NY/T 772-2013
基本信息
标准号： NY/T 772-2013
中文名称：禽流感病毒RT-PCR检测方法
标准类别：农业行业标准(NY)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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出版信息
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标准简介
NY/T 772-2013 禽流感病毒RT-PCR检测方法
NY/T772-2013
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标准内容
ICS11.220
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 772--2013
代替NY/T772-2004
禽流感病毒RT-PCR检测方法
RT-PCR detection method for avian influenza viruses2013-09-10发布
2014-01-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准代替NY/T772—2004禽流感病毒RT-PCR试验方法》。本标准与NY/T772—2004相比，主要变化如下：将原标准名称中“试验方法”改为“检测方法”；-将原标推中两套操作标准，合并成一套操作标准：NY/T 772—2013
一-将原标准中异硫氰酸胍提取RNA方法，改用商品化RNA提取试剂提取方法-将原标准中RT-PCR检测模式,改为商品化-步法RTPCR试剂盒的检测模式：一：-更新了检测H7亚型禽流感病毒的物序列.新增通用型JIA和NA基因全长的RT-PCR检测方法
更新了RT-ICR扩增产物与加样缓冲液进行混合的方法：增设检测流程，说明如何搭配使用此标准中含有的多对引物，实现不间的检测目的。本标准由中华人民共和国农业部兽医局提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，中国动物卫牛与流行病学中心。本标准主要起草人：王秀荣.刘朔，陈继、蒋文明，包红梅、陈化兰。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：-NY/T 772 -2004.
1范围
禽流感病毒RT-PCR检测方法
NY/T 772—2013
本标准规定了禽流感病毒型特异性RT-PCR(反转录一聚合酶链式反应）检测技术（各亚型通用），以及禽流感病毒H5、H7、H9血凝素(HA)亚型和N1、N2神经氨酸酶(NA)亚型的RT-PCR检测技术。
本标适用丁检测离组织、分泌物、排泄物和胚尿囊液中禽流感病毒的核酸2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注口期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，丸是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T18936高致病性禽流感诊断技术3实验室条件
3.1仪器
PCR仪、台式低温高速离心机、电泳仪、电泳槽、冰箱、紫外凝胶成像仪、微量移液器和水浴箱等，3.2操作区域
样品处理区要有相应成的生物安全设施，RNA提取区和RT-PCR配液区要求高度洁净中泳区要其他操作区域相互隔离。
3.3操作者
操作者应接受过RTPC.R技术培训：熟悉防止RNA降解、核酸污染和漠化乙锭污染的具体措施：熟悉RTICR检测结果的判断方法。4试剂的准备
4.1试剂
4.1.1商品化的RNA提取试剂盒。4.1.2商品化的一步法 RT-PCR试剂盒。4.1.31.5%琼脂糖凝胶，见A.1。4.1.41XTAE缓冲液：见A.2。
4.1.5溴化乙锭（10μg/ul)，见A.3。4.1.6核酸电泳加样缓冲液，见A.4。4.1.7商品化的DNA分厂量标准，要求在100bp～1000bp之间有5条以上的指示条带，4. 1. 8用已知的有与RT-PCR检测引物(附录 B)相对应的且灭活的离流感病毒制作的阳性对照标品（来白商品化试剂盆或者省部级以上的实验室）。4.1.9用高片灭菌的蒸馏水作为阴性对照标准品。4.2引物
序列见附录B,浓度均为10 umol/I,在RT-PCR反应体系的最终浓度是 0.4 umal/L。1
NY/T 772—2013
5操作程序
5.1样品采集和处理
按照GB/T18936中提供的方法进行。5.2对照设置
每次检测每对引物，用相应的阳性对照标准品和阴性对照标准品，至少设置一个或一个以1的阴件对照利样品对照。
5.3RNA提取
按照RNA提取试剂盒的说明·书，提取样品和对照的RNA。提取的RNA应随即进行检测.否则应十一70℃冻存。
5.4RNA扩增体系的配制
按照商品化的--步法RI-PCR试剂盒说明书,配制RTPCR反应体系，例如，在RTPCR管中,依饮加人DEPC水 13 uL、2×RT-FCR缓冲液25 μL、RT-PCR酶混合物2上下游引物（1unol/L)各2ul、待检测的RNA6l；如果同时进行多个样品的检测.可以按照.F述比例，将待测的RNA 以外的济液混合在一起,然后每个RT-PCR管中分别加人 44 μL 此混合液,再加入 6 μL对成样品的 RNA。对子采用 PCR管底部加热的 PCR 仪,衔管加样后，需要再加 PCR 专用的 20 μI.石蜡油。有时可以选择.总体积为25 μI.的RT：CR反应体系。5.5RT-PC反应
按一步法RTPCR试剂盒操作说明，设置反应条件，通常，第：步是RI,AMV反转录酶最适反应温度是42℃，MMLV反转录悔最适反应温度是37℃，还有一些反转录酶最适反应温度是50℃，反转录时问为30min;第二步是火活反转录嗨，95℃,3nin;第一步是CR，对引物反应条件见附录5.6RT-PCR产物电泳
RTPCR结束后.每个RT-PCR管加人5uL核酸电泳加样级冲液，密闭RTPCR管，充分混合，再每管取5μL～10μ加人琼脂糖凝胶板的加样孔中，在位于凝胶中央的孔加人DA分子量标谁。对F加封右蜡油的RTPCR扩增产物·需要吸取RT-PCR产物，按比例加人核酸电泳加择缓冲液充分混勾，加样后：按照每厘米凝胶5V电正，电泳20min～40min每次电脉时，每隔10min观察一次。当加样缓冲液中溴酚蓝电泳过半垒凝胶下2/5处时，叫停止电泳）。电泳后，置于紫外凝胶成像仪下观察，用分子量标准判断RTPCR扩增产物大小。5.7RT-PCR产物测序
RTPCR阳性扩增产物，HSangrr方法进行序列测定。6结果判定
6.1阳性对照出现相应人小的扩增条带，且阴性对照无此扩增带时，判定检测有效：否则，判定检测结果无效，不能进行下面的判断。6.2川附录B的M229或NP·330引物检测电泳出现对应大小的扩增条带，判定为禽流感病毒核酸阳性;否则，判定为离流感病毒核酸阴性。6.3用附录3中的H5380或H5545引物检测，电泳出现对应大小的扩增条带，判定为II5亚型禽流感再核酸阳性：活则，判为I亚型禽流感病毒核酸所性。6.4用附录B中的II7263引物检测，电泳出现对应人小的扩增条带，判定为II7、I110或II15亚型禽流感病毒核酸例性（对扩增产物进行测序分析，可以确定足H7亚型禽流感病毒核酸阳性，还是II1C或II15亚型禽流感病核酸阳性）；否则，判定为H7亚型禽流感病毒核峻阴性。6.5用附录B中的H9187引物检测，电泳出现对应大小的扩增条带，判楚为H9业型禽流感病毒核2
酸阳性;香则,判定为H9亚型禽流感病毒核酸阴性。NY/T772-2013
6.6附录B中的V1-358引物检测，电泳出现对应大小的扩增条带，判定为N亚型禽流感病毒核酸阳性;否则,判是为 N1 业型离流感病毒核酸阴性。6.7用附录B中的N2-377引物检测，电泳出现对应大小的扩增条带，判定为N2亚型禽流感病毒核酸阳性；否则，判定为N2亚型禽流感病毒核酸性。6.8用附录B中的HA-WL引物检测，电泳出现对应大小的扩增条带，判定为禽流感病毒核酸阳性；由于该方法灵敏度不高，电泳未出现对应大小的扩增条带，不能判定为离流感病毒核酸阴性。6.9用附录B中的NA-WL引物检测，电泳出现对应大小的扩增条带，判定为离流感病毒核酸阳性由于该方法灵敏度不高，电泳未出现对应大小的扩增条带，不能判定为禽流感病毒核酸阴性。7检测流程
7.1为确定样品是否含有离流感病毒或其核酸，用通用引物（如M-229或NP-330)检测7.2为确定样品是否含有某-（或某些）亚型的禽流感病毒或其核酸，用这一（或这些）亚型引物(如H5-380.H7-263.H9187)检测。7.3对于大量的待测样品，叫以先用通用引物M229或NP·33进行检测，确定样品是否含有禽流感病毒或其核酸。如果发现阳性样品·再用某一（或某些）亚型引物进行检测，确立样品是否含有这一(或这些)亚型的流感病葬的核酸。7.4对于人量的待测样品，如果其中流感病毒含量较高.也可以先用通用号[物HA-WL和/或NAWI.检测，确定样品是否含有禽流感病毒或其核酸。如果发现阳性样品·逊行扩增物的核酸序列测定,可以确立禽流感病毒的 IIA和/或 NA 亚型。3
NY/T772—2013
A.11.5%琼脂糖凝胶
琼脂糖
0.5×TAE电泳缓冲澈
附录A
【规范性附录】
相关试剂的配制
至 100 ml
微波炉中完全融化，待冷至50℃~60℃时，加溴化乙锭（EB）液5L，擦勺，倒入中泳板上，凝固后取下梳子，备用。
21XTAF电泳缓冲液
A. 2. 1配制 0. 5 mol/ L 乙二铵四乙酸二钠(EIXrA)溶液(pH8. 0)二水乙一铵四乙酸-钠
灭菌双蒸水
氯氨化钠下载标准就来标准下载网
灭削双燕水
A.2.2配制50×TAE电泳缓冲液
羟基甲基氨基甲烷(Tris）
0.5 mol/L乙二铵四乙酸一钠溶液（pH8.0)灭菌双蒸水
用时用灭菌双蒸水稀释50倍使用A.2.3配制1×TAE电泳缓冲液
50XTAE电泳缓冲液
灭菌双蒸水
A.3澳化乙锭(EB)溶液
溴化乙锭
火菌双蒸水
A.410×加样缓冲液
聚燕糖
灭菌双蒸水
一甲举
调至8.0
那至100m
加笔1000mL
加至000ml
至20 ml
100 mL
附录B
(规范性附录）
检测引物
检测引物名称、序列、特异性、基因等见表B.1。表B. 1
别物名称3物序列（上下两行分别为上下游引物序列）产物大小，特异件
（备选）
H5 -515
（备选）
HS - 487
N2-377
5'-TTCTAACGAGGTUGAAAC-3'
E'- AAGCGTCTACGCTGCAGTCC - 3'5' CAGRTACTGGGCIIATAAGRAC 3
5' GCAT'TGTCTLGAAGAAAIAAG
5'- GGGAGCAAAAGCAGGGG - 3
G' GGAGTAGAAACAAGGGTGTTIT
5'- GGGAGCAAAAGCAGGAGT - 3\5'-GAGTAGAAACAAGGAGTITTIT -3'AACFGAGTGTTEATTTTGTCAAT
AATGCACARGGAGGAGGAACT
R- ACACATGGYCARGACATALT- 3
5'-CTYTGRTTYAGTGTTGATGT- 3
S AATGTGARGAAGATGG 3
G'-CGCAIGTITCCATIYTT-3'
5' CTLACACAGAGCAYAATCG -3
5'GYACACTTGTTGITGTRTC3
5'- AT TRAAATACAAYGGYATAATAAC- 35'-GTUWEXXAAAAGYXACTGCA - 3'S-GGIGYAIAGCAIGGIUAGCIAAG - 35'- GAGUYTTUTARTTGTOTCTGCA 3'229 hp
中型通用
甲型通用
1778bp甲型通用
113bp中型通用
H业型
H5亚型
I业型
HS 型
N2亚型
NY/T 772—2013
[TR反应条件
94Y: 45 #.52℃ 45 s.72 1: s,35个循环
95℃ 30 s.50℃ 40 4,72℃ 45 s,35个循环
91℃ 45 5,57℃: 40 s,72℃: 3 m,35]个循环
94℃ 45 s,5745 s,723m,35
个循环
94℃45s52C45.72℃45#.35
个循环
94 30 s,55℃: 30 s,72℃ 301 3.35个循环
94'T 30 $,50℃ 30 s.72°℃: 3C s, 35个循环
95℃ 30 $+55℃ 40 #+72℃ 40 *, 35个循环
940 1 02C 45 5.72:45s35
个循环
9445$.52℃45,7245$+35
个循环
-A/G,H-A/C/T.
序列中含有的简并碱基W-A/T,Y =C/T,R基因
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中华人民共和国农业行业标准
NY/T 772--2013
代替NY/T772-2004
禽流感病毒RT-PCR检测方法
RT-PCR detection method for avian influenza viruses2013-09-10发布
2014-01-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准代替NY/T772—2004禽流感病毒RT-PCR试验方法》。本标准与NY/T772—2004相比，主要变化如下：将原标准名称中“试验方法”改为“检测方法”；-将原标推中两套操作标准，合并成一套操作标准：NY/T 772—2013
一-将原标准中异硫氰酸胍提取RNA方法，改用商品化RNA提取试剂提取方法-将原标准中RT-PCR检测模式,改为商品化-步法RTPCR试剂盒的检测模式：一：-更新了检测H7亚型禽流感病毒的物序列.新增通用型JIA和NA基因全长的RT-PCR检测方法
更新了RT-ICR扩增产物与加样缓冲液进行混合的方法：增设检测流程，说明如何搭配使用此标准中含有的多对引物，实现不间的检测目的。本标准由中华人民共和国农业部兽医局提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，中国动物卫牛与流行病学中心。本标准主要起草人：王秀荣.刘朔，陈继、蒋文明，包红梅、陈化兰。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：-NY/T 772 -2004.
1范围
禽流感病毒RT-PCR检测方法
NY/T 772—2013
本标准规定了禽流感病毒型特异性RT-PCR(反转录一聚合酶链式反应）检测技术（各亚型通用），以及禽流感病毒H5、H7、H9血凝素(HA)亚型和N1、N2神经氨酸酶(NA)亚型的RT-PCR检测技术。
本标适用丁检测离组织、分泌物、排泄物和胚尿囊液中禽流感病毒的核酸2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注口期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，丸是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T18936高致病性禽流感诊断技术3实验室条件
3.1仪器
PCR仪、台式低温高速离心机、电泳仪、电泳槽、冰箱、紫外凝胶成像仪、微量移液器和水浴箱等，3.2操作区域
样品处理区要有相应成的生物安全设施，RNA提取区和RT-PCR配液区要求高度洁净中泳区要其他操作区域相互隔离。
3.3操作者
操作者应接受过RTPC.R技术培训：熟悉防止RNA降解、核酸污染和漠化乙锭污染的具体措施：熟悉RTICR检测结果的判断方法。4试剂的准备
4.1试剂
4.1.1商品化的RNA提取试剂盒。4.1.2商品化的一步法 RT-PCR试剂盒。4.1.31.5%琼脂糖凝胶，见A.1。4.1.41XTAE缓冲液：见A.2。
4.1.5溴化乙锭（10μg/ul)，见A.3。4.1.6核酸电泳加样缓冲液，见A.4。4.1.7商品化的DNA分厂量标准，要求在100bp～1000bp之间有5条以上的指示条带，4. 1. 8用已知的有与RT-PCR检测引物(附录 B)相对应的且灭活的离流感病毒制作的阳性对照标品（来白商品化试剂盆或者省部级以上的实验室）。4.1.9用高片灭菌的蒸馏水作为阴性对照标准品。4.2引物
序列见附录B,浓度均为10 umol/I,在RT-PCR反应体系的最终浓度是 0.4 umal/L。1
NY/T 772—2013
5操作程序
5.1样品采集和处理
按照GB/T18936中提供的方法进行。5.2对照设置
每次检测每对引物，用相应的阳性对照标准品和阴性对照标准品，至少设置一个或一个以1的阴件对照利样品对照。
5.3RNA提取
按照RNA提取试剂盒的说明·书，提取样品和对照的RNA。提取的RNA应随即进行检测.否则应十一70℃冻存。
5.4RNA扩增体系的配制
按照商品化的--步法RI-PCR试剂盒说明书,配制RTPCR反应体系，例如，在RTPCR管中,依饮加人DEPC水 13 uL、2×RT-FCR缓冲液25 μL、RT-PCR酶混合物2上下游引物（1unol/L)各2ul、待检测的RNA6l；如果同时进行多个样品的检测.可以按照.F述比例，将待测的RNA 以外的济液混合在一起,然后每个RT-PCR管中分别加人 44 μL 此混合液,再加入 6 μL对成样品的 RNA。对子采用 PCR管底部加热的 PCR 仪,衔管加样后，需要再加 PCR 专用的 20 μI.石蜡油。有时可以选择.总体积为25 μI.的RT：CR反应体系。5.5RT-PC反应
按一步法RTPCR试剂盒操作说明，设置反应条件，通常，第：步是RI,AMV反转录酶最适反应温度是42℃，MMLV反转录悔最适反应温度是37℃，还有一些反转录酶最适反应温度是50℃，反转录时问为30min;第二步是火活反转录嗨，95℃,3nin;第一步是CR，对引物反应条件见附录5.6RT-PCR产物电泳
RTPCR结束后.每个RT-PCR管加人5uL核酸电泳加样级冲液，密闭RTPCR管，充分混合，再每管取5μL～10μ加人琼脂糖凝胶板的加样孔中，在位于凝胶中央的孔加人DA分子量标谁。对F加封右蜡油的RTPCR扩增产物·需要吸取RT-PCR产物，按比例加人核酸电泳加择缓冲液充分混勾，加样后：按照每厘米凝胶5V电正，电泳20min～40min每次电脉时，每隔10min观察一次。当加样缓冲液中溴酚蓝电泳过半垒凝胶下2/5处时，叫停止电泳）。电泳后，置于紫外凝胶成像仪下观察，用分子量标准判断RTPCR扩增产物大小。5.7RT-PCR产物测序
RTPCR阳性扩增产物，HSangrr方法进行序列测定。6结果判定
6.1阳性对照出现相应人小的扩增条带，且阴性对照无此扩增带时，判定检测有效：否则，判定检测结果无效，不能进行下面的判断。6.2川附录B的M229或NP·330引物检测电泳出现对应大小的扩增条带，判定为禽流感病毒核酸阳性;否则，判定为离流感病毒核酸阴性。6.3用附录3中的H5380或H5545引物检测，电泳出现对应大小的扩增条带，判定为II5亚型禽流感再核酸阳性：活则，判为I亚型禽流感病毒核酸所性。6.4用附录B中的II7263引物检测，电泳出现对应人小的扩增条带，判定为II7、I110或II15亚型禽流感病毒核酸例性（对扩增产物进行测序分析，可以确定足H7亚型禽流感病毒核酸阳性，还是II1C或II15亚型禽流感病核酸阳性）；否则，判定为H7亚型禽流感病毒核峻阴性。6.5用附录B中的H9187引物检测，电泳出现对应大小的扩增条带，判楚为H9业型禽流感病毒核2
酸阳性;香则,判定为H9亚型禽流感病毒核酸阴性。NY/T772-2013
6.6附录B中的V1-358引物检测，电泳出现对应大小的扩增条带，判定为N亚型禽流感病毒核酸阳性;否则,判是为 N1 业型离流感病毒核酸阴性。6.7用附录B中的N2-377引物检测，电泳出现对应大小的扩增条带，判定为N2亚型禽流感病毒核酸阳性；否则，判定为N2亚型禽流感病毒核酸性。6.8用附录B中的HA-WL引物检测，电泳出现对应大小的扩增条带，判定为禽流感病毒核酸阳性；由于该方法灵敏度不高，电泳未出现对应大小的扩增条带，不能判定为离流感病毒核酸阴性。6.9用附录B中的NA-WL引物检测，电泳出现对应大小的扩增条带，判定为离流感病毒核酸阳性由于该方法灵敏度不高，电泳未出现对应大小的扩增条带，不能判定为禽流感病毒核酸阴性。7检测流程
7.1为确定样品是否含有离流感病毒或其核酸，用通用引物（如M-229或NP-330)检测7.2为确定样品是否含有某-（或某些）亚型的禽流感病毒或其核酸，用这一（或这些）亚型引物(如H5-380.H7-263.H9187)检测。7.3对于大量的待测样品，叫以先用通用引物M229或NP·33进行检测，确定样品是否含有禽流感病毒或其核酸。如果发现阳性样品·再用某一（或某些）亚型引物进行检测，确立样品是否含有这一(或这些)亚型的流感病葬的核酸。7.4对于人量的待测样品，如果其中流感病毒含量较高.也可以先用通用号[物HA-WL和/或NAWI.检测，确定样品是否含有禽流感病毒或其核酸。如果发现阳性样品·逊行扩增物的核酸序列测定,可以确立禽流感病毒的 IIA和/或 NA 亚型。3
NY/T772—2013
A.11.5%琼脂糖凝胶
琼脂糖
0.5×TAE电泳缓冲澈
附录A
【规范性附录】
相关试剂的配制
至 100 ml
微波炉中完全融化，待冷至50℃~60℃时，加溴化乙锭（EB）液5L，擦勺，倒入中泳板上，凝固后取下梳子，备用。
21XTAF电泳缓冲液
A. 2. 1配制 0. 5 mol/ L 乙二铵四乙酸二钠(EIXrA)溶液(pH8. 0)二水乙一铵四乙酸-钠
灭菌双蒸水
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灭削双燕水
A.2.2配制50×TAE电泳缓冲液
羟基甲基氨基甲烷(Tris）
0.5 mol/L乙二铵四乙酸一钠溶液（pH8.0)灭菌双蒸水
用时用灭菌双蒸水稀释50倍使用A.2.3配制1×TAE电泳缓冲液
50XTAE电泳缓冲液
灭菌双蒸水
A.3澳化乙锭(EB)溶液
溴化乙锭
火菌双蒸水
A.410×加样缓冲液
聚燕糖
灭菌双蒸水
一甲举
调至8.0
那至100m
加笔1000mL
加至000ml
至20 ml
100 mL
附录B
(规范性附录）
检测引物
检测引物名称、序列、特异性、基因等见表B.1。表B. 1
别物名称3物序列（上下两行分别为上下游引物序列）产物大小，特异件
（备选）
H5 -515
（备选）
HS - 487
N2-377
5'-TTCTAACGAGGTUGAAAC-3'
E'- AAGCGTCTACGCTGCAGTCC - 3'5' CAGRTACTGGGCIIATAAGRAC 3
5' GCAT'TGTCTLGAAGAAAIAAG
5'- GGGAGCAAAAGCAGGGG - 3
G' GGAGTAGAAACAAGGGTGTTIT
5'- GGGAGCAAAAGCAGGAGT - 3\5'-GAGTAGAAACAAGGAGTITTIT -3'AACFGAGTGTTEATTTTGTCAAT
AATGCACARGGAGGAGGAACT
R- ACACATGGYCARGACATALT- 3
5'-CTYTGRTTYAGTGTTGATGT- 3
S AATGTGARGAAGATGG 3
G'-CGCAIGTITCCATIYTT-3'
5' CTLACACAGAGCAYAATCG -3
5'GYACACTTGTTGITGTRTC3
5'- AT TRAAATACAAYGGYATAATAAC- 35'-GTUWEXXAAAAGYXACTGCA - 3'S-GGIGYAIAGCAIGGIUAGCIAAG - 35'- GAGUYTTUTARTTGTOTCTGCA 3'229 hp
中型通用
甲型通用
1778bp甲型通用
113bp中型通用
H业型
H5亚型
I业型
HS 型
N2亚型
NY/T 772—2013
[TR反应条件
94Y: 45 #.52℃ 45 s.72 1: s,35个循环
95℃ 30 s.50℃ 40 4,72℃ 45 s,35个循环
91℃ 45 5,57℃: 40 s,72℃: 3 m,35]个循环
94℃ 45 s,5745 s,723m,35
个循环
94℃45s52C45.72℃45#.35
个循环
94 30 s,55℃: 30 s,72℃ 301 3.35个循环
94'T 30 $,50℃ 30 s.72°℃: 3C s, 35个循环
95℃ 30 $+55℃ 40 #+72℃ 40 *, 35个循环
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个循环
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个循环
-A/G,H-A/C/T.
序列中含有的简并碱基W-A/T,Y =C/T,R基因
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