NY/T 2311-2013 黄曲霉菌株产毒力鉴定方法 NY/T2311-2013 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

ICS65.020
中华人民共和国农业行业标准
NY/T2311-2013
黄曲霉菌株产毒力鉴定方法
Identification method of the toxigenicityof Aspergillus ftavus strains2013-05-20发布
2013-08-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草NY/T2311--2013
本标准出农业部种植业管理司提出并如口：本标准起草单位：中国农业科学院油料作物研究所、农业部油料及制品质量监督检验测试中心。本标准主要起草人：李培武、李再、黄家权、丁小鼓、白艺珍、周海燕、雷永、唐晓倩T
1范围
黄曲霉菌株产毒力鉴定方法
本标准规定了黄齿爵菌株产毒力鉴定方法。本标准适用于黄曲菌株产毒力鉴定。2规范性引用文件
Y/T2311-2013
下列文件对了本文件的应用是必不可少的。凡是注月期的引用文件，仅注乃期的版本适用于本文件，凡是不注日期的孕用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。(B/76682分析实验室用水规格和试验方法3原理wwW.bzxz.Net
对待检黄曲霉菊株进行微生物培养.通过镜检初步对黄曲霉菌进行鉴定。再对黄曲霉菌株进行产培养，采用高效液相色谱法检测其黄曲毒素含量，确定菌株产毒力。4试剂与材料
除非另有规定，所用试剂均为分析纯或生化试剂，试验用水应符合（B/T6682中一级水的规格，4.1蔗糖：化学纯。
4.2硫酸铵(NIL)SO：化学纯。
4.3磷酸二氢钾(KIIP）：化学纯。4.4硫酸镁（MgSO·7H,O)：化学纯。4.5硼酸钠（NaBO·1CH2O)：化学纯4.6钒酸铵[(NH.）。Mo702·4H2()]:化学纯。4.7乙胺四Z酸二钠（CHN.Na:O）：化学纯。4.8硫酸亚铁(FeSO·7H2O)：化学纯。4.9硫酸铜（CuSO·5H,0)：化学纯。4.10
硫酸锰(MnS，·H)：化学纯。
4.11硫酸锌(2nS0,·7H2O)：化学纯。4.12硝酸钠(NaNO))：化学纯，
4.13氯化钾（KCI)：化学纯。
4.14琼脂：水分22%，灰分~3%。4.15氯化钠(NaCI)：化学纯。
4.16甲醇(CH,CH)：化学纯
4.17次氯酸钠溶液：有效氯10%，4.18苯一乙腈：取2ml.乙情加人98mL苯。4.1970%巾醇水溶液（含4%NaCl)：称取1g（精确至0.01g)NacI游解到30ml.水中，再加人甲醇定容 100 mL:
4.201%吐温水：999ml.水中加人1rL叶温-20.混句后121℃高压灭菌20min、冷却待用。1
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4.210.1岁次氧酸钠：1ml.次氯酸加水定容至100mL。4.22黄州毒素BI、黄而霉毒索B、黄曲霉毒素G.和黄曲都毒素G2标推（AFB:、AFB、AFCi、AFG：）样品：纯度98%。
4.23黄霉毒素标储备液准确称敢黄曲霉毒素B,、黄曲毒素B、黄曲毒素（G和黄曲露群素G，标准样品.用苯--乙晴（4.18)配制或0.100mg/ml.的储备液。4.24黄曲霉素混合标准工作液：准确移取黄曲霉毒素B.、黄曲霉帮索B，、黄曲霉毒素G：和黄曲霉素G2标准储备液，用苯一乙晴（4.18）游液稀释成混合标准工作液（AFB与AFG1：2必/L、5g/L、10 μ8/L.15 μg/ I.,20 μg/1.:AFB2 5 AFG2:0. 6 μg/I.1. 5 μg/L.3 μg/1.,4. 5 μg/L.6 μg/L).4.25察氏培养基：准确称取硝酸钠3. 00g，磷酸氢-二钾1. 00g硫酸镁0.50g，氯化钾(.50g·硫酸业铁0.01g，蒸糖30.00g琼脂20.00g，加水定容至1000ml.，加热溶解，三角瓶5Cml分装后121℃灭菌20 min
4.26察氏培养基平板：灭菌后察氏培养基冷却至60℃左右，倒15mL.至无菌培养I（内径9ctn）.冷后无菌密封，4.保存（一周内使用）。4.27产毒培养基：准确称量蔗糖50g·硫酸铵3g，磷酸二氧钾10g，硫酸镁4.09g，硼酸钠0.0007g银酸铵0.0005离，乙二胺四乙酸二钠0.193%硫酸业铁0.0128%硫酸铜0.0005g：硫酸锰0.000】g硫酸锌0.03g，琼脂粉1Cg.加水加热溶解，定容全」I..调整pH=5.7.121℃高压灭菌20mit1a5仪器设备
5.1高效液和色谱仪配FLD检测器，5.2分析天平：感量心01%。
5.3高速均质器（12001/mim)。
5.4具离心管；10ml
5.5250nL分液漏斗，
5.6其塞三角瓶:150ml.m
5.7恒温恒湿培养箱。
5.8显微镜。
5.9生物安全柜。
5.10高斥灭菌锅。
5.11恒温揉床。
5.12培养Ⅲ：内径为 9 c1。
5.13有机滤膜:0.22μm
6舞菌鉴定
6.1菌种准备
准确称取待检样25g（精确至0.1g），用225mL无菌水搅匀作为原液，吸取1ml.依次10倍递进稀释到适当浓度。
6.2需菌分离培养与初步鉴定
分别取各浓度的菌种稀释液200L涂布丁察低培养基平板（4.26）上.于25℃--28℃培养箱中培养3小一6d从平板上无菌挑取单菌落接种于新的察氏培养基乎板上，划线分离培养，培养条件同上，待长出单菌落后.在显微镜下观察，进行饱子的形态学鉴定（观察菌落人小、形态、特征或孢子的形态特征）。2
6.3产毒力检测
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6.3.1产毒培养
取吐温水（4.20）洗涤察氏培养基中的黄曲等孢子，震荡摇勾，制成抱子总浮液，用缸球计数板在显微镜下计算孢了浓度。将约10°个炮子均勾涂布接种于装有灭菌的产毒培养基培养Ⅲ（4.27）中，置恒温恒湿培养箱28℃培养7d。
6.3.2黄曲霉毒素提取
称取6.3.1培养物重量，转移至250ml.具塞三角瓶中，按6：1的质最比加人甲醇水溶液（4.19）。于摇床上振荡10min，用定量滤纸过滤，收集滤液。取2.0mL滤液过有机滤膜（5.13），收集滤液检测用。
6.3.3高效液相色谱条件
流动相：甲醇水溶液：45mL甲醇加55ml.水；进样量：10μL：
流速:0.8mL/min;
柱温：30℃；
C18色谱柱：150nx25 mm,4.6μm;FLD检测器：激发波长3G5nm，发射波长430nm。6.3.4定置检测
用进样器吸10ul.黄曲霉毒素混合标准工作液（4.24）注人高效液机色谱仪，在上述色谱条件下测定标准溶液的响应值（峰高或峰面积），黄曲霉毒素、黄曲霖毒素β、黄曲霉毒素G，和黄州霉毒素，标准溶液高效液相色谱图。参考谱图见图1，30
乐留耐间min
1黄曲霉毒素B,、黄曲霉毒素B2、黄曲群毒素G，和黄曲霉毒素G，标准谱图在上述色谱条件下测定试样的响应值（峰高或峰面积）。经过与黄曲需毒素标准溶液谱图比较删应值得到试样中黄曲霉毒素31，黄曲霉导素B.黄曲霉毒素（G，利黄曲舒毒素（：的浓度6. 4空自试验
参照6.3方法对空白产毒培养基进行处理，处理液样品代替试样，做空自对照试验。警告：应山具有资格的［.作人员进行产毒力检测，检测过程所有度奔物需经121高压灭菌处理30min店再齐置，黄此毒毒素污染而具及器而用0.1%的次氯酸钠处理消毒7黄曲霉菌株产毒力测定结果计算黄曲霉菌株产毒力以X，计，以每千克培养基中含有的黄曲零毒素总最的微克数表示，按式（I）计3
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式中，
Xt=(G-C)xV
每T克培养基中黄曲霖毒素B1黄曲素B、黄曲等毒素G和黄曲等毒素G的含单位为微克每干克（ug/kg）：
（一试验培养基黄曲霉素黄曲霉毒素 B、黄曲毒素G和黄曲霉毒素，的含量，单位为微克每升(ug/);
空白试验培养基中黄曲霉毒素B、黄曲霉毒素B黄曲霉素（C，和黄叫霹毒素（：的含C
董，单位为微克每升（1/L)：
m·试验培养基质量，单位为克(g)：样品提取液总体积，单位为毫升(ml）黄曲霉春素总量为黄曲霉毒素B.、黄曲霉毒素B、黄曲霉母素索G和黄曲源毒素G的浓度之和，计算结果表示到小数点后两位。8精密度
8.1重复性
在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于算术半均值的10%，以人于70%的情况不超过5%为前提。
8.2再现性
在再现性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不丁算术平均值的20%，以大丁20%的情况不超过5%为前提。
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