验方成立，否则应重新试验，
a）125bpDNA分子质量标准电泳道，从上到下依次山现2000bp、1250bp、1000bp、750hp500hp、375bp、2.50bp、125tp共8条清晰的条带。阳性样品电泳道出现一条约109Cbp清晰的条带。b）
阴性样品电泳道不出现约1090bp条带。c
4.2被检样品结果判定
在同一块凝胶板工电泳后，当DVA分子质量标准、各组对照同时戒立时，被检样品电泳道出现一条1090hp的条带，判为阳性（十）；被检样品电泳道没有出现大小为1090bp的条带，判为阴性（一）。结果判定参见附录B。
NY/T2417—2013
A. 1NET缓冲液(pH7.6)的配制
Tris 碱
Na,EDTA - 2H,0
超纯水
附录A
【资料性附录”
PCR试验试剂的配制
6. 06 g(0. 05 mol/1.)
0. 37 g(1 imol/1.)
8. 77 g (0. 15l mol/1.)
待上述混合物完全溶解后.加超纯水至1L，用1mol/1.IICl滴度至pH7.6，置于室温保存。2TAE电泳缓冲液（pH约8.5)的配制A.2
5C.XTAE电泳缓冲储存液：
三羟甲基氨基甲烷(Tris 碱)
乙二鞍四乙酸二钠(Na2EDTA)
超纯水
待上述混合物完全萍解后.加入57.1ml.的醋酸充分搅拌溶解，加超纯.水至1L后.置室温保存使用前.用超纯水将50×TAE电泳缓冲液50倍稀释。3靶基因片段序列及引物在靶基因中的位置A.3
A.3.1引物F1、Revx(适合十刷猪嗜血杆菌血清型1-4.6-11)。agagtttgatcatggctcagattgaacgctggcegcaggcttaacacatgcaagtcgaacggtagcagraagaagcttgcttctttgctgacgagtggcggargggtgagtantgcttgggaatctggcttatgsaggBsgataactacgggaaactgtagctaataccgc
F1-- |gt ag ta tcggagatgaaagadteggaccgcaaggccagttgcc al aagatgagcccaugtgeg at taggtagt tgetgeggtaeaggcctaccaagccgacgatctctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagpctcc tacgggaggcegcagtggBgaatattgcac aatggggegaaccctgatgc agccatgccgcgtgaatgaagaaggccttcggettgtaaagttctttcggtgatgaggaaggrtgatgttttaatagugcultucttgacgttagtcacagaagaagcaccagctaactccgtgccagcegccgcggtaatacggagggtgcgagcgtteatcggaatgactgggcgtaaagggcacgcaggcgstgacttaagtgggatgtgaaagccccgagcttaacttgkaattgcatttcatactgggttgctagagtattttagggaggsgtagaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagetgtggaggaat accgaaggcgaaggcagcccct lgsbunaa tact gaegctcatgtgegaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgctgtaaacgctgtcgatttggggattgggctttatgtttggtgcccgtagct aacgtgataaatcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatuattgacgggggcccgcnraagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatcctaagaagaactcagagatgagtttgtgccttcgggaacttagagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgsgttaagtcccgcaacgagcgceacccttatcctttgttgccagcgattcggtcgggimctceuggngactgccagtgataaactggaggaaggtssegatgacgtcaagtcateatxcccttacgagtagxctacacacBlgctaca
Revi-atggtgcatacagagggrgacgaagccgcgaggtggagtgaatclcaguuagtgcatctaagtccggattggugtctgcaactcguc tccatgaagtcggaatcgctagtaatcgcguateagaatgtcgcggtaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccat.gRkagtgBgttgtaccagaagtagatagcttaactgaaagsegcgtLtaccacggtatgattcalgut
2引物F2.Revx适合下副猪嗜血杆菌而清型512-15)。A.3.2
NY/T 2417—2013
agagtttgatcatggctcagattgaacgctggcggcaggcttaacacatgcaagtcgaacggtagcaggaaggaaBcttgctttctttgctgacgagtggcggacgggtgagtaatgcttggggatctggcttatgeagegggataacgacgggaaactgtcgctaataccgc
e2-etastgtztaasamctagagstgggactttegggccacctgccataagatgagcccaagtaggattaggtagttggtgggataaaggcctaccaegccgacgatctctagct ggtcteagaggatgaccagccacact ggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtgbggaatattgcacaatggggggaaccctgatgcagccatgccgcgtgaatgaageagrccttcgggttgtaaagttctttcggtgatgagguaggigatgttttaatagagcattacattgacgttagtcacagaagaagceccggctaactccgtgccagcagccgcgetaatacggagggtgcgagcgttuatcggaatgactgggcgtaaagggcacgcaggcggtgacttaagtgagatgtgaaagcccogagcttaacttεggaattgcatttcatactggttgctagagtattttagggagaggtagaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaataccgaaggcgaaggcagccccttgggaaaatactgacgctcatgtgcgaaagcgtgsggagcaucuggattagataccctggtagtccacgctgtaaacgctgtcgatttggggattgkgctttatgtttggtgcccgtagctaacgtgataaatcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgBBggcccgcacaagcggtggagcatgtgstttaattcgatgcaacgcgaaguaucttauctactcttgacatcctaagaagctttcagagatgugugtgtgccttcgggaacttagagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctca1gttgtgeaatgttgsgttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcgattcggtcgggaactcaaaggagactgccagtgataaactggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgtgctaca
Rev- atggtgcatacagaggcgacmgcegcgaetagagtgaatc tcagiagtgcatetaagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcBgaatcgctagtaatcgcgaatcagaatgtcgcggtgeatacgttcccgggccttgtacacacogcccgtcacaccatgggagtgggttgtaccagunglagatagcttaaotgaaagggggcgtt taccncggtatgattcatgact
NY/T2417—2013
附录B
(资料性附录)
样品检测结果判定图
副猪嗜血杆菌 PCR检测结果电泳图见图 B,1.M
1250bp
1000bp
250 bp
125 bp
说明，
M———125IrNA分子质量标准：1
例径。
+1090bp
副猪嗜血杆菌PCR检测结果电泳图
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中华人民共和国农业行业标准
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副猪嗜而杆菌PCR检测方法
Polymerase chain reaction (PCR) for detection ofHaemophilusparasuis
2013-09-10发布
2014-01-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/T181）归。本标准起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所。本标准主要起草人：逮忠新、贺英、储岳峰.赵萍、高瞩程。NY/T 2417--2013
「范围
副猪嗜而杆菌PCR检测方法
NY/T2417—2013
本标准规定了检测副猪嗜血杆菌（Haemophitusparasuis，HPs）的聚合酶链式反应（Polymerasechain reactian.PCR技术，
本标准适用于副猪嗜血杆菌病的病原学检测，2材料准备
2.1器材
PCR扩增仪、1.5mL离心管、2.0mL离心管、0.2mLICR反应管，水浴箱、台式高速温控离心机、电泳仪、移液器、移液器吸管、紫外凝胶成像仪、冰箱。2.2试剂
NET缓冲液（配制方法参见A.1)、TAE电缓冲液（配制方法蚕见A.2)、RNaseA酶、蛋H酶K.TugDNA聚合酶（5U/μuL)、10XFCR缀冲液（含Mg）、脱氧-磷酸核苷酸混合液（dNTPs-各2.5m11o1/uL）、125bDNA分子质量标准、无水乙醇、酚一氯仿一异戊醇（25：241）、一羟甲基氨基甲烷（Tris碱）、琼脂糖、乙二胺四乙酸二钠（NaEDI'A）、冰醋酸、氯化钠、溴酚燃、溴化乙锭、I二烷基硫酸钠（SES)、灭菌超纯水。
2.3引物
引物序列:FI : 5'-TAT CGGGAG AIG AAA GAC-3',F2 : 5'- GIA ATG TCT AAG GACTAG-3，Revx：5°-CCTCGC.GGCTTCGTC-3。引物在使用时用灭菌超纯水稀释为20μmol/L靶某网片段序列及引物在靶基因中的位置参见A.3。2.4样品采集
2.4.1气管分泌物
用火菌棉拭子取气管分泌物，放入无菌试管中，2.4.2肺脏
无菌采集肺脏病变部位或病变/非病变部位交界处的样品。2.4.3关节液
若有关节囊肿，在囊肿部位表面常规碘配消毒，用2mL或5ml.灭菌注射器穿刺，无菌吸取1mL~2 mL关节渗出液。
2.4.4采集的样品
成在4℃条件下立即送到实验室。2.5DNA提取
2.5.1样品处理
2.5.1.1气管分泌物拭子
将每支拭子浸入1ml.~2ml.NFT缓冲液中30min，反复挤压。将漫出液经4℃7500g离心15min后，弃上清。收集淀.用1mLNET缓冲液重裁。2.5.1.2肺组织
将肺纽织样品剪碎.按1g加人C.9mLNET缓冲液研磨后.用双层灭菌纱布过滤。收集过滤液于2mL灭菌离心管.4℃7500g离心15min.奔仁消，收集流淀，用1mLNET缓冲液重。NY/T 2417—2013
2.5.1.3关节液
将500L关节液和500uL.NFT缓冲液等体积混匀后，4℃7500g离心20tmin.弃E清，收集流淀，用1mLNET缓冲液重愿。
2.5.2DNA的提取方法
2.5.2.1取2.5.1中制备的样品悬液500uI，加人100μL20%的SIS（终浓度3.1%），混勺、在95℃~-100℃孵育10min后，迅速置于冰上冷却10min~-15min。2.5.2.2在样品中加入RNascA至终浓度为40μg/ml.50%水浴30min。然后，加人蛋白酶K至终浓度为200 μg/mL.50℃水浴30 mim。2.5.2.3加人等体积的酚氯仿异醇（25：24：1），手颠倒摇匀2次～3次，1℃9000g离心l0 minu
2.5.2.4转移上清液于另离心管中，2.5.2.5重复2.5.2.3、2.5.2.4操作过程，加入2.5倍休积的预冷无水乙醇，于颠倒摇匀2次～3次，一20℃沉淀30min℃12000g离心10min.充去液相。2.5.2.6用1mL70%乙醇漂洗，4℃12000g离心2mim.充上清，真空或室温下干燥DNA沉淀，2.5.2.7DNA沉淀用25uL~50uL无菌超纯水溶解作为模板，保存在-20%备用。3PCR试验
3. 1 反应体系
loXPCR buffer(含 Mg\i)
脱氧二磷酸核节酸混合液(dNTPs)物和物
Revx引物
模板（被检样品总DNA）
无菌超纯水
TaTINA聚合酶
各 0. 5μL
36. 5 μL
样品检测时.同时要设阳性对照和空白对照，阳性对照模板为靶基因（副猪嗜血杆菌16SIRNA基因片段)重组质粒，空白对照为灭菌超纯水。3.2PCR反应程序
94℃变性3min，然后35个循坏，分别为：94℃变性1min.56℃退火45s.72℃延伸1imin；最后72℃延伸10 min,4℃保存，
3.3电泳
3.3.11%琼脂糖凝胶板的制备
称取1多琼脂糖置于100ml.TAF电泳缓冲液中，加热融化。待温度降至 60℃左右时,加人10mg/ml.溴化乙锭（EB）3μl，~5μl.,均匀铺板，厚度为3mm~5mm3.3.2加样
PCR反应结束.取扩增产物5μ(包括被检样品.阳性对照、空白对照）、125bpIVA分子质量标准5 ul、1:样缓冲液1μl.进行琼脂糖凝胶电,3.3.3电泳条件
100V电泳30min。
3.3.4凝胶成像仪观察
扩增产物电泳结束后，用凝胶成像仪观察、拍照，记求试验结果2
4PCR试验结果判定
NY/T 2417—2013
4.1将扩增产物电泳后用凝胶成像仪观察，LNA分子质量标准、阳性对照、空白对照为如下结果时试验方成立，否则应重新试验，
a）125bpDNA分子质量标准电泳道，从上到下依次山现2000bp、1250bp、1000bp、750hp500hp、375bp、2.50bp、125tp共8条清晰的条带。阳性样品电泳道出现一条约109Cbp清晰的条带。b）
阴性样品电泳道不出现约1090bp条带。c
4.2被检样品结果判定
在同一块凝胶板工电泳后，当DVA分子质量标准、各组对照同时戒立时，被检样品电泳道出现一条1090hp的条带，判为阳性（十）；被检样品电泳道没有出现大小为1090bp的条带，判为阴性（一）。结果判定参见附录B。
NY/T2417—2013
A. 1NET缓冲液(pH7.6)的配制
Tris 碱
Na,EDTA - 2H,0
超纯水
附录A
【资料性附录”
PCR试验试剂的配制
6. 06 g(0. 05 mol/1.)
0. 37 g(1 imol/1.)
8. 77 g (0. 15l mol/1.)
待上述混合物完全溶解后.加超纯水至1L，用1mol/1.IICl滴度至pH7.6，置于室温保存。2TAE电泳缓冲液（pH约8.5)的配制A.2
5C.XTAE电泳缓冲储存液：
三羟甲基氨基甲烷(Tris 碱)
乙二鞍四乙酸二钠(Na2EDTA)
超纯水
待上述混合物完全萍解后.加入57.1ml.的醋酸充分搅拌溶解，加超纯.水至1L后.置室温保存使用前.用超纯水将50×TAE电泳缓冲液50倍稀释。3靶基因片段序列及引物在靶基因中的位置A.3
A.3.1引物F1、Revx(适合十刷猪嗜血杆菌血清型1-4.6-11)。agagtttgatcatggctcagattgaacgctggcegcaggcttaacacatgcaagtcgaacggtagcagraagaagcttgcttctttgctgacgagtggcggargggtgagtantgcttgggaatctggcttatgsaggBsgataactacgggaaactgtagctaataccgc
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2引物F2.Revx适合下副猪嗜血杆菌而清型512-15)。A.3.2
NY/T 2417—2013
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NY/T2417—2013
附录B
(资料性附录)
样品检测结果判定图
副猪嗜血杆菌 PCR检测结果电泳图见图 B,1.M
1250bp
1000bp
250 bp
125 bp
说明，
M———125IrNA分子质量标准：1
例径。
+1090bp
副猪嗜血杆菌PCR检测结果电泳图
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