NY/T 1433-2014 水稻品种鉴定技术规程 SSR标记法 NY/T1433-2014 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

ICS67.060
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 1433—2014
代替NY/T14332007
水稻品种鉴定技术规程
SSR标记法
Protocol for identification of rice varieties--ssR inarker method2014-03-24发布
2014-06-01实施
中华人民共和国农业部
规范性引用文件
术语猫定义
仪器设备及试剂
溶液配制
引物信息
操作程序
数据记录与统计
10判定方法
附录A（规范性附录）
附录（规范性附录）
附录C（规范性附录)
随录「（资料性附录）
仪器设备及试剂
溶液配制
推荐引物
参照品利名单
NY/T 1433—2014
NY/T1433--2014
本标雅按G31.1：2609给出的规则起草请注意木文件的某些内容可能涉及专利：本文件的发布机构不承担识别这些专利的贞任本标准为NY/T1433—20H7水智品种数定1NA指纹方法的修订版：本标准代替NY/11153207在品种案定中参号使用。本标推与NYT1133-2007相比，除编辑性修改外毛要技术变化如下：摔荐物增加到8对。其小：保留了原米13对引物、新增29对引物：增加水橘品种SSR标让数据记录与统计条：一逆加广变性丙烯胺凝胶电泳银染检测、纸管中泳荧光检测方法。标准出农业部利子管理局提出.
本标准出全国情物新品种测诚标准化技术委员会（SACC277）H11不标准起草单位：中国小韬研究所、农业部科技发展中心。本标涟主要起草人：徐群、魏兴华、生杰云、口波、袁筱萍、刘平、张新明、余汉虏、珺苑，本标准历次版本发布情况为：
-NY/1433—2007
1范围
水稻品种鉴定技术规程SSK标记法NY/T1433-2014
本标准规定利用筒单量复序列simplescquencreprts，ssR）标记进行水（rysuti1．）品利鉴定的操作程序、数据记示与统计、判定方法。本标准适用」水稻品利的SSR指纹数据采集及品神整定。2规范性引用文件
下列文件对」本义件的证足必不可少的。凡是注期的引用文件，仅注口期的版本适用丁本文件。凡足不注口期的引用文件：其最新版本（包括所有的修改单）造同于本文件，G4404.1粮食作物种了禾谷类
GB/T3513.2农作物种了检验规程打伴GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19557.7柏物新品种特异性、-致性利稳定性测试指南水稻
3术语和定义
下列术谱利定义适用于本文件。3.1
recommended priner
推荐引物
品种鉴定中优先选川的套SSR引物、其检测位点多态性尚，检测结果重复性好。3.2
中reference variety
参照品种
具有所用SSR位点上不同等位变异的品种。参照品种用丁辅助确定送检详品的等位变异，校正仪器设备的系统误差。
4原理
由于不同水稀品种遗传纠成不同：基因组「K简单重复序列的重复次数分差异这种差异川通过PCR扩增及电泳方法进行检测，从而能够区分不同品种，5仪器设备及试剂
见附录A.
6溶液配制
见附录，所用试剂均为分析纯。试剂配制用水应符合（GB/T6582规定的级水的要求，其中银染溶液的配制只需符合三级小的耍求。7引物信息
见附录（，分为「、Ⅱ，而、1组，其他在本文件中未推的非连锁引物也可使川，8操作程序
8.1样品准备
NY/T1433-2014
试验样品为种了时，其质量应符台（404.1中对水稻种了纯度的要求，税了样品的分栏和保，应符合（B/T3543.2的规定.每份栏品检测20今个体（种于，片或其他等效物）的混含样。8.2DNA 提取
最水帮叶片2~3m放人研体中，人DNA提取液O\：研摔，加人XA提取液uI.移取0uI混合液至l.m离心管。或直接将叶片剪砭放人2.0ml.离心管，管加入DNA提取液590，研伴，离心管加人550氯仿异成醇（21：1），振荡混匀：10000g离心5m。将上清滋0L转人另只1.5ml.离心管，用入800一20℃预冷二醇沉淀DNA1000离心10mn，弃上消液，再用70艺游溶液洗涤2追：自然条件下干燥店报人100TE（pH8.0）济液济解DNA.检测浓度，2℃保存留用，注：以上为择格的DNA提取方法：其他能够达到PCR扩增质量安求内INA提取左法都适用！本标准。8.3PCR扩增
8.3.1引物选择
差先选择附录（中1组引物进行扩增、当伴品间检测出的差异位点数小于2时，再选用附录（中Ⅱ组引物进行检测：若样品而检测出的累计差另位点数小于2时，再依次选用Ⅲ、纠引物。8.3.2反应体系
1l.的反应体积：包据1ut.70×PCR反应缓冲液、C.6Lmmol,LMg(l.、0.8μl2.smmul/1.dNTF液：1ul.μmo/正向物-nl,I.反物，(.2.2UlTaDNA聚合酶-35l.超统水，L样品DNA。书缓冲液含有Mgl，则个再加MgC溶液·以胡等体积无菌水萨代
8.3.3反应程序
%.预变性1 rim；91（变性15 5。50℃--67℃（根据附表C的引物设定退火温度）退火15s-72惩1min，头30个循坏：72.延仙8m，4保存。8.4PCR产物检测
8.4.1非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染检测8. 4.1.1凝胶制备
在一刘玻璃板间插人：C mm宽的间隔片，将陂璃板刘齐火紧，在封口处注人境脂溶液：让其在 1 mi~1 min凝剧密封。然在烧杯依次加人 5 m]5×TBF缓冲液：3. 75 m.丙烯酰胺与叉双内烯酰胺混合被，搅拌用双蒸水容至25m：加入2uL过硫酸铵和12LTEMELD，混匀府倒人凝胶板之间。随即插好样品梳：使其在0 mit1~6 min 内聚合固凝胶高度应不小丁 ema
8.4.1.2电泳
去掉封的琼脂糖胶：将坡璃板定于直电泳槽：在电泳裙中川人1缓冲液：小心批出梓品梳。在1elPCR样品中加人2l。6×漠酚蓝一二甲茉片电泳指示剂，混：然府而加样理中点人15：时，在一样品孔加人子量称比，开始电泳，选的也卡梯度为~5V/cm.一般也泳3r0VH--60\VH.其体时间川根据待测片段的预长度、按二甲苯青迁移的时问来推算。
8.4.1.3银染显色
电泳究毕关刚电源·政下坡璃板：小心分开两块坡璃极，取小聚丙烯酷胺凝胶，双蒸水冲溉30s-60 s，放人染色液中，轻择5li1~-19rin进行染色：然后从染色液中取出，用水快速源漂洗，放人显影液，轻至显位出清嗮带纹：瑕出用效蒸水冲洗？姆，沥：拉抽或拍摄成像，8.4.2变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染检测2
8.4.2.1清洗玻璃板
NY/T 1433—2014
将坡璃板清洗7净：用双热水冲洗片晾下。用无水乙醉擦洗2遍，吸水纸擦1，在长板上涂上0.5ml.案利件烷工作液．带凹槽的短板上涂0.5mL刹离硅烷工作液。操作过程中防止两块玻璃板互相污染，
8.4.2.2组装电泳板免费标准下载网bzxz
待玻璃板彻底下燥后组装成电泳装胃，并用水平仪调平，垫片淳度为0.1mm8. 4. 2.3制胶
在130m.6.（：聚丙烯酰胺凝胶中加入新制的1）%过硫酸铵溶液500L，EMF）50迅速混匀后灌胶：待胶液充满玻璃板夹层，将C，4m厚蜜鱼必梳了平齐端而甲轻轻插人胶液约2.4H，胶过程中防止山现气泡。使胶液聚合至少1以上。胶紧合后：清理胶板衰而溢岛的胶液，轻轻拨旧慌子，用水清洗净备用，8.4.2.4预电泳
将胶板安装了中泳槽上，向上槽+加人约mml.预热至6%的0.5>TEBE级冲液-使其超过凝胶顶部约3cm.向下槽中加人800ml.1TBE缓冲液，在60W恒功率下，预电泳10main-20min8.4.2.5样品制备
在1Cl.PCR样品中加人2mI6加样缓冲液，混勾，在PR仪上95℃变性5mim、取凹，速宵」冰上
8.4.2.6电泳
用移液器吹吸加样槽，清除气泡和杂质，将鲨色齿梳子梳齿端插人避胶1Imm~-2mm，每=个加样孔点人3元tl.样品除待测样品外，还应同引加1人参照品种-以30V/cm--V/cm的电用电泳，使凝胶温度保持在约50：电泳1.1~2.5h（电泳时间取决十扩增片段的大小范用）8.4.2.7银染显色
心泳结束，将凝胶附着的长玻璃板放入固定液中，使由定液没过凝胶，轻摇20in～3min取出胶板，用双蒸水漂洗1饮~2次每饮2inin：取出放人染色液中，使染色液没过凝胶：轻据20min～30 min：从染色液中取比胶板，用双蒸水快速漂湿：问不控过l0s；将胶板放人预冷的显影液巾，轻摇全出现清晰带纹，取出后迅速将凝胶放人固定液巾定影Enin：月双蒸水漂洗1min：取出后沥十，扫描或扩摄像，
8.4.3毛细暨电泳荧光检测
8.4.3.1PCR产物样品准备
分别取等体积的稀释后的不同炭光标记扰增产物溶液混合，从混合液中吸取1L加人到DNA分析仪专川36孔板孔中：板各孔分别加人0.1叫.分于量内孙和8.9去离-酷胺，将样品在IPR仪上95℃变性5nin：出，迅速置于冰上，冷却℃ min以士。瞬时离心1s历放1NA分析仪上，
8.4.3.2电泳检测
按照仪器操作丁斯。编辑样品表：执行运行程序，保数摄。9数据记录与统计
样品每个SSR位点的等位变异采用增片段长度的形式表示。对」普通聚丙烯酰按凝校心泳银染检测方法：将每个扩增位点的等位变异与相减的参照品种的等位交异片段人小逆行比较，确定送捡样品在该位点的等位变异，对」毛细管电泳荧光检测力法，道过使同参照品和，消除同型号不同批次问或不同型导A分析仪问可能存在的系统误差：使用开般分析软件读琅送检样品存该位点的等位变异。
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纯合位点的基因型数据记录为X/人，其中入为该位点等位变异的大小，杂合位点的基国型数据记录为X,Y：其中入，Y为该位点上两个小同的等位变导，小片段数据在前：人片毁数据在片。缺失位点等位变异数据记录为0/
示例1：
品种“竹”左RM21点上没扩增出条128bp的片段：该品种在该位点：的苯因型汇录为125/128。示例2：
品种“等优12”在RM21位点上有两个等险变异，尺小分别为117p，68hp：期该品神在洛位点的基型记聚为117：168
10判定方法
当样品问差异位点数2，则判定为“不同品种”：当样品间差异位点数·1：判定为“似品种”：与样品前差异位点数一。判定为“极近似品种戒相同品种”对于利刀录（中18对引物彻未检测到2个差异位点数的样品，可按R/19557.？的规是进行川间种鉴定
A.1仪器设备
A1.1PR扩增仪
附录A
(规范性附录）
仪器设备及试剂
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A.1.2高压电泳仪：最高电业不低了空000)V、只有恒电压、相电流和恒功率功能。A.1.3垂古电泳槽及配套的制胶附件A.1.4普递电泳仪。
A.1.5JDNA分析仪：基丁-志纽管电泳，有片段分析功能和数据分析软件。高速冷冻离心机：最大离心力不小于20000：4. 1.6
A.1.7水平摇床
A.1.8胶片观察灯.
屯子天平。
缴量移液器：规格分别为10l、20l、100u、200)ul、1000：连续可调邀力搅拌器.
核酸浓度测定仪或紫外分光光度计。微波炉，
高压灭菌锅。
酸度计，
普通冰箱
低温冰箱。
衛沫机。
组织破碎仪：
凝胶成像系统或紫外透射仪或照相机.A.2试剂
A.2.1十二烷基苯磺酸钠
聚乙烯吡咯烷啊
A.2.3氯仿。
A4.2.4异戊醇，
A2.5乙一胺四乙骏二钠。
A.2.6三羟站氮基甲烷
A.2.7浓缺酸。
A.2.8氢氙化钠。
10XPR反应缓冲液
NY/T14332014
A.2.10氯化镁。
A.2.11氯化纳。
A.2.124种脱氧核糖核酸。
A.2.13[1NA聚合酶，
A.2. 14SSR引物。叫物序列先附录CA.2.15石蜡油：
A.2.16琼脂糖
A.2.17DNA分『量标准：1NA片段分布范围至少在0bp~509h，该范围内DNA片殿之问大小般小差异不高下100p。
A.2.18去离子71酰胺。
溪蓝。
“甲苯青。
巾双双丙烯酰腰。
内烯酰胺，
尿素：
亲和硅。
剥离础。
无水乙醇
之胺。
过流酸铵
冰醋峻。
A.2.31硝酸银。
印醛。
A.2.33DNA分析仪用丙烯酰胺胶液A.2.34DNA分析仪川分量内标1.1750C。5TNA分析仪用光谱校准需质：包括FAM、NEI)、VIC和PEI4私1炭光标证的INA片段。A.2.35
LDNA分析仪用电泳缓冲液，
B.1DNA提取溶液的配制
（规范性附录】
溶液配制
B.1.10.5mol/L乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA）（pH8.0）溶液NY/T1433-2014
称取186.艺二胺四艺腋钢盐（Na2E1)1A·2H2(：加人800ml.水，再加入20g固体氢化钠（VaOH).搅拌。待Na:EITA·2H（）完全济解后、冷却至空温：冉VaOH准确调H至8.0，定容至1000m。在103.4kPa（12：℃）条件灭20mimB.1.20.5mol/L盐酸（HCI)溶液
带取25Im浓盐酸（36~38%），水定容至500mLB.1.31mcl/L三羟甲基氨基甲烷盐酸（Tris-HCI）（pH8.0）溶液量取25 rml.浓盐酸（36:38片），加水定穿食500mL称取.3三羟甲基氨基4烷（Tris碱）：溶于400ml.水中，0.5ml/1.酸溶液（1.1.2）询pH至8.定穿分a00m，在13.B.1.45mcl/L氯化钠溶液
称取116g系化销（Va1）溶于水，搅拌：加水定容牟500ml.，在103，4k1a（121（.）条件下灭菌20 nin
B.1.5DNA提取液
分别称服15g十：烷基苯磺酸钠（SDS），放人烧杯、分别加人40mI.乙胺四之酸钠盐济液（pJ8.0）（B.1.）、10m三经基氨基甲烷盐酸溶液（pH8.0）（B1.3）和100mL氯化钠溶液（B1.4），再加入800ml.水，搅拌济解。定穿至1000m：在103.1kFa（121℃）条件下火菌0 min，丁4℃保存，
B.1.6氯仿一异戊醇(24：1)
按21：1的比例（V：V）配制混合液B.1.770%乙醇溶液
取70ml.无水之醇、用水定容个：c00mlB.1.8TE缓冲液
分别量取5ml.羟甲基氨基币烷盐酸溶液（pH8.4）（B.1.3）和1ml.乙胺四乙段纳盐浴液（pH8.0）（H1.1)：定容至500 mb，布 103.1kPa i27 ）条件小火菌20 mn，于1保存B.2PCR扩增溶液的配制
B. 2. 1dNTP
历超纯水分别配制dATP、dT\TP、l(E、dTP种脱氧核糖核作酸终浓度为I0mnol/1.的偌存液。分别景1种储存液！.混台，而120.超纯水定荠，配而成每种核白酸终浓度为0mmol/1.的.1作液：在13.4k1a（121℃）条件下火菌20min，于一2c℃保存注：可月购关的满足试验要求的尚品试剂。B.2.2SSR引物
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用超纯小分别配制正尚引物和反向物浓度为ml，L的作液B.2.310XPCR缓冲液
含 500 mmol/1. Ke,100 mmol/1. Tris-1IC tp11 8. 3), 0. e1 / 明胺, 在 103. 4 kPa (121.条件下灭菌2 min，」20保存，
B.2.4氯化镁（MgCla）溶液
称敢氯化镁.19：超纯水济解：定容至5cn：配制成2mo的工作液，1.kPa（121）条件下双菌20 mim：十-20%保存。B.3聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制B.3.140%丙烯酰胺溶液
分别称取内烯酰胺10g和叉双肉烯酰胺1c：定容至500mLB.3.210%过硫酸铵溶液
称取1.过确酸铵，溶丁ml,水，混句。保存。B.3.310×TBE缓冲液
分别称取--甲基氢基甲烷（Tris碳）lc8和硼酸3：济丁800 mI水中，加人7ml.乙胺叫酸二钟盐溶液（H.0）（B1.），定容至00B.3.4:1×TBE缓冲液
量取10×T证缓冲液50℃ml，加水定垒5000ml。B.3.56×加样缓冲液
分别称版C2说勒蓝和0.2g苯青：分别加人98mI去离了甲酰哦和1机乙河之酸钠盐溶液（pH8.0）。搅拌溶解，B.3.66%变性聚丙烯酰胺胶溶液
称取求素420其：用水解，加人10×IEE缓冲液100mL、40内烯酰胺济液150mL，定容至Enoomnt.
B.3.7亲和硅烷缓冲液
分别量取49.75ml.无水乙醇和250μL冰醋酸用水定穿个50mL.B.3.8亲和硅烷工作液
在1ml亲和硅烷缓冲液中加人5ul.亲和硅烷原液，混句，B.3.9剥离硅烷工作液
在98ml.的三氯巾烷溶液中尼2mL甲基氯佳烷溶波，混勺B.4银染溶液的配制
B.4.1固定液
量取1o.冰酷酸：加水定容至1or:ml.B.4.2染色液
称取：硝酸银：加水溶，定容至100mLB.4.3显影液
量联000ml.水，加人10氢氧化5ml.巾，混R
推荐引物见表C.1
引物「染色体
1RM336
引物别
巡火温度
（规范性附录]
推荐引物
表 C.1推荐引物
引将序列（3）
ri间：agatratuttgugHHgng
反向：grgaaciegrgitgaue
H向：agagstancungat
反间：gggtgngcgaglzalraig
正向：
cceaagalgnacggnig
：arargeigagcagc
正向：arga
向: xgagaugargaalglllge:
1定间：recurintgngagrcg
成向：ErecalcHeiccegg
Ehl:rgleiateirargacec
成向：1kaeglhlltugag
正间：tlazayagnaggeiteg
这可：CRRUglleakGg
Hhl: reegcgr.oazacanige.g
向：BaCtecDGTARR
正向：RRigaiag:
友hj：can'eggonticgceg
Eln：ggtaytaaggtariraca:
成向：iataelanteut
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案见等位
交异。bp
参照品种
台汀18
Tastnhse
CPY2:90
安育1号
齐粒塑
元产占程
行公籍
川卓1号
，阴兹「
陪州草1号
红亮老来有
元！占稻
广刚楼号
至克米青
Tsuksslakexl
Koshihikar
Yurretro:no
桂花黄
阳阜号
元子情
陆川早！
J'nsarilwers
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