NY/T 2470-2013
基本信息
标准号： NY/T 2470-2013
中文名称：小麦品种鉴定技术规程 SSR分子标记法
标准类别：农业行业标准(NY)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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出版信息
相关单位信息
标准简介
NY/T 2470-2013 小麦品种鉴定技术规程 SSR分子标记法
NY/T2470-2013
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标准内容
ICS65.020.20
中华人民共和国农业行业标准
NY/T2470—2013
小麦品种鉴定技术规程
SSR分子标记法
Protocol for the identification of wheat varietiesSsR marker method2013-12-13发布
2014-04-01实施
中华人民共和国农业部
规范性引用文件
术语和定义
仪器设备及试剂：
溶液配制
引物·
操作程序
等位变异数据采集
10判定标准
晰录A(规范性附录)
附录B(规范性附录）
附录C(规范性附录)
附录I(资料性附录
仪器设备及试剂
溶液配制
核心引物，
参照品种名单
NY/T 2470—2013
NY/T2470—2013
本标准按照G/T1.1—2009给出的规则起草请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标滩山农业部种子管理局提出。本标准出全国植物新品种测试标准化技术委员会（SAC/I℃277)归口。本标准起草单位：山东省农业科学院作物研究所、农业部科技发展中心本标准主要起草人：李汝玉、张哈、工东建、孙加梅、姚凤霞、郑永胜、许金芳、段丽丽、李华。1范围
小麦品种鉴定技术规程SSR分字标记法NY/T2470—2013
本标准规定了利用简单重复序列(Sinplcscquencercpcats，SSR分了标记进行普通小麦（TriticumuesioumI.)品种鉴定的试验方法、数据记录格式和判定标准。本标准适用丁普通小麦DNA分子数据的采集和品种鉴定。2规范性引用文件
下列义件对于本文件的应用是必不可少的。凡足注日期的引文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用丁不文件。GB/T3513.2农作物种子检验规程GB/T19557.2植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南普通小麦3术语和定义
下列术语和凝义适用于本文件。3.1
核心引物
f core priver
多态性好、PCR扩增稳定的一套 SSR引物。3.2
参照品种refercnce varicty
对应丁SSR位点上不同等位变异的一组品种。参照品种用丁辅助确定待测样品等位变异的大小，校正仪器设备的系统误差
4原理
SSR分布于小麦基因组的不同位置上，不同品种付个位点上重复单位的数口及序列可能不同，由十个简单重复序列两侧的序列是高度保守和单拷贝的，因而可根据其两侧的列设计对特异引物，利用CR技术对重复序列行扩增，得到的PCR产物在电泳过程中的电场作用下，内汀分了量人小不同得到分离，经硝酸银染色或者荧光染料标记检测区分开。出丁不同小麦品种遗传组成不同，所以，根据引物IDNA序列存在差异或引物结合部位之间的DNA片段大小存在差异.即可鉴定小麦品和，5仪器设备及试剂
仪器设备及试剂见附录A。
6溶液配制
相关游液配制方法见附录I3。
7引物
引物相关信息见附录（。
8操作程序
8.1样品准备
NY/T2470—2013
种子样品的分样和保存，应符合GB/T3543.2的规定每份样品检测10个个体（种子、叶片或其他等效物），混合分析。对-致差的样品每个个体单独分析。
8.2DNA提取
8.2.1幼苗中DNA的提取
将小麦种子发芽。取10株幼嫩组织约0.1g，剪碎，放人1.5mL离心管巾，将DNA提取液热到65℃，每管加入400ul.，将样品研碎。将离心管置丁65℃金属浴或水浴锅上，保温30min后取下。离心管中人400l.24：1（氯仿异戊醇）（V：V）.振荡混勺，室温静置30min。10000g离心5min。将上清液200μl.转人另--只1.5ml.离心管，加人300uL一20%预冷乙醇沉淀DNA。10000g离心1min弃上清液，加人500ul.乙醇·乙酸氨溶液，6000g离心5min收集沉淀。加人100ul.TE(pII8.0)溶液溶解IDNA,检测DNA浓度，一20℃保存。8.2.2干种子中INA的提取
将10粒种子研锌，混合后称取约0.2g，放入离心管中，每管加人600uI.预热到65℃的DNA提取液，置丁65℃金属上。其余步骤同8.2.1注：以上为排荐的DNA提取方法：所获DNA质量能够符合HCR扩增需要的DNA提取方法都适用于不标准，8.3PCR扩增
8.3.1参照品种的使用
在逊行PCR扩增和等位变异检测时，应同时包括机应的参照品种。不同位点的等位变异的参照品种的名称见附录（,参见附录D。同名称不向来源的参照品种的某位点十的等位变异可能不机同在使川前，成与原参照品种进行核对，对于附录C中未包括的等位变异，应按本标准的方法，通过使用DXA分析仪与参照品种同时进行检测确定其大小，注：多个品种在某-位点上可能都具有相同的等位变异，在确认这些品种某一位点上等位变异大小师这些品种也可以代替附录（：中的参照品种使用。8.3.2反应体系
25 μL的反应体积（或 12. 5 μl,)，含每种dVTP 0.25 mmol/1.,正向引物0. 4 μmol/L反问引物0.4umol/I.TayDNA聚合酶1.0单位，1×PCR缓冲液（不含Mg），MgCl，1.5mmol/I，样品DNA40ng
利用IXA分析仪检测吋使用炭光标记的引物，种引物的荧光染料种类见附录（。注：这应体系的体积可以根据具体情况进行调整。8.3.3反应程序
94℃预变性4min：94℃变45s50℃65℃（可根据附录C推荐的引物退火温度设定）退火45s72%延伸45s，共35个循环；72℃延伸10min，4℃保存8.4PCR 产物检测
8.4.1变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染检测8.4.1.1清洗玻璃板
将玻璃板清洗十净，用去离子水冲洗底晾用儿水乙醇擦洗两遍，吸水纸擦。在长板上涂上0.5ml.亲和硅烷工竹液，带凹槽的短板上.涂0.5ml刺离硅烷I作液，操作过程中防止两块玻璃板可相污染。
8.4.1.2组装电泳板
待玻璃极彻底干燥标组装成电泳装置，并用水平仪调平。热片厚度为0，1InIn。8.4.1.3制胶
在190In6.0%PAGE胶中加入新配制的10%过硫酸铵溶液500ul.T上MEI)50L,迅速混勺后2
NY/T2470—2013
灌胶。待胶液充满玻璃板火层.将0.4mm厚鲨鱼齿梳子平齐端向里轻轻捕入胶液约0.4cm，灌胶过程中防止出现气池。使胶液聚合至少h以士。胶合后，清理胶板表而溢出的胶液，轻轻拔山梳了，用水清洗下净备用。
8.4.1.4预电泳
将胶极安装于电泳槽上，向上槽中加1人约800ml预热至65℃的0.25×TBF缓冲液，使其超过凝胶顶部约3ct，向下槽中加入800mI.1×IBE缓冲液。在60W恒功率下，预电泳10min～20min。8.4.1.5样品制备
在25L（或12.5μL)PCR样品加人10μL(或5L)上样缓冲液，混勾。在水浴锅或PCR仪上95变线5 min,取出-迅速置于碎冰.8.4.1.6电泳
用注射器吸取缓冲液冲洗凝胶顶端儿次，清除气泡和聚内烯酰胺碎片，将鲨鱼齿梳广梳齿端播人凝胶1mm~2mm。每一个加样孔点人2ul~3μL样品。除待测样品外，还应佩时加人参照品种。以30V/cm~40V/cm的电主电泳，使凝胶温度保持在约50℃，电泳1.5h~2.5h电泳时间取决+扩增片段的人小范围），电泳结束斥，小心分开两块玻璃板，取下凝胶附养的长玻璃板准备固定。8.4.1.7银染
a）固定：将凝胶附着的长玻璃板置于塑料盒中，加人约1000mL银染固定液，使固定液没过凝胶，在摇床上轻轻光动20 nin-~30 min；漂洗：取山玻璃板，在去离了水中漂洗1次～2次，每次2minb
染色：将玻璃板置放人约1000ml.染色液中,使染色液没过凝胶，在摇床上轻轻无动30tnin;d）漂洗：在去离了水中快速漂洗，时间不超过10 s；）显影:将玻璃板在预冷的显影液中轻轻光动至出现清晰带纹定影：将凝胶布固定液中定影5min：f)
g）漂洗：在去离了水中漂洗1min。8.4.2毛细管电荧光检测
8.4.2.1[CR产物样品准备
将6-FAM和HEX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，TAMRA和ROX荧光标记的PCR产物稀释10倍。分别取等体积的上述1种稀释后济液混个.从混介液中吸取1tl. 如入到TDNA分析仪专用深孔板孔中。板中各孔分别加0.1μI.I.IZ500分子景内标和8.9μL离子中酰胺。将样品在PCR仪上95℃变性5min.取出,立即置十碎球上,冷却10 min以上。瞬吋离心10后置放到INA分析仪上
注：不同荧光标记的扩增产物的最适稀释倍数最好通过预试验确定。8.4.2.2开机准备
打开DNA分析仪，检否仪器工作状态，史换缓冲液，灌胶，将装有样品的深孔板置放于样品架基座上，打Ⅱ数据收集软件。
8.4.2.3编板
按照仪器操作程序，创建电泳板，输入电泳板名称，选择适合的程序和电泳板类型，输人样品编号或名称。
8.4.2.4运行程序
IDNA分析仪自动将毛细管电泳数据运行参数等存放在仪器中。9等位变异数据采集
9.1数据表示
NY/T 2470—2013
样品每个SSR位点的等位变异采用扩增片段长度的形式表示。如同·样品不同个体间等位变另人小不一致，以个体间比例最高的等位变异大小代表。9.2变性聚丙烯凝胶电泳与银染检测将待测样品某一位点扩增片段的萨型和泳动位置与机应的参照样品进行比较，与待测样品扩增片段带型和泳动位置相同的参照样品的扩增片段大小即为待测样品该位点的等位变异大小。9.3毛细管电泳荧光检测
使用LNA分析仪的片段分析软件，读出每个位点每个样品的等位变异人小数据。通过使用参照品种，消除同型号不同批次问或不同型号NA分析仪间可能存在的系统误差。比较参照品种的等位变异大小数据与附录（中的数据，如两者不一致，确定系统误差的大小：从待测样品的等位变异数据中去除该系统误差，得到的数据即为待测样品该位点的等位变异大小，9.4结果记录
纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X，其中X为该位点等位变异的人小；杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异。小片段在前.人片段在后。无效等位变异的大小记录为0/0
示例1：一个品种在XgT2357-1A位点上有1个等位变异人小为123P，则该品种在该位点上的等位变异数据证求为123/123。
示例2:一个品种在Xum357-1A位点上有2个等位变异,大小别为123bp、123bp.则该品种在该位点上的等位变异数据记录为123/125。
10判定标准
10.1直接比较
10.1.1对待测品种和对照同时进行检测（“直接比较*)时，先用附录C中21个位点的基本核心引物检测，获得待测品种和对照在这些引物位点的等位变异数据，利用这些数据进行品种间比较：a）品种间差异位点数≥3,判定为不同品种；b）品种间差异位点数一1或2,判定为相近品种；r）品种间差异位点数一0.判为极近似品种。10.1.2对10.1.1b)或10.1.1c)的情况，继续用21个位点的扩展核心引物进行检测，利用全部位点的等位变异数据进行品种间比较：a）品种间差异位点数3,判定为不同品种：b）品种间差异位点数=1或2,判定为近似品种；）品种间差异位点数一0,判定为疑同品种对于10.1.2b)和10.1.2c)的情况.按照GB/T19557.2的规定进行田间鉴定。10.2数据库比较
刘待测品种进行检测后利其检测数据和数据库中品种的数据逊行比对（“数据库比较”）时，利川附录C中21个位点的基木核心引物检测，获得待测品种在上述引物位点的等位变异数据，利用这些数据和数据库中的品种进行比较：a）品种间差异位点数3,判定为不同品种；h）品种问差异位点数一2,判定为机近品种；c）品种问差异位点数一0或1，判定为疑同品，对10,2b)或10.2c)的情况，将这些相近品种或疑同品种按GI3/T19557.2的规定进行扭间鉴定。4
仪器设备
A. 1 1 CR 扩增仪。
附录A
【规范性附录】
仪器设备及试剂
高压电泳仪：最高电压不低十2000V.具有恒电压、恒电流和恒功率功能。A. 1.2
3电泳摄及配套的制胶附件。
A.1.4普通电泳仪。
A.1.5水平电泳槽及配套的制胶附件。A. 1. 6
差异。
NY/T2470—2013
DNA分析仪：基丁毛细管电泳，有片段分析功能和数据分析软件，能够分辨最少1个核凸酸的A. 1.7
高速冷冻离心机：最大离心力不小于20000g。A. 1.8
水平摇床。
A 1.9胶片观察灯。
，电子大平。
微量移液器：规格分别为10μL、20mL、100L、200μL、1000μL.连续可调。A. 1. 12
磁力搅拌器，
紫外分光光度计。
微波炉。
高压灭锅。
酸度计：
水裕锅或金属浴：控温精度=1℃A. 1. 18
昔通冰箱。
低温冰箱，
制冰机。
凝胶成像系统或紫外透射仪。bzxZ.net
A.2试剂
十六烷基三乙基溴化铵。
聚乙烯吡咯烧酮。
A.2.3氯仿
A.2.4异戊醇。
A.2.5乙二胺四乙酸一钠。
一羟甲基氨基甲烷。
A.2.7浓盐酸。
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氢氧化钠。
10xRuler缓冲液。
氯化镁。
氯化钠。
4种脱氧核糖核皆酸。
Ta DNA 聚合酶。
SSR「物。引物序列见附录C。
矿物油。
琼脂糖。
DNA分了量标准：DNA片段分布范围为50bp500bp，该范围内DNA片段之间大小晨小差异不高100hp。
核酸染色剂，
去离了甲酰胺。
溴蓝。
甲苯青，
甲叉双丙烯酰胺。
丙烯酰胺。
尿素。
亲和硅烷。
刻离硅烷。
无水乙醇。
四甲基乙二鞍，
过硫酸铵。
冰醋酸.
乙酸铵。
硝酸银。
甲醛。
IDNA分析仪用烯酰胺胶液
DNA分析仪川分了量内标：最人分了量500hp,Liz标记，A. 2.37
LXA分析仪用光谱校准本质，包括G-FAM.TAMARA、HFX和 ROX等4种荧光标记的DNA片段。
IA分析仪用电泳缓冲液，
除作另有说明，仅使用分析纯试剂。B.1DNA提取溶液的配制
附录B
【规范性附录】
溶液配制
B.1.10.5mol/L乙二胺四乙酸二钠盐(EIYTA)(pH8.0)溶液NY/T2470--2013
称取186.1g乙二胺四艺酸-钠盐（NazELTA·2HzO），人80U1nL去离子水，再加人20固休氢氧化钠(NaOH)，搅拌。待NaEDTA·2H2()光全溶解后，冷却至室温，再用NaOH溶液(B.1.1)准确调pH至8.0.定容至1000ml，在103.4kPa(121℃）条件下灭菌20min，B. 1. 21 mol/ L 三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCL)(pI 8. 0)溶液称取60.55羟甲基氨基甲烷（Tris碱），溶丁400mL去离子水中，用0.5mol/盐酸济液调pH至8.0,定容至 500ml,在103.4kPa(121℃)条件下灭菌20 min.B. 1. 3 0. 5 mul/ L 盐酸(HCI)溶液量取25mL浓盐酸（36%~38%），加水定容至500ml.。B.1.4LDNA提取液
分别称取20.0%1六烷基三乙基溴化铵（CTAB)和81.82gNaC1.放人烧杯巾，分别加入40mI.乙二胺四乙酸一钠盐溶液（pH8.0)(B.1.3）、100mL1mol/l、羟甲基氮基甲烷盐酸溶液（pII8.0)（I.1.1)和10.0g聚乙烯吡咯烧酮（PVT)，再加人800mL去离了水，65℃:水浴中加热溶解，冷却后定容至1000ml。在103.4kPa<121℃）条件下灭菌20min。于1℃保存。B.1.524：1氯仿一异戎醇
按24：1的比例(V：V)配制混合液。B.1.6乙醇一乙酸氨溶液
称取151.6mg乙酸胺，加入140ml.无水乙醇，用离子水定容至200ml.B.1.7TE缓冲液
分别量取5mL三羟甲氨基烷盐酸溶液（pH8.0)(I.1.2)和1mL乙二胺四乙二钠盐溶液（pH8.0)(B1.3），定容至500ml，在103.4kPa(121℃）条件下灭菌20min，于4℃下保存。B.2PCR扩增溶液的配制
B.2. 1 dNTP
用超纯水分别配制dATP、dTTP、dGTP、dCTP1种脱氧核糖核苷酸终浓度为130mro1/L的储存液。分别量取1种储存液20μL混合，用120μl.超纯水定容，配制成每种核节酸终浓度为1U1mtmol/L的T作液，在103.4kPa（121℃）条件下火菌20min，于一20℃保存注：可用购买的满足试验要求的商品试剂。B.2.2SSR引物
用水分别配彻正向引物和反向引物在浓度为5u1ol/L的1作液。B.2.310×PCR缓冲液
含500 mmol/LKCl,100mmul/L Tris-HCl(pII8.3),0.01%明胶。在103.1kPa(121℃)条件下7
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火菌20 min，2
20℃保存荐
R.2.4氯化镁（MgClz)溶液
称取氯化镁1.100g，用去离子水溶解，定容至500mL配制成25mmol/1.的工作液，在103.4kP:(121℃)茶件下灭菌20 min，一20保存。B.3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制B.3.140%丙烯酰胺溶液
分别称取丙烯酰胺190g和甲叉双内烯酰胺10g+定容至50mL。B.3.26%变性聚丙烯酰胺胶溶液
称取尿素420g.用去离子水溶解加入10×TBE缓冲液100mL.40%丙烯酰胺溶液150mL定容至 1 000 m1。
B.3.3亲和硅烷缓冲液
分别量取49.75ml.无水乙醇和250lL冰醋酸.用去离子水定容至501mL。B.3.4亲和硅烷工作液
在1ml.亲和硅烷缓冲被中加人5mL亲和硅烷原液，混匀B.3.5剥离硅烷工作液
在 98 mI.的二氯下烷溶液十加2m1.二基一氯硅烷溶液,混勺B.3.610%过硫酸铵溶液
称取1.0过硫酸铵，游于10 nL尽离子水中，混匀，于一4℃保行，B.3.710×TBE缓冲液
分别称取三羟甲基氨基甲烷(Tris碱)108.0和硼酸55.0g，济十800ml.离子水中，加人37ml乙二胺四乙酸二盐溶液量取10×TBE缓冲液500mL，加去离子水定容至5000ml.sB.3.96×加样缓冲液
分别称取0.25溴酚蓝和0.25多一中苯青：分别加人98ml.去离子甲酰胺和1ml.乙二胺叫乙酸钠盐溶液（pH8.0).搅拌溶解。
B.4银染溶液的配制
B.4.1固定液
量取100 ml.冰醋酸,加去离子水定容至1 000 ml.。B.4.2染色液
称取1多硝酸银，加去离子水溶解，定容至1000mLB.4.3显影液
量取1000n离了水人 10g氢氧化钠和m甲醛,混C. 1 基本核心引物
见表℃ 1。
Xgum35?1A
Xharf1-IB
XgdmI ID
Xixrc:-2A
Xgum29-2R
附录C
(规范性附录】
核心引物
表 C. 1 基本核心引物
引物序列(5'-→3')
F:TATGGTCAAAGTTGGACCTCX
R:AKGIKGCAGCICTICTTCAG
F.FGCATACATIGATTCATAACTETCT
R:TCTTCGAGOGTTATGATTGA1
F,CACTCACUUCAAACCAAAGT
R:GATGCAATCGGGTCGTTAGT
F:GETXIGGAXGTTTICTATTTT
R:GOGTTGGGAATTTCTGAACATITT
F:TTGTACATTAAGTTUOCATTA
R: TTTAAGGACCTAEATGACAC
5'TAMRA
5' - FAM
S'TIEX
5'TAMRA
NY/T 2470—2013
退火温度等位变异
参照品种
运享618
豫农010
泰麦号
轩锈材料21
豫农010
新冬33号
开麦18
泰山23号
攀枝花：
川农210
聋拉头
京冬12
西昌19
兰引1号
抗杆锈材料-31
磐麦2号
郑+：09379
运早618
龙麦30
川农210
空5号
郑丰5号
薯麦2·号
遗传所3519
京冬12
龙辐麦18
中麦 {：
静2049-12
兰引1号
鹤麦1·号
微红20
川农210
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附录C(规范性附录)
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核心引物，
参照品种名单
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本标准按照G/T1.1—2009给出的规则起草请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标滩山农业部种子管理局提出。本标准出全国植物新品种测试标准化技术委员会（SAC/I℃277)归口。本标准起草单位：山东省农业科学院作物研究所、农业部科技发展中心本标准主要起草人：李汝玉、张哈、工东建、孙加梅、姚凤霞、郑永胜、许金芳、段丽丽、李华。1范围
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多态性好、PCR扩增稳定的一套 SSR引物。3.2
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对应丁SSR位点上不同等位变异的一组品种。参照品种用丁辅助确定待测样品等位变异的大小，校正仪器设备的系统误差
4原理
SSR分布于小麦基因组的不同位置上，不同品种付个位点上重复单位的数口及序列可能不同，由十个简单重复序列两侧的序列是高度保守和单拷贝的，因而可根据其两侧的列设计对特异引物，利用CR技术对重复序列行扩增，得到的PCR产物在电泳过程中的电场作用下，内汀分了量人小不同得到分离，经硝酸银染色或者荧光染料标记检测区分开。出丁不同小麦品种遗传组成不同，所以，根据引物IDNA序列存在差异或引物结合部位之间的DNA片段大小存在差异.即可鉴定小麦品和，5仪器设备及试剂
仪器设备及试剂见附录A。
6溶液配制
相关游液配制方法见附录I3。
7引物
引物相关信息见附录（。
8操作程序
8.1样品准备
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种子样品的分样和保存，应符合GB/T3543.2的规定每份样品检测10个个体（种子、叶片或其他等效物），混合分析。对-致差的样品每个个体单独分析。
8.2DNA提取
8.2.1幼苗中DNA的提取
将小麦种子发芽。取10株幼嫩组织约0.1g，剪碎，放人1.5mL离心管巾，将DNA提取液热到65℃，每管加入400ul.，将样品研碎。将离心管置丁65℃金属浴或水浴锅上，保温30min后取下。离心管中人400l.24：1（氯仿异戊醇）（V：V）.振荡混勺，室温静置30min。10000g离心5min。将上清液200μl.转人另--只1.5ml.离心管，加人300uL一20%预冷乙醇沉淀DNA。10000g离心1min弃上清液，加人500ul.乙醇·乙酸氨溶液，6000g离心5min收集沉淀。加人100ul.TE(pII8.0)溶液溶解IDNA,检测DNA浓度，一20℃保存。8.2.2干种子中INA的提取
将10粒种子研锌，混合后称取约0.2g，放入离心管中，每管加人600uI.预热到65℃的DNA提取液，置丁65℃金属上。其余步骤同8.2.1注：以上为排荐的DNA提取方法：所获DNA质量能够符合HCR扩增需要的DNA提取方法都适用于不标准，8.3PCR扩增
8.3.1参照品种的使用
在逊行PCR扩增和等位变异检测时，应同时包括机应的参照品种。不同位点的等位变异的参照品种的名称见附录（,参见附录D。同名称不向来源的参照品种的某位点十的等位变异可能不机同在使川前，成与原参照品种进行核对，对于附录C中未包括的等位变异，应按本标准的方法，通过使用DXA分析仪与参照品种同时进行检测确定其大小，注：多个品种在某-位点上可能都具有相同的等位变异，在确认这些品种某一位点上等位变异大小师这些品种也可以代替附录（：中的参照品种使用。8.3.2反应体系
25 μL的反应体积（或 12. 5 μl,)，含每种dVTP 0.25 mmol/1.,正向引物0. 4 μmol/L反问引物0.4umol/I.TayDNA聚合酶1.0单位，1×PCR缓冲液（不含Mg），MgCl，1.5mmol/I，样品DNA40ng
利用IXA分析仪检测吋使用炭光标记的引物，种引物的荧光染料种类见附录（。注：这应体系的体积可以根据具体情况进行调整。8.3.3反应程序
94℃预变性4min：94℃变45s50℃65℃（可根据附录C推荐的引物退火温度设定）退火45s72%延伸45s，共35个循环；72℃延伸10min，4℃保存8.4PCR 产物检测
8.4.1变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染检测8.4.1.1清洗玻璃板
将玻璃板清洗十净，用去离子水冲洗底晾用儿水乙醇擦洗两遍，吸水纸擦。在长板上涂上0.5ml.亲和硅烷工竹液，带凹槽的短板上.涂0.5ml刺离硅烷I作液，操作过程中防止两块玻璃板可相污染。
8.4.1.2组装电泳板
待玻璃极彻底干燥标组装成电泳装置，并用水平仪调平。热片厚度为0，1InIn。8.4.1.3制胶
在190In6.0%PAGE胶中加入新配制的10%过硫酸铵溶液500ul.T上MEI)50L,迅速混勺后2
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灌胶。待胶液充满玻璃板火层.将0.4mm厚鲨鱼齿梳子平齐端向里轻轻捕入胶液约0.4cm，灌胶过程中防止出现气池。使胶液聚合至少h以士。胶合后，清理胶板表而溢出的胶液，轻轻拔山梳了，用水清洗下净备用。
8.4.1.4预电泳
将胶极安装于电泳槽上，向上槽中加1人约800ml预热至65℃的0.25×TBF缓冲液，使其超过凝胶顶部约3ct，向下槽中加入800mI.1×IBE缓冲液。在60W恒功率下，预电泳10min～20min。8.4.1.5样品制备
在25L（或12.5μL)PCR样品加人10μL(或5L)上样缓冲液，混勾。在水浴锅或PCR仪上95变线5 min,取出-迅速置于碎冰.8.4.1.6电泳
用注射器吸取缓冲液冲洗凝胶顶端儿次，清除气泡和聚内烯酰胺碎片，将鲨鱼齿梳广梳齿端播人凝胶1mm~2mm。每一个加样孔点人2ul~3μL样品。除待测样品外，还应佩时加人参照品种。以30V/cm~40V/cm的电主电泳，使凝胶温度保持在约50℃，电泳1.5h~2.5h电泳时间取决+扩增片段的人小范围），电泳结束斥，小心分开两块玻璃板，取下凝胶附养的长玻璃板准备固定。8.4.1.7银染
a）固定：将凝胶附着的长玻璃板置于塑料盒中，加人约1000mL银染固定液，使固定液没过凝胶，在摇床上轻轻光动20 nin-~30 min；漂洗：取山玻璃板，在去离了水中漂洗1次～2次，每次2minb
染色：将玻璃板置放人约1000ml.染色液中,使染色液没过凝胶，在摇床上轻轻无动30tnin;d）漂洗：在去离了水中快速漂洗，时间不超过10 s；）显影:将玻璃板在预冷的显影液中轻轻光动至出现清晰带纹定影：将凝胶布固定液中定影5min：f)
g）漂洗：在去离了水中漂洗1min。8.4.2毛细管电荧光检测
8.4.2.1[CR产物样品准备
将6-FAM和HEX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，TAMRA和ROX荧光标记的PCR产物稀释10倍。分别取等体积的上述1种稀释后济液混个.从混介液中吸取1tl. 如入到TDNA分析仪专用深孔板孔中。板中各孔分别加0.1μI.I.IZ500分子景内标和8.9μL离子中酰胺。将样品在PCR仪上95℃变性5min.取出,立即置十碎球上,冷却10 min以上。瞬吋离心10后置放到INA分析仪上
注：不同荧光标记的扩增产物的最适稀释倍数最好通过预试验确定。8.4.2.2开机准备
打开DNA分析仪，检否仪器工作状态，史换缓冲液，灌胶，将装有样品的深孔板置放于样品架基座上，打Ⅱ数据收集软件。
8.4.2.3编板
按照仪器操作程序，创建电泳板，输入电泳板名称，选择适合的程序和电泳板类型，输人样品编号或名称。
8.4.2.4运行程序
IDNA分析仪自动将毛细管电泳数据运行参数等存放在仪器中。9等位变异数据采集
9.1数据表示
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样品每个SSR位点的等位变异采用扩增片段长度的形式表示。如同·样品不同个体间等位变另人小不一致，以个体间比例最高的等位变异大小代表。9.2变性聚丙烯凝胶电泳与银染检测将待测样品某一位点扩增片段的萨型和泳动位置与机应的参照样品进行比较，与待测样品扩增片段带型和泳动位置相同的参照样品的扩增片段大小即为待测样品该位点的等位变异大小。9.3毛细管电泳荧光检测
使用LNA分析仪的片段分析软件，读出每个位点每个样品的等位变异人小数据。通过使用参照品种，消除同型号不同批次问或不同型号NA分析仪间可能存在的系统误差。比较参照品种的等位变异大小数据与附录（中的数据，如两者不一致，确定系统误差的大小：从待测样品的等位变异数据中去除该系统误差，得到的数据即为待测样品该位点的等位变异大小，9.4结果记录
纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X，其中X为该位点等位变异的人小；杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异。小片段在前.人片段在后。无效等位变异的大小记录为0/0
示例1：一个品种在XgT2357-1A位点上有1个等位变异人小为123P，则该品种在该位点上的等位变异数据证求为123/123。
示例2:一个品种在Xum357-1A位点上有2个等位变异,大小别为123bp、123bp.则该品种在该位点上的等位变异数据记录为123/125。
10判定标准
10.1直接比较
10.1.1对待测品种和对照同时进行检测（“直接比较*)时，先用附录C中21个位点的基本核心引物检测，获得待测品种和对照在这些引物位点的等位变异数据，利用这些数据进行品种间比较：a）品种间差异位点数≥3,判定为不同品种；b）品种间差异位点数一1或2,判定为相近品种；r）品种间差异位点数一0.判为极近似品种。10.1.2对10.1.1b)或10.1.1c)的情况，继续用21个位点的扩展核心引物进行检测，利用全部位点的等位变异数据进行品种间比较：a）品种间差异位点数3,判定为不同品种：b）品种间差异位点数=1或2,判定为近似品种；）品种间差异位点数一0,判定为疑同品种对于10.1.2b)和10.1.2c)的情况.按照GB/T19557.2的规定进行田间鉴定。10.2数据库比较
刘待测品种进行检测后利其检测数据和数据库中品种的数据逊行比对（“数据库比较”）时，利川附录C中21个位点的基木核心引物检测，获得待测品种在上述引物位点的等位变异数据，利用这些数据和数据库中的品种进行比较：a）品种间差异位点数3,判定为不同品种；h）品种问差异位点数一2,判定为机近品种；c）品种问差异位点数一0或1，判定为疑同品，对10,2b)或10.2c)的情况，将这些相近品种或疑同品种按GI3/T19557.2的规定进行扭间鉴定。4
仪器设备
A. 1 1 CR 扩增仪。
附录A
【规范性附录】
仪器设备及试剂
高压电泳仪：最高电压不低十2000V.具有恒电压、恒电流和恒功率功能。A. 1.2
3电泳摄及配套的制胶附件。
A.1.4普通电泳仪。
A.1.5水平电泳槽及配套的制胶附件。A. 1. 6
差异。
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DNA分析仪：基丁毛细管电泳，有片段分析功能和数据分析软件，能够分辨最少1个核凸酸的A. 1.7
高速冷冻离心机：最大离心力不小于20000g。A. 1.8
水平摇床。
A 1.9胶片观察灯。
，电子大平。
微量移液器：规格分别为10μL、20mL、100L、200μL、1000μL.连续可调。A. 1. 12
磁力搅拌器，
紫外分光光度计。
微波炉。
高压灭锅。
酸度计：
水裕锅或金属浴：控温精度=1℃A. 1. 18
昔通冰箱。
低温冰箱，
制冰机。
凝胶成像系统或紫外透射仪。bzxZ.net
A.2试剂
十六烷基三乙基溴化铵。
聚乙烯吡咯烧酮。
A.2.3氯仿
A.2.4异戊醇。
A.2.5乙二胺四乙酸一钠。
一羟甲基氨基甲烷。
A.2.7浓盐酸。
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氢氧化钠。
10xRuler缓冲液。
氯化镁。
氯化钠。
4种脱氧核糖核皆酸。
Ta DNA 聚合酶。
SSR「物。引物序列见附录C。
矿物油。
琼脂糖。
DNA分了量标准：DNA片段分布范围为50bp500bp，该范围内DNA片段之间大小晨小差异不高100hp。
核酸染色剂，
去离了甲酰胺。
溴蓝。
甲苯青，
甲叉双丙烯酰胺。
丙烯酰胺。
尿素。
亲和硅烷。
刻离硅烷。
无水乙醇。
四甲基乙二鞍，
过硫酸铵。
冰醋酸.
乙酸铵。
硝酸银。
甲醛。
IDNA分析仪用烯酰胺胶液
DNA分析仪川分了量内标：最人分了量500hp,Liz标记，A. 2.37
LXA分析仪用光谱校准本质，包括G-FAM.TAMARA、HFX和 ROX等4种荧光标记的DNA片段。
IA分析仪用电泳缓冲液，
除作另有说明，仅使用分析纯试剂。B.1DNA提取溶液的配制
附录B
【规范性附录】
溶液配制
B.1.10.5mol/L乙二胺四乙酸二钠盐(EIYTA)(pH8.0)溶液NY/T2470--2013
称取186.1g乙二胺四艺酸-钠盐（NazELTA·2HzO），人80U1nL去离子水，再加人20固休氢氧化钠(NaOH)，搅拌。待NaEDTA·2H2()光全溶解后，冷却至室温，再用NaOH溶液(B.1.1)准确调pH至8.0.定容至1000ml，在103.4kPa(121℃）条件下灭菌20min，B. 1. 21 mol/ L 三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCL)(pI 8. 0)溶液称取60.55羟甲基氨基甲烷（Tris碱），溶丁400mL去离子水中，用0.5mol/盐酸济液调pH至8.0,定容至 500ml,在103.4kPa(121℃)条件下灭菌20 min.B. 1. 3 0. 5 mul/ L 盐酸(HCI)溶液量取25mL浓盐酸（36%~38%），加水定容至500ml.。B.1.4LDNA提取液
分别称取20.0%1六烷基三乙基溴化铵（CTAB)和81.82gNaC1.放人烧杯巾，分别加入40mI.乙二胺四乙酸一钠盐溶液（pH8.0)(B.1.3）、100mL1mol/l、羟甲基氮基甲烷盐酸溶液（pII8.0)（I.1.1)和10.0g聚乙烯吡咯烧酮（PVT)，再加人800mL去离了水，65℃:水浴中加热溶解，冷却后定容至1000ml。在103.4kPa<121℃）条件下灭菌20min。于1℃保存。B.1.524：1氯仿一异戎醇
按24：1的比例(V：V)配制混合液。B.1.6乙醇一乙酸氨溶液
称取151.6mg乙酸胺，加入140ml.无水乙醇，用离子水定容至200ml.B.1.7TE缓冲液
分别量取5mL三羟甲氨基烷盐酸溶液（pH8.0)(I.1.2)和1mL乙二胺四乙二钠盐溶液（pH8.0)(B1.3），定容至500ml，在103.4kPa(121℃）条件下灭菌20min，于4℃下保存。B.2PCR扩增溶液的配制
B.2. 1 dNTP
用超纯水分别配制dATP、dTTP、dGTP、dCTP1种脱氧核糖核苷酸终浓度为130mro1/L的储存液。分别量取1种储存液20μL混合，用120μl.超纯水定容，配制成每种核节酸终浓度为1U1mtmol/L的T作液，在103.4kPa（121℃）条件下火菌20min，于一20℃保存注：可用购买的满足试验要求的商品试剂。B.2.2SSR引物
用水分别配彻正向引物和反向引物在浓度为5u1ol/L的1作液。B.2.310×PCR缓冲液
含500 mmol/LKCl,100mmul/L Tris-HCl(pII8.3),0.01%明胶。在103.1kPa(121℃)条件下7
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火菌20 min，2
20℃保存荐
R.2.4氯化镁（MgClz)溶液
称取氯化镁1.100g，用去离子水溶解，定容至500mL配制成25mmol/1.的工作液，在103.4kP:(121℃)茶件下灭菌20 min，一20保存。B.3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制B.3.140%丙烯酰胺溶液
分别称取丙烯酰胺190g和甲叉双内烯酰胺10g+定容至50mL。B.3.26%变性聚丙烯酰胺胶溶液
称取尿素420g.用去离子水溶解加入10×TBE缓冲液100mL.40%丙烯酰胺溶液150mL定容至 1 000 m1。
B.3.3亲和硅烷缓冲液
分别量取49.75ml.无水乙醇和250lL冰醋酸.用去离子水定容至501mL。B.3.4亲和硅烷工作液
在1ml.亲和硅烷缓冲被中加人5mL亲和硅烷原液，混匀B.3.5剥离硅烷工作液
在 98 mI.的二氯下烷溶液十加2m1.二基一氯硅烷溶液,混勺B.3.610%过硫酸铵溶液
称取1.0过硫酸铵，游于10 nL尽离子水中，混匀，于一4℃保行，B.3.710×TBE缓冲液
分别称取三羟甲基氨基甲烷(Tris碱)108.0和硼酸55.0g，济十800ml.离子水中，加人37ml乙二胺四乙酸二盐溶液
分别称取0.25溴酚蓝和0.25多一中苯青：分别加人98ml.去离子甲酰胺和1ml.乙二胺叫乙酸钠盐溶液（pH8.0).搅拌溶解。
B.4银染溶液的配制
B.4.1固定液
量取100 ml.冰醋酸,加去离子水定容至1 000 ml.。B.4.2染色液
称取1多硝酸银，加去离子水溶解，定容至1000mLB.4.3显影液
量取1000n离了水人 10g氢氧化钠和m甲醛,混C. 1 基本核心引物
见表℃ 1。
Xgum35?1A
Xharf1-IB
XgdmI ID
Xixrc:-2A
Xgum29-2R
附录C
(规范性附录】
核心引物
表 C. 1 基本核心引物
引物序列(5'-→3')
F:TATGGTCAAAGTTGGACCTCX
R:AKGIKGCAGCICTICTTCAG
F.FGCATACATIGATTCATAACTETCT
R:TCTTCGAGOGTTATGATTGA1
F,CACTCACUUCAAACCAAAGT
R:GATGCAATCGGGTCGTTAGT
F:GETXIGGAXGTTTICTATTTT
R:GOGTTGGGAATTTCTGAACATITT
F:TTGTACATTAAGTTUOCATTA
R: TTTAAGGACCTAEATGACAC
5'TAMRA
5' - FAM
S'TIEX
5'TAMRA
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退火温度等位变异
参照品种
运享618
豫农010
泰麦号
轩锈材料21
豫农010
新冬33号
开麦18
泰山23号
攀枝花：
川农210
聋拉头
京冬12
西昌19
兰引1号
抗杆锈材料-31
磐麦2号
郑+：09379
运早618
龙麦30
川农210
空5号
郑丰5号
薯麦2·号
遗传所3519
京冬12
龙辐麦18
中麦 {：
静2049-12
兰引1号
鹤麦1·号
微红20
川农210
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