NY/T 2471-2013
基本信息
标准号： NY/T 2471-2013
中文名称：番茄品种鉴定技术规程 Indel分子标记法
标准类别：农业行业标准(NY)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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相关单位信息
标准简介
NY/T 2471-2013 番茄品种鉴定技术规程 Indel分子标记法
NY/T2471-2013
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标准内容
ICS 67.080.20
中华人民共和国农业行业标准
NY/T2471-2013
番茄品种鉴定技术规程
Indel分子标记法
Identification of tomato varieties--Indel marker method2013-12-13发布
2014-04-01实施
中华人民共和国农业部
规范性引用文件
术语和定义
原理·
仪器设备及试剂
溶液配制
引物·免费标准bzxz.net
参照品种及来源·
操作程序
10等位变异数据采集
11判定标准
附录A(规范性附录）
仪器设备及试剂
附录B(规范性附录）
济液配制·
附录C(规范性附录）
附录D(资料性附录)
核心引物
参照品种
NY/T 2471--2013
NY/T2471—2013
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。木文件的发布机构不承担识别这些专利的质任本标准由农业部种了管理局提出。本标准由全国植物新品种测试标准化技术委员会（SAC/TC277)归口。本标准起节单位：国农业科学院蔬菜花卉研究所、农业部科技发展中心。本标准主婆起草人：高建昌、朴永正、王孝宣、国艳梅、于宗鸿、莫青。1范围
Indel分子标记法
番茄品种鉴定技术规程
NY/T2471—2013
本标准规定了利用插人/缺失序列（InsertionandIeletionScquence，Indel)分子标记进行普通番加（Sotarumlycopersicum.L.）品种的鉴定方法、数据记录格式及判定标准，本标准适用于番茄IDNA分子数据的采集和品种鉴定。2规范性引用文件
下列文件对十本文件的成用是必不可少的。凡是注日期的引文件，仅注日期的版木适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适川于本文件。GB/T3543.2农作物种子检验规程3术语和定义
下列术语和定义适用于本义件。3.1Indel标记
指物种间或物种内在基因序列上存在的短的插入或缺失序列。根据这种插入或缺失序列逊行基网分型的标记称为Indel标记。
4原理
插人缺失序列(Indel)广泛分布于番茄基内组中，因插入或缺失片段大小的不同而在不同品种中表现出片段长度的多态性。每个插入缺失序列存在3种状态，纯合（A），纯合（B)和杂合（TI），根据其两端序列设计特异引物，利用PCR技术进行几的片段扩增。电泳过程中，不同大小的PCR产物在电场的作用下被分离，经硝酸银染色或者荧光染料标记加以区分，因此，根据Indel位点的多态性，结合PCR扩增和电泳技术能够鉴定番茄品种。5仪器设备及试剂
仪器设备及试剂名单见附录A。
6溶液配制
相关溶液配制方法见附录B
7引物
引物机关信息见附录（。
8参照品种及来源
参照品种及来源参见附录I)。
9操作程序
9.1重复设置
设定2欲生物学重复。
NY/T2471—2013
9.2样品准备
和子样品的钎样、分样和保存，按期GB/T3543.2的规定进行。每个品种分取2份样品，每份样品取30个个体（叶片或其他器），等量混合9.3DNA提取
采用GTAB法：取番茄幼叶20mg~30IIg至2.0ml.离心管中，液氮中研碎。加入750μL预热的DNA提取液.勺，55℃水浴或金属浴45min，加入750μI氯仿异戊醇L24：1（V：V)_提取液，上下混匀3min；4℃.13500g离心5min；吸500μL上清液至一只2.0rrL离心管中，加人等体积氯仿异戊醇提取液，上下混句3min：13500g离心5min；吸400ul上清液至新的离心管中，加入800μL预冷无水乙醇，4放置1h以上沉淀DNA：10000离心1min，弃上清液，用75%乙醇漂洗2次，离心后弃清液，白然风十；加人100μLtldHURNase50：1（V：V)缓冲液，震荡溶解，检测DNA浓度，一20℃保存备用。
注：以上为推存的种INA提取方法。所获TNA质量能够符合PCR扩增需要的DNA提取方法都适用于本标谁。
9.4PCR扩增
9.4.1参照样品的使用
在进行1（R扩增和等位变片检测时.应同时包括相应的标准样品。不同位点的标准样品的名称见附录。某位点上具有相同的等位变异的标准样品可能不止·个，在确认这些样品在某·位点上的等位变异大小后，也可将这些样品代菩附录C中的标准样品。同-名称不同来源的标准样品在某--位点上的等位变异可能不相同，在使用前成与原标准样品行核对
注：多个而种在某，位点上可能都具有相同的等位变异。在确认这些品种某一位点上等位变异大小后，这些品种也可以代替附录（中的标准样品使用。9. 4.2 反应体系
20l.CR反应体系包括：含基因组DNA50ng，正、反向引物各0.5mol/IPmmcga公司2XMix(DNA聚合酶、dATP和Mg\+等常规PCR所含成分)1OL利用毛细管中泳荧光检测时，使用荧光标记的引物。引物的炭光染料种类见附录（。9. 4. 3反应程序
9.4.3.1普通引物PCR反应程序
94℃预变性3min；94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸90$，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
9.4.3.2荧光引物PCR反应程序
95℃预变性5min：94%变性30s，50℃退火405，72℃延伸10s.35个循坏，72℃延伸10min；4%保存，
9.5等位变异检测
9.5.1非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳9.5.1.1电泳装置准备
所用装置为垂直电泳槽（玻璃板规格为216mm×110mm）：将聚丙烯酰胺垂直电泳槽中的玻璃板洗净，晾干后装人胶框；依次将两块胶板装入电泳槽巾，较短的胶板朝外，将螺丝拧紧，然后用1%琼脂糖凝胶封住胶框下面以防漏胶。9.5.1.28%非变性凝胶制作
按表1配方进行凝胶制作。
20聚丙烯酰胺丹液
10XTBE
超纯水
1C外过硫酸铵
表18%聚丙烯酰胺凝胶配方
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9.5.1.3灌胶、点样
凝胶混勾后快速倒入玻璃板夹层中，插入梳子。待胶凝固1h后，拨掉梳了，用0.5%TI3E冲洗加样孔，再用移液器或吸水纸吸十加样孔中的水分，然后点样。每个加样孔上样量2l.（1uL.FCR产物中加入2上缓冲液混匀）。
9.5.1.4电泳
向胶槽中倒入电泳缓冲液（0.5%TBE)，电泳电压为160V.电泳吋间为1.5h2.5h(电泳指示剂至适当位置时）。
9.5.1.5银染检
固定：固定液中轻播4min，固定1次，回收剧定液：a)
银染，染色液中染色10min；
显影：显影液中轻摇至主带完全显现：c
d）定影：用步骤a)中回收固定液定影30；清洗：蒸馏水轻摇清洗1min；
F）保存：将清洗后的胶平铺在P膜上，包好后在可见光灯箱1照相保存。9.5.2变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染检测9.5.2.1清洗玻璃板
将玻璃板反复探洗T净，双蒸水擦洗2遍，95%乙醇擦洗2遍T燥。在长极」涂上0.5mL亲和硅烷工作液，带凹摊的短板上涂0.5mL剥离硅烷工作液。操作过程中防止2块玻璃板互相污染，9.5.2.2组装电泳板
待玻璃板彻底干燥后组装电泳板，并用水平仪调平。9.5.2. 3灌胶
取60ml.6%的聚丙烯酰胺胶（根据不同型号的电泳槽确定胶的用量和合适的灌胶片式），300μl）过硫酸铵APS)和60I四甲基乙一胺(1EMEI)轻轻混勾，将胶缓缓地灌入，灌胶过程中防止现气泡。当胶到底部后将板放置水平，将梳了插适当位置，并用夹了夹紧，以防漏胶。聚合2h以！用丁电泳
9.5.2.4预电泳
将梳子小心拔出，川洗瓶清洗干净」样孔·然后擦干玻璃板。将电泳槽装配好后，在电泳槽加人1XTBE。在恒功率70W条件下预电泳30min。9.5.2.5变性
在R产物中加人3ul.6×加样缓冲液.混匀后在PCR仪上运行变性程序：95℃变性5min，然后文即置于冰上冷却，使DNA保持单链状态。9. 5.2.6电泳
预电泳结束后，将胶面的气泡及杂质吹打下净，将梳子轻轻插人，其深度为刚进入胶面1mm。每个加样孔点入5uL样品。70W恒功率电泳至上部的指示带到达胶板的中部。电泳结束后，小心分开2块玻璃板，凝胶会紧贴在长板上。3
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9. 5.2.7银染(同 9. 5. 1. 5)
9.5.3INA分析仪检测
9.5.3.1样品准备
首先根据不间的炭光基团将ICR产物稀释-定的倍数。一般6-FAM荧光基闭PCR产物稀释80倍，HEX、ROX、TAMRA荧光基闭PCR产物稀释30倍。然后分别取等体积的上述4种稀释后溶液混个，从混合液中吸取1.0uL加人到LNA分析仪专用深孔板孔。板中孔分别加人0.5ulL500分子量内标和8.5离子伊酰胺。除待测样品外，还应同时包括标准样品的护增产物。将样品在PCR仪上95℃变性3min，立即取出置丁冰上，冷却10min以上。瞬时离心10s后上机电泳。9.5.3.2开机准备
打开DNA分析仪，检查仪器工作状态。史换缓冲液，灌胶。将装有样品的微孔板置放于样品架基座上，打开数据收集软件。
9.5.3.3编辑电泳板
点山菜单的\plateimanaer\按钮，然后在右侧衡口点击“New\按钮创建一个新的电泳板。在“Name\和\ID\栏中输入电板的名称，在“application”选项中，选“Genemappcr-Gcnetie”，在“PlatcType\选项中选择“96well”，在\owner\和\apcrator”项中分别输人板所有者和操作者的名字，点击“OK\按钮。
9.5.3.4电泳
在Runschcduler\E具栏中，点击\Scarch\按钮.选中已编辑好的电泳板，点击样品板，使电泳板和样品板关联，然后点击汇具条中左上角的缘色一角按钮，开始电。10等位变异数据采集
10.1数据格式
样品每个Indcl位点的等位变采用扩增片段大小进行表示。10.2非变性(或变性)聚丙烯酰胺凝胶电泳银染检测将待测样品扩增片段的带型和泳动位置与对成的参照样品进行比较，与待测样品相同的标准样品的片段大小即为待测样品该引物位点的等位变异扩增片段大小。10.3INA分析仪检测
使用DVA分析仪的片段分析软件，读出个位点每个样品的等位变异扩增片段大小数据，通过使用标准样品-消除同型号不同批次间或不同型号DNA分析仪间可能存在的系统误差。比较标准样品的等位变异扩增片段大小数据与附录中的数鹅。如两者不一敛，其差数即是系统误差的大小。从待测样品的等位变兄扩增片段数据中去除该系统误差，获得的数据即为待测样品的等位变异扩增片段大小。
10.4结果记录
10.4.1非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯合位点的等位变异记为A（小片段）和B（大片段），杂合位点的等位变异记为II，缺失位点的等位变异数据记录为0。
10.4.2变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和 DNA分析仪检测纯合位点的等位变异记录为X/X杂合位点的等位变异记录为X/Y，其中X、Y分别为该位点上2个不同等位变异扩增片殿大小，小片段数据在前，人片段数据在后；缺失位点的等位变异记录为0/0。示例1：纯合位点的Indel,如参照品种“中靠1号\在InclelFT2位点上的等位变异为164bp，测该品种在该位点上的等价要异记录为164/164。
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示例2：杂合位点的Indel,如某个品种在某个位点上的等位变异扩增片段大小分别为159h、164bp，则该品种在该位点上：的等位变异记录为159/164。10.5数据处理
《一·个位点2次重复检测数据相同时，该位点的等位变异数据即为该数据。2次重复不-致时，增加第一个重复.以其中2个重复相同的检测数据为该位点的等位变异数据。当3次重复结果都不相同时，该位点视为无效位点。
11判定标准
依据48对Indlcl引物的检测结果进行判定：品种间差异位点数含2、判定为不同品种：a)
品种间差异位点数<2，判定为近似品种。5
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A.1仪器设备
A.1.1PR扩增仪，
A.1.2垂直电泳槽及配套的制胶附仆。A.1.3高压电泳仪。
A1.4水平摇床。
A.1.5胶片观察灯。
A.1.6电天平。
A.1.7微量移液器。
磁力搅拌器。
电磁炉。
微波炉。
高压灭菌锅，
酸度计。
台式高速离心机。
制冰机。
凝胶成像系统或紫外透射仪。
附录A
（规范性附录】
仪器设备及试剂
A.1.16[NA分析仪：基于毛细管电泳，有IDNA片段分析功能和数据分析软件，能够分辨1个核作酸的差异。
水浴溶锅或金属浴:控温精度=1℃.冰箱：最低温度-20%
紫外分光光度计。
A.2试剂
「六烷基一乙基溴化铵(CIAB)，A.2.2聚乙烯吡咯烷啊(PVP)，
A.2.3艺胺μ艺酸一钠（EIYIA-Naa）。A.2.4三羟甲基氨基中烷(Tris碱）A.2.5浓盐酸。
氧氰化钠(NaOH)
A2.710xBuffer缓冲液（含Mg）。A.2.82×Mix含TNA聚合酶、NTP和Mg·等常规PCR所含成分）,Promegu公司。A.2.94种脱氧核白酸：4×dNTP。Ta NA聚合酶。
A.2.11去离子甲酰胺。
漠酚蓝。
二苯青。
甲叉双内烯酰胺。
丙烯酰胺。
硼酸。
尿素。
亲和硅烷：97%。
剥离硅烷：2%二甲基二氯硅烷。无水乙醇。
四甲基乙二胺（TEMET))。
过硫酸铵（APS)。
冰醋酸。
硝酸银，
甲醛。
氮伤。
异戊醇。
异丙醇。
DNA分析仪扩增缓冲液：2.5×MultiplcxBuffcr。DNA分析仪扩增聚合酶FastTagINAPalymerascDNA分析仪用分子量内标：RI)X-500分子量内标。DNA分析仪用内烯酰胺胶液（PO)P-7胶）。A.2.33
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4DNA分析仪用光谱校准基质，包括6FAM、TAMRA、HEX和ROX4种炭光标记的DNA片A.2.34
5LDNA分析仪专用中泳缓冲液。
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B.1DNA提取溶液的配制
附录B
（规范性附录）
溶液配制
B. 1. 1 0. 5 moI/L 乙二胺四乙酸二钠(ELTA-Na2)(pII=8. 0)溶液称取186.1EDTA-Nax溶于800mL蒸馏水4，用固休NaOH调pH至8.0定容至1000ml高压灭菌。
B. 1. 21 mol/ I 三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HC1) (pH=8. 0)溶液称取60.55gTris济于适量水中，加IICl调pII至8.G.定容至500mL，高正灭菌，B. 1. 30. 5 mol/ L 盐酸(IICI)溶液量取25ml.浓盐酸（36%38%），加水定容至500mL。B.1. 4DNA提取液
称取CTAB20g,NaCl81.816g,PVP20g，量取1mol/L.Tris-HCl溶液(pH=8.0)100mL0.5 mol/T.EDTA溶液(pH=8. 0)40mL,定容至1 000 mI。B.1.55 mul/L氯化钠(NaCI)溶液称取146g固体NaCl溶丁水中,加水定至500ml-B.1.624:1氯仿一异戊醇
按24：1的比例（体积比)配制混合液。B.2PCR扩增溶液的配制
B. 2. 1 dNTP
川超纯水分别配制A、G、C、T终浓度100mmol/L的储存液。各取20l混合，H超纯水720μT定容至终浓度2.5mmol/1.的T作液。B.2. 2 Indel 引物
根据合成后引物浓度，用超纯水分别配制正向引物和反问引物终浓度均100umol/1.的储存液，各取10混合，用超纯水80定容牟终浓度10umol/L的工作液，引物干粉配制前应首先快速离心。B.2.36×上样缓冲液
称溴酚蓝0.125g、一甲苯清0.125g，量取去离子甲酰胺49mL、0.5mol/I.的EDTA溶液（pH8. 0)1 ml..
弱.3非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液配制B.3.120%聚丙烯酰胺
称取19g内烯酰胺、1g甲叉内烯酰胺，济于蒸馅水中，定容至100mL。B.3.210%过硫酸铵
称取10g过硫酸铵·游十蒸馏水中，定容至100ml.B.3.310×TBE缓冲液
称取Tris碱108g、硼酸55g,量取0. 5nol/LEDTA溶液37mL,穿至1 000 ml.。8
B.4变性聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制B. 4. 1 40% PAGE胶
称取内烯酰胺190多和甲义双内丙烯酰胺10%，定穿至500mL。NY/T 2471-—2013
B. 4. 26. 0% PAGE胶
称取尿索420g?量取10×TBE缓冲液100mL、40%PAGE胶150ml定容至1000mLB.4.3亲和硅烷
量取49.75mL无水乙醇和250L冰醋酸，加水定容至50mLB.4.4亲和硅烷工作液
在1nLind缓冲液中加人5μI.Bind原液，混匀。B.4.5剥离硅烷工作液
2%二甲基二氯硅烷。
B.4.610%过硫酸铵溶液
称取0.1g过硫酸铵溶于1mL超纯水中。B.4.71×TBE缓冲液
量取10×TBE缓冲液500mL，加水定容至5000mL。B.5银染溶液的配制
B.5.1固定液
量取5mL冰醋酸、100ml.乙醇，加水定容至1000ml。B.5.2染色液
称取2g硝酸银，加水定容至1000mL。B.5.3显影液
量取1000mL蒸馅水，加人15g氢氧化钠和3mL甲醛。9
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2014-04-01实施
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溶液配制
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参照品种及来源·
操作程序
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11判定标准
附录A(规范性附录）
仪器设备及试剂
附录B(规范性附录）
济液配制·
附录C(规范性附录）
附录D(资料性附录)
核心引物
参照品种
NY/T 2471--2013
NY/T2471—2013
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。木文件的发布机构不承担识别这些专利的质任本标准由农业部种了管理局提出。本标准由全国植物新品种测试标准化技术委员会（SAC/TC277)归口。本标准起节单位：国农业科学院蔬菜花卉研究所、农业部科技发展中心。本标准主婆起草人：高建昌、朴永正、王孝宣、国艳梅、于宗鸿、莫青。1范围
Indel分子标记法
番茄品种鉴定技术规程
NY/T2471—2013
本标准规定了利用插人/缺失序列（InsertionandIeletionScquence，Indel)分子标记进行普通番加（Sotarumlycopersicum.L.）品种的鉴定方法、数据记录格式及判定标准，本标准适用于番茄IDNA分子数据的采集和品种鉴定。2规范性引用文件
下列文件对十本文件的成用是必不可少的。凡是注日期的引文件，仅注日期的版木适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适川于本文件。GB/T3543.2农作物种子检验规程3术语和定义
下列术语和定义适用于本义件。3.1Indel标记
指物种间或物种内在基因序列上存在的短的插入或缺失序列。根据这种插入或缺失序列逊行基网分型的标记称为Indel标记。
4原理
插人缺失序列(Indel)广泛分布于番茄基内组中，因插入或缺失片段大小的不同而在不同品种中表现出片段长度的多态性。每个插入缺失序列存在3种状态，纯合（A），纯合（B)和杂合（TI），根据其两端序列设计特异引物，利用PCR技术进行几的片段扩增。电泳过程中，不同大小的PCR产物在电场的作用下被分离，经硝酸银染色或者荧光染料标记加以区分，因此，根据Indel位点的多态性，结合PCR扩增和电泳技术能够鉴定番茄品种。5仪器设备及试剂
仪器设备及试剂名单见附录A。
6溶液配制
相关溶液配制方法见附录B
7引物
引物机关信息见附录（。
8参照品种及来源
参照品种及来源参见附录I)。
9操作程序
9.1重复设置
设定2欲生物学重复。
NY/T2471—2013
9.2样品准备
和子样品的钎样、分样和保存，按期GB/T3543.2的规定进行。每个品种分取2份样品，每份样品取30个个体（叶片或其他器），等量混合9.3DNA提取
采用GTAB法：取番茄幼叶20mg~30IIg至2.0ml.离心管中，液氮中研碎。加入750μL预热的DNA提取液.勺，55℃水浴或金属浴45min，加入750μI氯仿异戊醇L24：1（V：V)_提取液，上下混匀3min；4℃.13500g离心5min；吸500μL上清液至一只2.0rrL离心管中，加人等体积氯仿异戊醇提取液，上下混句3min：13500g离心5min；吸400ul上清液至新的离心管中，加入800μL预冷无水乙醇，4放置1h以上沉淀DNA：10000离心1min，弃上清液，用75%乙醇漂洗2次，离心后弃清液，白然风十；加人100μLtldHURNase50：1（V：V)缓冲液，震荡溶解，检测DNA浓度，一20℃保存备用。
注：以上为推存的种INA提取方法。所获TNA质量能够符合PCR扩增需要的DNA提取方法都适用于本标谁。
9.4PCR扩增
9.4.1参照样品的使用
在进行1（R扩增和等位变片检测时.应同时包括相应的标准样品。不同位点的标准样品的名称见附录。某位点上具有相同的等位变异的标准样品可能不止·个，在确认这些样品在某·位点上的等位变异大小后，也可将这些样品代菩附录C中的标准样品。同-名称不同来源的标准样品在某--位点上的等位变异可能不相同，在使用前成与原标准样品行核对
注：多个而种在某，位点上可能都具有相同的等位变异。在确认这些品种某一位点上等位变异大小后，这些品种也可以代替附录（中的标准样品使用。9. 4.2 反应体系
20l.CR反应体系包括：含基因组DNA50ng，正、反向引物各0.5mol/IPmmcga公司2XMix(DNA聚合酶、dATP和Mg\+等常规PCR所含成分)1OL利用毛细管中泳荧光检测时，使用荧光标记的引物。引物的炭光染料种类见附录（。9. 4. 3反应程序
9.4.3.1普通引物PCR反应程序
94℃预变性3min；94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸90$，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
9.4.3.2荧光引物PCR反应程序
95℃预变性5min：94%变性30s，50℃退火405，72℃延伸10s.35个循坏，72℃延伸10min；4%保存，
9.5等位变异检测
9.5.1非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳9.5.1.1电泳装置准备
所用装置为垂直电泳槽（玻璃板规格为216mm×110mm）：将聚丙烯酰胺垂直电泳槽中的玻璃板洗净，晾干后装人胶框；依次将两块胶板装入电泳槽巾，较短的胶板朝外，将螺丝拧紧，然后用1%琼脂糖凝胶封住胶框下面以防漏胶。9.5.1.28%非变性凝胶制作
按表1配方进行凝胶制作。
20聚丙烯酰胺丹液
10XTBE
超纯水
1C外过硫酸铵
表18%聚丙烯酰胺凝胶配方
NY/T2471—2013
9.5.1.3灌胶、点样
凝胶混勾后快速倒入玻璃板夹层中，插入梳子。待胶凝固1h后，拨掉梳了，用0.5%TI3E冲洗加样孔，再用移液器或吸水纸吸十加样孔中的水分，然后点样。每个加样孔上样量2l.（1uL.FCR产物中加入2上缓冲液混匀）。
9.5.1.4电泳
向胶槽中倒入电泳缓冲液（0.5%TBE)，电泳电压为160V.电泳吋间为1.5h2.5h(电泳指示剂至适当位置时）。
9.5.1.5银染检
固定：固定液中轻播4min，固定1次，回收剧定液：a)
银染，染色液中染色10min；
显影：显影液中轻摇至主带完全显现：c
d）定影：用步骤a)中回收固定液定影30；清洗：蒸馏水轻摇清洗1min；
F）保存：将清洗后的胶平铺在P膜上，包好后在可见光灯箱1照相保存。9.5.2变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染检测9.5.2.1清洗玻璃板
将玻璃板反复探洗T净，双蒸水擦洗2遍，95%乙醇擦洗2遍T燥。在长极」涂上0.5mL亲和硅烷工作液，带凹摊的短板上涂0.5mL剥离硅烷工作液。操作过程中防止2块玻璃板互相污染，9.5.2.2组装电泳板
待玻璃板彻底干燥后组装电泳板，并用水平仪调平。9.5.2. 3灌胶
取60ml.6%的聚丙烯酰胺胶（根据不同型号的电泳槽确定胶的用量和合适的灌胶片式），300μl）过硫酸铵APS)和60I四甲基乙一胺(1EMEI)轻轻混勾，将胶缓缓地灌入，灌胶过程中防止现气泡。当胶到底部后将板放置水平，将梳了插适当位置，并用夹了夹紧，以防漏胶。聚合2h以！用丁电泳
9.5.2.4预电泳
将梳子小心拔出，川洗瓶清洗干净」样孔·然后擦干玻璃板。将电泳槽装配好后，在电泳槽加人1XTBE。在恒功率70W条件下预电泳30min。9.5.2.5变性
在R产物中加人3ul.6×加样缓冲液.混匀后在PCR仪上运行变性程序：95℃变性5min，然后文即置于冰上冷却，使DNA保持单链状态。9. 5.2.6电泳
预电泳结束后，将胶面的气泡及杂质吹打下净，将梳子轻轻插人，其深度为刚进入胶面1mm。每个加样孔点入5uL样品。70W恒功率电泳至上部的指示带到达胶板的中部。电泳结束后，小心分开2块玻璃板，凝胶会紧贴在长板上。3
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9. 5.2.7银染(同 9. 5. 1. 5)
9.5.3INA分析仪检测
9.5.3.1样品准备
首先根据不间的炭光基团将ICR产物稀释-定的倍数。一般6-FAM荧光基闭PCR产物稀释80倍，HEX、ROX、TAMRA荧光基闭PCR产物稀释30倍。然后分别取等体积的上述4种稀释后溶液混个，从混合液中吸取1.0uL加人到LNA分析仪专用深孔板孔。板中孔分别加人0.5ulL500分子量内标和8.5离子伊酰胺。除待测样品外，还应同时包括标准样品的护增产物。将样品在PCR仪上95℃变性3min，立即取出置丁冰上，冷却10min以上。瞬时离心10s后上机电泳。9.5.3.2开机准备
打开DNA分析仪，检查仪器工作状态。史换缓冲液，灌胶。将装有样品的微孔板置放于样品架基座上，打开数据收集软件。
9.5.3.3编辑电泳板
点山菜单的\plateimanaer\按钮，然后在右侧衡口点击“New\按钮创建一个新的电泳板。在“Name\和\ID\栏中输入电板的名称，在“application”选项中，选“Genemappcr-Gcnetie”，在“PlatcType\选项中选择“96well”，在\owner\和\apcrator”项中分别输人板所有者和操作者的名字，点击“OK\按钮。
9.5.3.4电泳
在Runschcduler\E具栏中，点击\Scarch\按钮.选中已编辑好的电泳板，点击样品板，使电泳板和样品板关联，然后点击汇具条中左上角的缘色一角按钮，开始电。10等位变异数据采集
10.1数据格式
样品每个Indcl位点的等位变采用扩增片段大小进行表示。10.2非变性(或变性)聚丙烯酰胺凝胶电泳银染检测将待测样品扩增片段的带型和泳动位置与对成的参照样品进行比较，与待测样品相同的标准样品的片段大小即为待测样品该引物位点的等位变异扩增片段大小。10.3INA分析仪检测
使用DVA分析仪的片段分析软件，读出个位点每个样品的等位变异扩增片段大小数据，通过使用标准样品-消除同型号不同批次间或不同型号DNA分析仪间可能存在的系统误差。比较标准样品的等位变异扩增片段大小数据与附录中的数鹅。如两者不一敛，其差数即是系统误差的大小。从待测样品的等位变兄扩增片段数据中去除该系统误差，获得的数据即为待测样品的等位变异扩增片段大小。
10.4结果记录
10.4.1非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯合位点的等位变异记为A（小片段）和B（大片段），杂合位点的等位变异记为II，缺失位点的等位变异数据记录为0。
10.4.2变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和 DNA分析仪检测纯合位点的等位变异记录为X/X杂合位点的等位变异记录为X/Y，其中X、Y分别为该位点上2个不同等位变异扩增片殿大小，小片段数据在前，人片段数据在后；缺失位点的等位变异记录为0/0。示例1：纯合位点的Indel,如参照品种“中靠1号\在InclelFT2位点上的等位变异为164bp，测该品种在该位点上的等价要异记录为164/164。
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示例2：杂合位点的Indel,如某个品种在某个位点上的等位变异扩增片段大小分别为159h、164bp，则该品种在该位点上：的等位变异记录为159/164。10.5数据处理
《一·个位点2次重复检测数据相同时，该位点的等位变异数据即为该数据。2次重复不-致时，增加第一个重复.以其中2个重复相同的检测数据为该位点的等位变异数据。当3次重复结果都不相同时，该位点视为无效位点。
11判定标准
依据48对Indlcl引物的检测结果进行判定：品种间差异位点数含2、判定为不同品种：a)
品种间差异位点数<2，判定为近似品种。5
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A.1仪器设备
A.1.1PR扩增仪，
A.1.2垂直电泳槽及配套的制胶附仆。A.1.3高压电泳仪。
A1.4水平摇床。
A.1.5胶片观察灯。
A.1.6电天平。
A.1.7微量移液器。
磁力搅拌器。
电磁炉。
微波炉。
高压灭菌锅，
酸度计。
台式高速离心机。
制冰机。
凝胶成像系统或紫外透射仪。
附录A
（规范性附录】
仪器设备及试剂
A.1.16[NA分析仪：基于毛细管电泳，有IDNA片段分析功能和数据分析软件，能够分辨1个核作酸的差异。
水浴溶锅或金属浴:控温精度=1℃.冰箱：最低温度-20%
紫外分光光度计。
A.2试剂
「六烷基一乙基溴化铵(CIAB)，A.2.2聚乙烯吡咯烷啊(PVP)，
A.2.3艺胺μ艺酸一钠（EIYIA-Naa）。A.2.4三羟甲基氨基中烷(Tris碱）A.2.5浓盐酸。
氧氰化钠(NaOH)
A2.710xBuffer缓冲液（含Mg）。A.2.82×Mix含TNA聚合酶、NTP和Mg·等常规PCR所含成分）,Promegu公司。A.2.94种脱氧核白酸：4×dNTP。Ta NA聚合酶。
A.2.11去离子甲酰胺。
漠酚蓝。
二苯青。
甲叉双内烯酰胺。
丙烯酰胺。
硼酸。
尿素。
亲和硅烷：97%。
剥离硅烷：2%二甲基二氯硅烷。无水乙醇。
四甲基乙二胺（TEMET))。
过硫酸铵（APS)。
冰醋酸。
硝酸银，
甲醛。
氮伤。
异戊醇。
异丙醇。
DNA分析仪扩增缓冲液：2.5×MultiplcxBuffcr。DNA分析仪扩增聚合酶FastTagINAPalymerascDNA分析仪用分子量内标：RI)X-500分子量内标。DNA分析仪用内烯酰胺胶液（PO)P-7胶）。A.2.33
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4DNA分析仪用光谱校准基质，包括6FAM、TAMRA、HEX和ROX4种炭光标记的DNA片A.2.34
5LDNA分析仪专用中泳缓冲液。
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B.1DNA提取溶液的配制
附录B
（规范性附录）
溶液配制
B. 1. 1 0. 5 moI/L 乙二胺四乙酸二钠(ELTA-Na2)(pII=8. 0)溶液称取186.1EDTA-Nax溶于800mL蒸馏水4，用固休NaOH调pH至8.0定容至1000ml高压灭菌。
B. 1. 21 mol/ I 三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HC1) (pH=8. 0)溶液称取60.55gTris济于适量水中，加IICl调pII至8.G.定容至500mL，高正灭菌，B. 1. 30. 5 mol/ L 盐酸(IICI)溶液量取25ml.浓盐酸（36%38%），加水定容至500mL。B.1. 4DNA提取液
称取CTAB20g,NaCl81.816g,PVP20g，量取1mol/L.Tris-HCl溶液(pH=8.0)100mL0.5 mol/T.EDTA溶液(pH=8. 0)40mL,定容至1 000 mI。B.1.55 mul/L氯化钠(NaCI)溶液称取146g固体NaCl溶丁水中,加水定至500ml-B.1.624:1氯仿一异戊醇
按24：1的比例（体积比)配制混合液。B.2PCR扩增溶液的配制
B. 2. 1 dNTP
川超纯水分别配制A、G、C、T终浓度100mmol/L的储存液。各取20l混合，H超纯水720μT定容至终浓度2.5mmol/1.的T作液。B.2. 2 Indel 引物
根据合成后引物浓度，用超纯水分别配制正向引物和反问引物终浓度均100umol/1.的储存液，各取10混合，用超纯水80定容牟终浓度10umol/L的工作液，引物干粉配制前应首先快速离心。B.2.36×上样缓冲液
称溴酚蓝0.125g、一甲苯清0.125g，量取去离子甲酰胺49mL、0.5mol/I.的EDTA溶液（pH8. 0)1 ml..
弱.3非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液配制B.3.120%聚丙烯酰胺
称取19g内烯酰胺、1g甲叉内烯酰胺，济于蒸馅水中，定容至100mL。B.3.210%过硫酸铵
称取10g过硫酸铵·游十蒸馏水中，定容至100ml.B.3.310×TBE缓冲液
称取Tris碱108g、硼酸55g,量取0. 5nol/LEDTA溶液37mL,穿至1 000 ml.。8
B.4变性聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制B. 4. 1 40% PAGE胶
称取内烯酰胺190多和甲义双内丙烯酰胺10%，定穿至500mL。NY/T 2471-—2013
B. 4. 26. 0% PAGE胶
称取尿索420g?量取10×TBE缓冲液100mL、40%PAGE胶150ml定容至1000mLB.4.3亲和硅烷
量取49.75mL无水乙醇和250L冰醋酸，加水定容至50mLB.4.4亲和硅烷工作液
在1nLind缓冲液中加人5μI.Bind原液，混匀。B.4.5剥离硅烷工作液
2%二甲基二氯硅烷。
B.4.610%过硫酸铵溶液
称取0.1g过硫酸铵溶于1mL超纯水中。B.4.71×TBE缓冲液
量取10×TBE缓冲液500mL，加水定容至5000mL。B.5银染溶液的配制
B.5.1固定液
量取5mL冰醋酸、100ml.乙醇，加水定容至1000ml。B.5.2染色液
称取2g硝酸银，加水定容至1000mL。B.5.3显影液
量取1000mL蒸馅水，加人15g氢氧化钠和3mL甲醛。9
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