NY/T 2472-2013
基本信息
标准号： NY/T 2472-2013
中文名称：西瓜品种鉴定技术规程 SSR分子标记法
标准类别：农业行业标准(NY)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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出版信息
相关单位信息
标准简介
NY/T 2472-2013 西瓜品种鉴定技术规程 SSR分子标记法
NY/T2472-2013
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标准内容
ICS 67.080.10
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 2472—2013
西瓜品种鉴定技术规程
SSR分子标记法
Identification of watermelon varieties-SsR marker method2013-12-13发布
2014-04-01实施
中华人民共和国农业部
范围·
规范性引用文件
原理…
仪器设备及试剂
溶液配制
参照品种
操作程序
等位变异数据采集
1判定标准
附录A（规范性附录）
附录B(规范性附录)
附录C(规范性附录)
仪器设备及试剂
溶液配制
核心引物
NY/T 2472—2013
NY/T2472--2013
本标准按照（B/T1.12G09给出的规则起卓。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标滩由农业部种子管理局提出。本标准由全国植物新品和测试标准化技术委员会（SAC/1C277)归门。本标准起草单位：新疆农业科学院农作物品种资源研究所、北京市农林科学院蔬莱研究中心、新疆农业科学院核技术生物技术研究所、农业部科技发展中心。本标准上要起草人：马艳明、许刃、张海英、陈勋基、陈果、郭绍贵、宫国义、刘志勇、足木热木·叫尔逊、肖首、颜国荣
1范围
西瓜品种鉴定技术规程SSR分子标记法NY/T 2472—2013
本标准规定了利用简单重复序列（Simplescquenccrcpeats，SsR）分子标记进行普通西瓜（Citrut-luslanafuxsubsp.Vuaris和Cirultuslanulussubsp：I.anatus）品种鉴定的试验方法、数据记录格式和判定标准。
本标准适用于普通西瓜DVA分了数据的来集和品种鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不川少的。凡是注口期的1用文件，仅注口期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。（B/T3543.2农作物种子检验规程杆样3原理
SSR广泛分布丁西瓜基因组中，不同品种间单个SSR位点重复单位的数量可能不同。针对两侧序列高度保守和单拷贝的简单重复序列，根据其两侧的序列设计-对特异引物，利用PCR技术对重复序列逊行扩增，得到的IXR产物在电泳过程中的电场作用下由于分了量人小不同得到分离，经硝酸银染色或者荧光染料标记检测区分开，出丁不同普通西瓜品种遗传成不同，所以.根据引物DNA序列在差异或引物结合部位之的DNA片段人小存在差异，即可鉴定普通西瓜品种。4仪器设备及试剂
仪器设备及试剂见附录A。
5溶液配制
溶液配制方法见附录B。
6引物
引物相关信息见附录C。
7参照品种
参照品种的名称见附录C。
在进行等位变异检测时，应同时包括相应参照品种的PCR扩增产物。8操作程序
8.1重复设置
设定2饮生物学重复。
8.2样品准备
种子样品的托样和保存，成箱合（GB/3513.2的规定：每个品种分取2个样品，每个样品检测30个个体（种厂，叶片或其他器宫组织），混合分析。对致性差的样品每个个体单独分析。NY/T 2472—2013
8.3DNA提取
采用（TAB法，选取植株下胚轴或幼嫩组织30rng~~40mg置+2.0ml离心管中，用液氮研磨至粉状.加人700μL2%CIAB预热缓冲液，65℃水浴1h，加人700μI.24：1氯伤--异戊醇，混匀，11200g离心10min；吸取上消液加人预先装有700uL异丙醇的1.5ml，的离心管中，混勾后放一20%冰箱30mi,11200g离心10min:奔1清液，用70%乙醇溶液洗涤2避，白然条件下干燥后，加人100uLdaH20,待充分溶解后检测浓度。一20℃保存留用注：以上为摊荐的·种I)NA提取方法。H其他所状TNA质量能够满足PCR扩增带要的DNA提取方法都适用于本标准，
8.4PCR扩增
8.4.1反应体系Www.bzxZ.net
SSR反应体系，包括每种dNTP0.25mmol/L，正向引物0.2μmol/L，反向物0.2μmol/1，TalDVA聚合酶1.0U.10×PCR缓冲液（含Mg/），样品IDNA6Ug，其余以超纯水补足。推荐使而15μL或20 μL反应体积。
利用DNA分析仪检测时使用荧光标记的引物。每种引物的荧光染料种类见附录（。注：反应体系的体积可以根据具体情况进行调。8.4.2反应程序
9℃预变性5min；94%变性30s，35℃退火30%.72℃延伸40s，循环34次；最后72℃延仲10min，4℃保温待用。
8.5PCR产物检测
8.5.1变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染检测8.5.1.1清洗玻璃板
用自来水将玻璃板洗净，惊F，再用95%的酒精擦洗1遍，十燥，在2mI.离心管中加人1mL无水乙醇，4l亲和硅烷原液，摇勾，均匀涂在无凹槽玻璃板上。在通风橱中用0.5mL疏水烧工作液均涂布凹槽玻璃板，操作过程中两块玻璃板分别处理，防止互机污染。8.5.1.2组装玻璃板
待玻璃板彻底干燥，将塑料隔条整齐放在无凹槽玻璃板两侧，盖上叫槽玻离板：子固定，用水平仪检测玻璃胶室是否水平。
8.5.1.3制胶
取6%的两烯酰胺凝胶50ml.加人50l.TEMEI>和200μL10%APS液。轻轻匀，将胶缓缓灌人玻璃胶室。待胶宰灌满后，在叫槽处将鲨色齿朝外轻轻插人样品梳，在室温下聚个］h以上。胶聚合后,轻轻拔出梳-子，用水冲洗叫槽处残余的胶，清洗下净备用，8.5.1.4预电泳
将胶板安装丁电泳槽上:.间1槽加人约803nL预热至65℃的1XTBE缀冲液，使其超出凝胶顶部约3cm：向下槽+加人800mL1×TBE缓冲液，60W柜功率预电泳20min.使凝胶预热。8.5.1.5样品制备
在12.5μLPCR产物中加5加样缓冲液，混匀后，在水浴锅或PCR仪1：95C变性5tmin，取出，立即置丁碎冰中冷却。
8.5.1.6电泳
川注射器吸取缓冲液冲洗凝胶顶端几次，清除气泡和聚内烯酰胺碎片。将鲨色齿梳子梳齿端插人凝胶1mm-~2mm。每一个加样孔点入2μ~-3μL样品。除待测样品外，还应同时加人参照品种扩增产物。在50W~80W恒功率下中泳，使凝胶温度保持在约50℃，电泳1.5h~2.5电泳时间取决丁扩增片段的大小范用）。电泳结束后，小心分开两块坡璃板，取下凝校附着的长坡璃板准备固定。注：具体功率大小根据电泳槽的规格型号和实验室室温设定。NY/T2472—2013
8.5.1.7银染
α）固定：将附养凝胶的玻璃板浸人加有1000ml.10%冰醋酸固定液的塑料盒中，在床上轻轻光动15ni
漂洗：取出胶板，在去离子水中漂洗1次～2次，每次2min：b)
染色：将胶板放人约1000ml.染色液中，使染色液没过凝胶，在摇床上轻摇30min；漂洗：取山胶板，用蒸馏水快速漂洗，时间不超过10$显影：将胶板放人预冷的1000mL3%碳酸钠显影溶液中，轻轻动至清晰条显出；e)
定影：迅速将胶极放入固定液中定影5min;f
）漂洗：在去离子水中漂洗胶板5min，取出晾十。将玻璃板放在观片灯上，记录结渠，拍照保存，8.5.2毛细管电泳荧光检测
8.5.2.1PCR产物样品准备
将6-FAM和IIEX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，TAMRA和R(X荧光标记的PCR产物稀释10倍。分别取等体积的上述1种稀释后溶液混合，从混合液中吸取1uI.加人到DNA分析仪专用深孔板孔中。板中孔分别加人0.11IZ500分了量内标和8.9uL去离于甲酰胺。将样品在PCR仪上95变性5min，取出，立即置于碎冰上，冷却10min以上。瞬时离心10s后置放到DNA分析仪1。
除待测样品外，每个SSR位点还应时包括2个～3个参照品种的扩增产物。注：不同荧光标记的扩增产物的最适稀释倍数最好通过毛细管电泳荧光检測预试验确定。8.5.2.2开机准备
打开DNA分析仪，检查仪器T作状态。更换缓冲液，灌胶。将装有样品的深孔板置放于样品架基座上。打开数据收集软件。
8.5.2.3编板
按照仪器操作程序，创建电泳板，输入电泳板名称，选择适合的程序和电冰板类型，输人样品编号或名称。
8.5.2.4运行程序
NA分析仪白动将毛细管电泳数据、运行参数等存放在仪器中。9等位变异数据采集
9.1数据表示
样品每个SSR位点的等位变异采用扩增片段大小的形式表示。9.2变性聚丙烯凝胶电泳与银染检测将某一位点待测样品和相成的参照品种扩增片段的带型和移动位置进行比较，根据参照品种的移动位置和扩增片段大小，确定待测样品该位点的等位变异大小，9.3毛细管电泳荧光检测
使用DNA分析仪的片段分析软件，读出每个位点每个样品的等位变异人小数据。比较参照品种的等位变异大小数据与附录C中参照品种机应的数据，两者之间的差值为系统误差，从待测样品的等位变异数据中去除该系统误差，得到的数据即为待测样品该位点的等位变异大小。示例1：参照品种*红1号”“L1花\在VWS00441位点上的等位变异大小分别为163hp和178bp+附录（\红1可”“早化\相应的数据分别为163hp和178bp，系统误差为2bp一个待测样品的等位变异大小原始数据为175hp测待测样品在该位点上的等位变异数据应为173bp示例2：参照品种\早花\，\K7\在BVWSH0948位点1的等位变异大小分别为259br和2671p，附录C中*早花”\K7\相应的数据分别为259bp>和267lp，系统误差为bp。一个待测样品的等位变异大小原始数据为261h>则待测样NY/T 2472—2013
品在该位点上的等位变异数据应为26:bp。9.4结果记录
纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X,杂合位点的等位变异数据记录为X/Y。其中X、Y为该位点上两个不同的等位变片段大小，小片段在前，大片段在后。无效等位变异的人小记录为0/0。示例1：一个品种在3VWS00658位点上右1个等位变异，大小为27nhF+测该品种在该位点上的等位变异数据记录为270/270，
示例2：个品种在BVWsS0.734位点上行2个等位变异，人小分别为217bp、230hFP，则该品种在该位点上的等位变异数据记录为217/239
9.5数据处理
一个位点2次重复检测数据相同时，该数据即为该位点的等位变异数据；2次重复不致时，增加第三个重复，以其中2个重复机同的检测数据为该位点的等位变异数据；当3次重复都不相同时，该位点视为无效位点，
10判定标准
依据附录C中的28个位点的核心引物检测结果进行判断：a）品种问差异位点数学3，判定为不伺品种；b）品种问差异位点数3，判定为近似品种。A.1主要仪器设备
A.1. 1PCR 核酸扩增仪。
A.1.2高压电泳仪。
附录A
（规范性附录）
仪器设备及试剂
A.1.3序列分析电泳槽及配套的制胶附件。A.1.4普通电泳仪。
5水平电泳槽及配套的制胶附件。A. 1. 5
水平摇床。
电了天平。
微量移液器，
胶片观察灯。
紫外分光光度计。
高压灭蘭器。
酸度计。
水浴锅。
制冰机。
凝胶成像系统或紫外透射仪。
A.2试剂
十六烷基三乙基溴化铵。
聚乙烯吡略咯烷酮。
氯仿，
异戊醇。
乙胺四乙酸二钠。
三羟F1基氨基中烷。
浓盐酸。
氢氧化钠
J)×TnaDNA聚合酶Buffer缀冲液（含Mg+）A. 2. 10
4种脱氧核白酸。
Taq DNA 聚合酶。
核酸染料。
去离了酰胺。
溴酚蓝。
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二甲苯背。
6双双丙烯酰胺
丙烯酰胺。
尿素。
亲和硅烷。
剥离硅烷。
无水乙醇。
四甲基乙一胺
过硫酸铵.
冰醋酸。
硝酸银。
甲醛，
3DNA分析仪用聚内烯酰胺胶液。A.2.29
DA分析仪用分子量内标，最大分于量500bp,Liz标记。A.2. 30
INA分析仪用光谱校准基质：包括6-FAM、TAMRA、HEX和ROX4种荧光染料标记的DNA片段，
A.2.31DNA分析仪用电缓冲液。
B.1DNA 提取溶液的配制
附录B
(规范性附录）
溶液配制
NY/T2472—2013
B.1. 10.5mol/L乙二胺四乙酸二钠盐(ELYTA)(pH8.0)溶液称取186.1gNaEDTA211，加800mL去离了水，用固体Va0)H约20g调pH1至8.0，定容至1000ml，在103.4kPa(121%)条件下火菌20min。B.1.21 ml/L三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCI)(pH 8.0)溶液称取60.55gTris碱，济于适量去离了水中,加HCl调pH至8.0.定容全500mL，在103.4kIa(121%）条件卜火菌20mnin。
B. 1. 30. 5 ml/L 盐酸(HCI)溶液量取25mL浓盐酸（36%~-38%），加水定容至500ml。B.1.4DNA提取液
称取 20 g CTAB,81.82 NaCl,分别加人 100 mL 1 mol/L Tris -HICl 溶液(pH 8. 0)、10 tnL0.5mol/1FDTA溶液(pH8.0)和10gPVP,加人800mL去离子水，65℃水浴搅拌、溶解，定容至1000ml.。在103.4kPa121）条件F火菌20min。4℃保存。B 1. 5 24 : 1 氯仿一异戊醇
按241的比例（V：V)配制混个液。B. 1. 6 乙醇一乙醇胺溶液
称取0.1516g乙酸铵置人烧杯中，加人140mL无水乙醇，用去离子水定容至200ml。B.1.71×TE缓冲液
分别量取 5nL 1 mol/L Tris-IICI(pI18. 0),l mL0. 5mol/ LEDTA(pH8. 0),定容至500 mL.在103.4kPa121℃）条件下灭菌20min。4%保存。B. 2PCR 扩增溶液的配制
B. 2. 110 mmol/L dNTP 溶液
用超纯水分别配制AG、C、T终浓度100mm10l/1.的储存液，各取20L混介，用120μL超纯水定容至每种核作酸终浓度为10mmol/L.的工作液。在103.4kPa(121℃)条件下火菌20min，20℃保存。
注：也可使用购买的满足实验要求的商品试剂。B.2.2SSR 引物溶液
用超纯水分别配制正向引物和反向引物至浓度为5umol/L的T作液。B. 2. 310 × Taq DNA 聚合酶 PCH 缓冲液分别取 500 rmmol/L KCl、100 tnrnal/L Tris-TICt (pII8.0)和 0.01%明胶，在 103.4 kPa(121℃）条件下火菌20min.—20℃保存，B.2.425mmol/L氯化镁（MgClz)溶液称取MgClz1.190g，用么离子水溶解，定容至500mL，配制成251Itmol/L的工作液，在103.4kPa7
NY/T 2472—2013
（121%）条件下灭菌20min。—20℃保存。B.3变性骤丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制B.3. 110 × TBE缓冲液
分别称取Tris碱108g、硼酸55g.量取0.5mol/LEDTA（pH8.0)溶液37ml，加去离子水解，定容至1000ml
B.3.240%丙烯酰胺溶液
分别称取闪烯酰胺190%和甲叉双丙烯酰胺10g，置入烧杯中，加水溶解，定容至500mlB.3.36%变性聚丙烯酰胺凝胶溶液称取水素420g，用去离广水溶解，加入10×TBE缓冲液100ml，40%内烯酰胺胶溶液1501nL.定穿至 1000 mL
B.3.4亲和硅烷缓冲液
分别量取49.75ml.无水艺醇和250μl.冰醋酸，加去离-了水定容至50mL。B.3.5亲和硅烷工作液
在1ml.亲和挂烷缓冲液中加入5亲和硅烷原液，混勾。B.3.6剥离硅烷工作液
在98mL的三氛甲烷溶液中加人2一甲基一氯炜烧溶液，混勾。B.3.710%过硫酸铵溶液
称取0.10宫过硫酸铵，溶于1ml.去离了水巾，混匀。4℃保存。B.3.81×TBE缓冲液
量取10×TBF缓冲500ml，加离子水定容至5000nl。B.3.96×加样缓冲液
量取49mL98%的去离子甲酰胺（用于DNA变性）、0.5mol/L的ELTA溶液（pHI8.0)1mL,加人0.125名澳酚蓝、0.125g二甲苯青.混勾。4℃保存。B.4银染溶液的配制
B.4.1固定液
量取100tmL冰醋酸，加么离了水定容至1000ml。B.4.2染色液
称取1g硝较银,加去离子水溶解,定容至 1 000 mL。B.4.3显影液
量取100mL去离厂水，加人10g氢氧化钠和5ml.甲醛，混匀注：除非另右说明，仅适用分析纯试剂：芹号
核心引物见表1。
逆锁群
附录C
（规范性附录）
核心引物
引物序列(5'-3°)）
核心引物
正向引物：TCAAACUGACTGCCATATCABVWS00948
2RWS00155
Evwsn020?
iBVWS00314
BWS0048
RVWS00208
BVWS01734
BVWS00441
5BVWS00658
10BVWS00106
1113VwS01686
ByWS0189?
BVWS02433
EVWS00818:6
15 |BVWS013586
16BVWS00433
反引物：AGCTTTCTICCTGXITT
正向引物：IGGATCAITTGACAGATTTAGCGA反向物:CATCACAGTTAAXATCACAAGGC向物：ACAACTTIGATTGATIGACGATG反间引物AAGIGAAAGACXTTTTXXAAACF间物：GAGGAGAATCGGTTCTIGGACATA技向引物：TTGAGCATXTIGGACTATCATI正向物：TCAAAAGOTIIGCCTTAAATGAAA反向引物：TCTGATCCOCATTCTTAACCTC正间引物：GCAAAGATTGTCTATGAAGCAGCA反间物：GCTCATTGGCTICTTGAATTTT正向物，AAAATTACATCTTAAATGUGCC反间引物：GGAACATIGACTTUAATCAGCA正向引物：TGGTIGAAATCAATAAAAAGTGAA反间引物：TGGAIYTTTTTGGCATITGA正向叫物：TTAGCCTAAGCAAGGGTTTTT反向引物：AAGTACACATTTTAAACAATCAATUCA正向引物：TGGOCTAGAAGATTATTGAGT反向引物：CAITAICACATGGCAGATAAIGAAA正向物：TGGATAGAATGGAAAGKTCTGA反引物：TCACACATCATTC心AAAA
正向引物：TTITGAAACICAACXTCAAA反向引物：AAAGKYFIUGAGTGTGAGA正尚物：ATTTCTGGXXAGIGTAAG
反间引物:GAACAAUGCAACCALGTATG正向引物：CAACOGGTCTTCGTGAATTT反向物：XGCCACCACTTCTCATATT
向引物：CCCTATTGXXTATITTTCTCAA反向引物：AAATTTGTGCTICTIXIGGGIF向引物：TCTTTTAAGTTTTGAGGGAGAGG反向引物：TTXXAAGCTAGCTTIICA荧光
5'6-FAM
5'6-FAM
5'TAMRA
5'6-FAM
5'6 FAM
5'S-FAM
5'6 FAM
5'6 - FAM
(FITC)
S'TAMRA
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退火等位
温度变异
参照品种
PT296341-FR
早花,无极
PI296311 FR
长灰、点克仑生
早花、卡红
红1号、郝1号
长.卡红
红1号、无早
下红.2000-S52
红1号无授早
三白信凹91·2
小膏10号
红 1 号,无梗早
早花、K7
黑筋、都1号
红1号、无早
早花.K?
只花、K7
、卡红
红1号，无校早
黑蹦筋.都1号
红1号，校
早花.K7
红1号.无校
红「号、黑
花、部］号
红1号、元校
红1号、无权早
黑蹦筋、都1号
红1号、无权早
早花、K7
红1号、校早
早花、蜜宝
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附录B(规范性附录)
附录C(规范性附录)
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核心引物
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本标准按照（B/T1.12G09给出的规则起卓。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标滩由农业部种子管理局提出。本标准由全国植物新品和测试标准化技术委员会（SAC/1C277)归门。本标准起草单位：新疆农业科学院农作物品种资源研究所、北京市农林科学院蔬莱研究中心、新疆农业科学院核技术生物技术研究所、农业部科技发展中心。本标准上要起草人：马艳明、许刃、张海英、陈勋基、陈果、郭绍贵、宫国义、刘志勇、足木热木·叫尔逊、肖首、颜国荣
1范围
西瓜品种鉴定技术规程SSR分子标记法NY/T 2472—2013
本标准规定了利用简单重复序列（Simplescquenccrcpeats，SsR）分子标记进行普通西瓜（Citrut-luslanafuxsubsp.Vuaris和Cirultuslanulussubsp：I.anatus）品种鉴定的试验方法、数据记录格式和判定标准。
本标准适用于普通西瓜DVA分了数据的来集和品种鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不川少的。凡是注口期的1用文件，仅注口期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。（B/T3543.2农作物种子检验规程杆样3原理
SSR广泛分布丁西瓜基因组中，不同品种间单个SSR位点重复单位的数量可能不同。针对两侧序列高度保守和单拷贝的简单重复序列，根据其两侧的序列设计-对特异引物，利用PCR技术对重复序列逊行扩增，得到的IXR产物在电泳过程中的电场作用下由于分了量人小不同得到分离，经硝酸银染色或者荧光染料标记检测区分开，出丁不同普通西瓜品种遗传成不同，所以.根据引物DNA序列在差异或引物结合部位之的DNA片段人小存在差异，即可鉴定普通西瓜品种。4仪器设备及试剂
仪器设备及试剂见附录A。
5溶液配制
溶液配制方法见附录B。
6引物
引物相关信息见附录C。
7参照品种
参照品种的名称见附录C。
在进行等位变异检测时，应同时包括相应参照品种的PCR扩增产物。8操作程序
8.1重复设置
设定2饮生物学重复。
8.2样品准备
种子样品的托样和保存，成箱合（GB/3513.2的规定：每个品种分取2个样品，每个样品检测30个个体（种厂，叶片或其他器宫组织），混合分析。对致性差的样品每个个体单独分析。NY/T 2472—2013
8.3DNA提取
采用（TAB法，选取植株下胚轴或幼嫩组织30rng~~40mg置+2.0ml离心管中，用液氮研磨至粉状.加人700μL2%CIAB预热缓冲液，65℃水浴1h，加人700μI.24：1氯伤--异戊醇，混匀，11200g离心10min；吸取上消液加人预先装有700uL异丙醇的1.5ml，的离心管中，混勾后放一20%冰箱30mi,11200g离心10min:奔1清液，用70%乙醇溶液洗涤2避，白然条件下干燥后，加人100uLdaH20,待充分溶解后检测浓度。一20℃保存留用注：以上为摊荐的·种I)NA提取方法。H其他所状TNA质量能够满足PCR扩增带要的DNA提取方法都适用于本标准，
8.4PCR扩增
8.4.1反应体系Www.bzxZ.net
SSR反应体系，包括每种dNTP0.25mmol/L，正向引物0.2μmol/L，反向物0.2μmol/1，TalDVA聚合酶1.0U.10×PCR缓冲液（含Mg/），样品IDNA6Ug，其余以超纯水补足。推荐使而15μL或20 μL反应体积。
利用DNA分析仪检测时使用荧光标记的引物。每种引物的荧光染料种类见附录（。注：反应体系的体积可以根据具体情况进行调。8.4.2反应程序
9℃预变性5min；94%变性30s，35℃退火30%.72℃延伸40s，循环34次；最后72℃延仲10min，4℃保温待用。
8.5PCR产物检测
8.5.1变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染检测8.5.1.1清洗玻璃板
用自来水将玻璃板洗净，惊F，再用95%的酒精擦洗1遍，十燥，在2mI.离心管中加人1mL无水乙醇，4l亲和硅烷原液，摇勾，均匀涂在无凹槽玻璃板上。在通风橱中用0.5mL疏水烧工作液均涂布凹槽玻璃板，操作过程中两块玻璃板分别处理，防止互机污染。8.5.1.2组装玻璃板
待玻璃板彻底干燥，将塑料隔条整齐放在无凹槽玻璃板两侧，盖上叫槽玻离板：子固定，用水平仪检测玻璃胶室是否水平。
8.5.1.3制胶
取6%的两烯酰胺凝胶50ml.加人50l.TEMEI>和200μL10%APS液。轻轻匀，将胶缓缓灌人玻璃胶室。待胶宰灌满后，在叫槽处将鲨色齿朝外轻轻插人样品梳，在室温下聚个］h以上。胶聚合后,轻轻拔出梳-子，用水冲洗叫槽处残余的胶，清洗下净备用，8.5.1.4预电泳
将胶板安装丁电泳槽上:.间1槽加人约803nL预热至65℃的1XTBE缀冲液，使其超出凝胶顶部约3cm：向下槽+加人800mL1×TBE缓冲液，60W柜功率预电泳20min.使凝胶预热。8.5.1.5样品制备
在12.5μLPCR产物中加5加样缓冲液，混匀后，在水浴锅或PCR仪1：95C变性5tmin，取出，立即置丁碎冰中冷却。
8.5.1.6电泳
川注射器吸取缓冲液冲洗凝胶顶端几次，清除气泡和聚内烯酰胺碎片。将鲨色齿梳子梳齿端插人凝胶1mm-~2mm。每一个加样孔点入2μ~-3μL样品。除待测样品外，还应同时加人参照品种扩增产物。在50W~80W恒功率下中泳，使凝胶温度保持在约50℃，电泳1.5h~2.5电泳时间取决丁扩增片段的大小范用）。电泳结束后，小心分开两块坡璃板，取下凝校附着的长坡璃板准备固定。注：具体功率大小根据电泳槽的规格型号和实验室室温设定。NY/T2472—2013
8.5.1.7银染
α）固定：将附养凝胶的玻璃板浸人加有1000ml.10%冰醋酸固定液的塑料盒中，在床上轻轻光动15ni
漂洗：取出胶板，在去离子水中漂洗1次～2次，每次2min：b)
染色：将胶板放人约1000ml.染色液中，使染色液没过凝胶，在摇床上轻摇30min；漂洗：取山胶板，用蒸馏水快速漂洗，时间不超过10$显影：将胶板放人预冷的1000mL3%碳酸钠显影溶液中，轻轻动至清晰条显出；e)
定影：迅速将胶极放入固定液中定影5min;f
）漂洗：在去离子水中漂洗胶板5min，取出晾十。将玻璃板放在观片灯上，记录结渠，拍照保存，8.5.2毛细管电泳荧光检测
8.5.2.1PCR产物样品准备
将6-FAM和IIEX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，TAMRA和R(X荧光标记的PCR产物稀释10倍。分别取等体积的上述1种稀释后溶液混合，从混合液中吸取1uI.加人到DNA分析仪专用深孔板孔中。板中孔分别加人0.11IZ500分了量内标和8.9uL去离于甲酰胺。将样品在PCR仪上95变性5min，取出，立即置于碎冰上，冷却10min以上。瞬时离心10s后置放到DNA分析仪1。
除待测样品外，每个SSR位点还应时包括2个～3个参照品种的扩增产物。注：不同荧光标记的扩增产物的最适稀释倍数最好通过毛细管电泳荧光检測预试验确定。8.5.2.2开机准备
打开DNA分析仪，检查仪器T作状态。更换缓冲液，灌胶。将装有样品的深孔板置放于样品架基座上。打开数据收集软件。
8.5.2.3编板
按照仪器操作程序，创建电泳板，输入电泳板名称，选择适合的程序和电冰板类型，输人样品编号或名称。
8.5.2.4运行程序
NA分析仪白动将毛细管电泳数据、运行参数等存放在仪器中。9等位变异数据采集
9.1数据表示
样品每个SSR位点的等位变异采用扩增片段大小的形式表示。9.2变性聚丙烯凝胶电泳与银染检测将某一位点待测样品和相成的参照品种扩增片段的带型和移动位置进行比较，根据参照品种的移动位置和扩增片段大小，确定待测样品该位点的等位变异大小，9.3毛细管电泳荧光检测
使用DNA分析仪的片段分析软件，读出每个位点每个样品的等位变异人小数据。比较参照品种的等位变异大小数据与附录C中参照品种机应的数据，两者之间的差值为系统误差，从待测样品的等位变异数据中去除该系统误差，得到的数据即为待测样品该位点的等位变异大小。示例1：参照品种*红1号”“L1花\在VWS00441位点上的等位变异大小分别为163hp和178bp+附录（\红1可”“早化\相应的数据分别为163hp和178bp，系统误差为2bp一个待测样品的等位变异大小原始数据为175hp测待测样品在该位点上的等位变异数据应为173bp示例2：参照品种\早花\，\K7\在BVWSH0948位点1的等位变异大小分别为259br和2671p，附录C中*早花”\K7\相应的数据分别为259bp>和267lp，系统误差为bp。一个待测样品的等位变异大小原始数据为261h>则待测样NY/T 2472—2013
品在该位点上的等位变异数据应为26:bp。9.4结果记录
纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X,杂合位点的等位变异数据记录为X/Y。其中X、Y为该位点上两个不同的等位变片段大小，小片段在前，大片段在后。无效等位变异的人小记录为0/0。示例1：一个品种在3VWS00658位点上右1个等位变异，大小为27nhF+测该品种在该位点上的等位变异数据记录为270/270，
示例2：个品种在BVWsS0.734位点上行2个等位变异，人小分别为217bp、230hFP，则该品种在该位点上的等位变异数据记录为217/239
9.5数据处理
一个位点2次重复检测数据相同时，该数据即为该位点的等位变异数据；2次重复不致时，增加第三个重复，以其中2个重复机同的检测数据为该位点的等位变异数据；当3次重复都不相同时，该位点视为无效位点，
10判定标准
依据附录C中的28个位点的核心引物检测结果进行判断：a）品种问差异位点数学3，判定为不伺品种；b）品种问差异位点数3，判定为近似品种。A.1主要仪器设备
A.1. 1PCR 核酸扩增仪。
A.1.2高压电泳仪。
附录A
（规范性附录）
仪器设备及试剂
A.1.3序列分析电泳槽及配套的制胶附件。A.1.4普通电泳仪。
5水平电泳槽及配套的制胶附件。A. 1. 5
水平摇床。
电了天平。
微量移液器，
胶片观察灯。
紫外分光光度计。
高压灭蘭器。
酸度计。
水浴锅。
制冰机。
凝胶成像系统或紫外透射仪。
A.2试剂
十六烷基三乙基溴化铵。
聚乙烯吡略咯烷酮。
氯仿，
异戊醇。
乙胺四乙酸二钠。
三羟F1基氨基中烷。
浓盐酸。
氢氧化钠
J)×TnaDNA聚合酶Buffer缀冲液（含Mg+）A. 2. 10
4种脱氧核白酸。
Taq DNA 聚合酶。
核酸染料。
去离了酰胺。
溴酚蓝。
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二甲苯背。
6双双丙烯酰胺
丙烯酰胺。
尿素。
亲和硅烷。
剥离硅烷。
无水乙醇。
四甲基乙一胺
过硫酸铵.
冰醋酸。
硝酸银。
甲醛，
3DNA分析仪用聚内烯酰胺胶液。A.2.29
DA分析仪用分子量内标，最大分于量500bp,Liz标记。A.2. 30
INA分析仪用光谱校准基质：包括6-FAM、TAMRA、HEX和ROX4种荧光染料标记的DNA片段，
A.2.31DNA分析仪用电缓冲液。
B.1DNA 提取溶液的配制
附录B
(规范性附录）
溶液配制
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B.1. 10.5mol/L乙二胺四乙酸二钠盐(ELYTA)(pH8.0)溶液称取186.1gNaEDTA211，加800mL去离了水，用固体Va0)H约20g调pH1至8.0，定容至1000ml，在103.4kPa(121%)条件下火菌20min。B.1.21 ml/L三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCI)(pH 8.0)溶液称取60.55gTris碱，济于适量去离了水中,加HCl调pH至8.0.定容全500mL，在103.4kIa(121%）条件卜火菌20mnin。
B. 1. 30. 5 ml/L 盐酸(HCI)溶液量取25mL浓盐酸（36%~-38%），加水定容至500ml。B.1.4DNA提取液
称取 20 g CTAB,81.82 NaCl,分别加人 100 mL 1 mol/L Tris -HICl 溶液(pH 8. 0)、10 tnL0.5mol/1FDTA溶液(pH8.0)和10gPVP,加人800mL去离子水，65℃水浴搅拌、溶解，定容至1000ml.。在103.4kPa121）条件F火菌20min。4℃保存。B 1. 5 24 : 1 氯仿一异戊醇
按241的比例（V：V)配制混个液。B. 1. 6 乙醇一乙醇胺溶液
称取0.1516g乙酸铵置人烧杯中，加人140mL无水乙醇，用去离子水定容至200ml。B.1.71×TE缓冲液
分别量取 5nL 1 mol/L Tris-IICI(pI18. 0),l mL0. 5mol/ LEDTA(pH8. 0),定容至500 mL.在103.4kPa121℃）条件下灭菌20min。4%保存。B. 2PCR 扩增溶液的配制
B. 2. 110 mmol/L dNTP 溶液
用超纯水分别配制AG、C、T终浓度100mm10l/1.的储存液，各取20L混介，用120μL超纯水定容至每种核作酸终浓度为10mmol/L.的工作液。在103.4kPa(121℃)条件下火菌20min，20℃保存。
注：也可使用购买的满足实验要求的商品试剂。B.2.2SSR 引物溶液
用超纯水分别配制正向引物和反向引物至浓度为5umol/L的T作液。B. 2. 310 × Taq DNA 聚合酶 PCH 缓冲液分别取 500 rmmol/L KCl、100 tnrnal/L Tris-TICt (pII8.0)和 0.01%明胶，在 103.4 kPa(121℃）条件下火菌20min.—20℃保存，B.2.425mmol/L氯化镁（MgClz)溶液称取MgClz1.190g，用么离子水溶解，定容至500mL，配制成251Itmol/L的工作液，在103.4kPa7
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（121%）条件下灭菌20min。—20℃保存。B.3变性骤丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制B.3. 110 × TBE缓冲液
分别称取Tris碱108g、硼酸55g.量取0.5mol/LEDTA（pH8.0)溶液37ml，加去离子水解，定容至1000ml
B.3.240%丙烯酰胺溶液
分别称取闪烯酰胺190%和甲叉双丙烯酰胺10g，置入烧杯中，加水溶解，定容至500mlB.3.36%变性聚丙烯酰胺凝胶溶液称取水素420g，用去离广水溶解，加入10×TBE缓冲液100ml，40%内烯酰胺胶溶液1501nL.定穿至 1000 mL
B.3.4亲和硅烷缓冲液
分别量取49.75ml.无水艺醇和250μl.冰醋酸，加去离-了水定容至50mL。B.3.5亲和硅烷工作液
在1ml.亲和挂烷缓冲液中加入5亲和硅烷原液，混勾。B.3.6剥离硅烷工作液
在98mL的三氛甲烷溶液中加人2一甲基一氯炜烧溶液，混勾。B.3.710%过硫酸铵溶液
称取0.10宫过硫酸铵，溶于1ml.去离了水巾，混匀。4℃保存。B.3.81×TBE缓冲液
量取10×TBF缓冲500ml，加离子水定容至5000nl。B.3.96×加样缓冲液
量取49mL98%的去离子甲酰胺（用于DNA变性）、0.5mol/L的ELTA溶液（pHI8.0)1mL,加人0.125名澳酚蓝、0.125g二甲苯青.混勾。4℃保存。B.4银染溶液的配制
B.4.1固定液
量取100tmL冰醋酸，加么离了水定容至1000ml。B.4.2染色液
称取1g硝较银,加去离子水溶解,定容至 1 000 mL。B.4.3显影液
量取100mL去离厂水，加人10g氢氧化钠和5ml.甲醛，混匀注：除非另右说明，仅适用分析纯试剂：芹号
核心引物见表1。
逆锁群
附录C
（规范性附录）
核心引物
引物序列(5'-3°)）
核心引物
正向引物：TCAAACUGACTGCCATATCABVWS00948
2RWS00155
Evwsn020?
iBVWS00314
BWS0048
RVWS00208
BVWS01734
BVWS00441
5BVWS00658
10BVWS00106
1113VwS01686
ByWS0189?
BVWS02433
EVWS00818:6
15 |BVWS013586
16BVWS00433
反引物：AGCTTTCTICCTGXITT
正向引物：IGGATCAITTGACAGATTTAGCGA反向物:CATCACAGTTAAXATCACAAGGC向物：ACAACTTIGATTGATIGACGATG反间引物AAGIGAAAGACXTTTTXXAAACF间物：GAGGAGAATCGGTTCTIGGACATA技向引物：TTGAGCATXTIGGACTATCATI正向物：TCAAAAGOTIIGCCTTAAATGAAA反向引物：TCTGATCCOCATTCTTAACCTC正间引物：GCAAAGATTGTCTATGAAGCAGCA反间物：GCTCATTGGCTICTTGAATTTT正向物，AAAATTACATCTTAAATGUGCC反间引物：GGAACATIGACTTUAATCAGCA正向引物：TGGTIGAAATCAATAAAAAGTGAA反间引物：TGGAIYTTTTTGGCATITGA正向叫物：TTAGCCTAAGCAAGGGTTTTT反向引物：AAGTACACATTTTAAACAATCAATUCA正向引物：TGGOCTAGAAGATTATTGAGT反向引物：CAITAICACATGGCAGATAAIGAAA正向物：TGGATAGAATGGAAAGKTCTGA反引物：TCACACATCATTC心AAAA
正向引物：TTITGAAACICAACXTCAAA反向引物：AAAGKYFIUGAGTGTGAGA正尚物：ATTTCTGGXXAGIGTAAG
反间引物:GAACAAUGCAACCALGTATG正向引物：CAACOGGTCTTCGTGAATTT反向物：XGCCACCACTTCTCATATT
向引物：CCCTATTGXXTATITTTCTCAA反向引物：AAATTTGTGCTICTIXIGGGIF向引物：TCTTTTAAGTTTTGAGGGAGAGG反向引物：TTXXAAGCTAGCTTIICA荧光
5'6-FAM
5'6-FAM
5'TAMRA
5'6-FAM
5'6 FAM
5'S-FAM
5'6 FAM
5'6 - FAM
(FITC)
S'TAMRA
NY/T 2472—2013
退火等位
温度变异
参照品种
PT296341-FR
早花,无极
PI296311 FR
长灰、点克仑生
早花、卡红
红1号、郝1号
长.卡红
红1号、无早
下红.2000-S52
红1号无授早
三白信凹91·2
小膏10号
红 1 号,无梗早
早花、K7
黑筋、都1号
红1号、无早
早花.K?
只花、K7
、卡红
红1号，无校早
黑蹦筋.都1号
红1号，校
早花.K7
红1号.无校
红「号、黑
花、部］号
红1号、元校
红1号、无权早
黑蹦筋、都1号
红1号、无权早
早花、K7
红1号、校早
早花、蜜宝
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