NY/T 2475-2013
基本信息
标准号： NY/T 2475-2013
中文名称：辣椒品种鉴定技术规程 SSR分子标记法
标准类别：农业行业标准(NY)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
NY/T 2475-2013 辣椒品种鉴定技术规程 SSR分子标记法
NY/T2475-2013
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标准内容
ICS 67.080.20
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 2475—2013
辣椒品种鉴定技术规程
SSR分子标记法
Identification of pepper varieties-SSR marker method2013-12-13发布
2014-04-01实施
中华人民共和国农业部
规范性引用文件
术语和定义
仪器设备放试剂
溶液配制
参照品种及其使
操作程序
10等位变异数据采集
1判定标准
仪器设备及试剂
附录A（规范性附录）
附录B规范性附录）溶液制...
附录规范性附录）
核心引物·
附录D(资料性附录）
参照品种名单
NY/T2475—2013
NY/T2475—2013
本标准按照GR/T1.1--2009给出的规则起草请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承拟识别这些专利的责任本标由农业部种手管理局提出。本标准由全国植物新品种测试标准化技术委员会(SAC/T℃277)归。本标准起草单位：中国农业科学院蔬菜花研究所、云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所、农业部科技发展中心。
本标准王娶起草人：张建华、张宝玺、管俊娇、毛胜利、王之浩、杨晓洪、张惠、张正海、王汀民、刘艳1范围
SSR分子标记法
辣椒品种鉴定技术规程
NY/T 2475--2013
本标准规定了利用简单重复序列（Simplescquence:rcpcats，SsR）分子标记进行辣椒（CupsicumL.)品种鉴定的试验方法、数据记录格式和判定标准。本标准适用于辣椒SSR标记分子数据的采集和品种鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的用文件，仪注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单适用于本文件。GB/T3543.2农作物种了检验规程扦样3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
核心引物
coreprimer
多态性好、PCR扩增稳定的一套SSR引物。3.2
参照品种referencevariety
对应丁SSR位点.上不同等位基因的一组品种。参照品种用于辅助确定待测样品等位基因的大小，校正仪器设备的系统误差，
4原理
SSR广泛分布于辣椒基因组中，不同品种间每个SSR位点重复单位的数量可能不同。由于每个SSR位点两侧的序列一般是高度保守和单拷贝的，因而可根据其两侧的序列设计一对特异引物，利用PCR技术对两条引物间的DNA序列进行扩增。在电泳过程中，主要由于SSR位点重复单位的数量不同引起的不同长度的[CR扩增片段在电场作用下得到分离，经硝酸银染色或者荧光染料标记加以区分。因此，根据SSR位点的多态性，利用PCR扩增和电泳技术可以鉴定辣椒品种。5仪器设备及试剂
仪器设备及试剂见附录A。
6溶液配制
溶液配制方法见附录。
7引物
引物相关信息见附录C。
8参照品种及其使用
参照品种的名称见附录,参照品种来源参见附录D，1
NY/T2475—2013
在进行等位变异检测时，应同时包括相应参照品种。注1：多个品种在某·SSR位点上可能都有相同的等位变异。在确认这些品种该位点等位变异人小与参照品种相同后，这些品种也可以代替附录（中的参照品种使用。注2：同名称不同来源的参照品种的某·位点上的等位变异可能不相同，在使用其他来源的参照而品种时，成与原参照品种核对，确认无误后使用
注3：对于附录（中未包括的等位变异，应按本标准的方法，确定其大小和对应参照品种，9操作程序
9.1重复设置
设定2次生物学重复。
9.2样品准备
种子样品的分样和保存，成符合GB/T3543.2的规定。每个品种分别取2个样品，每个样品30个个休（片)，等量混合。9.3DNA提取
来用CTAB法：收幼嫩组织卷好0.2g放人1.5tnL离心管中，在液氮中研碎；或将种子研，放入1.5mL离心管中。加400L预热（65%)的DNA提取液，烯匀：将离心管置人65℃恒温水浴45mim~60min，在此期问，每隔10min颠倒混句1次；取出离心管.冷却至室温；加人等休积的氯仿异戊醇（21：1)，轻缓颠倒混句，10000g离心10min转移f:清液200uL至另一支1.5ml离心管中，加人400μl.一20℃预冷无水乙醇沉淀DNA。10000g离心1ni1，弃清液，加50075%乙醇，洗涤沉淀2次，每次10min;室温风干，加100μLTE(pHI8.0)溶液溶解DNA。用紫外分光光度计检测DNA浓度，将DNA稀释到2001乌/μL，·20℃保存注：以上为推荐的一种TNA提取方法。所获DNA质量能够符合PR扩增需要的DNA提取方法都适用」本标谁
9.4PCR扩增
9. 4. 1反应体系
20μl的反应体积，含每种dNTPn.25mmol/L，I反向引物各0.3μumol/L，IagDNA聚合酶0.4U,1×PCR缓冲液(含 Mg2+）.样品 DNA 50 ng。利用毛细管电泳炎光检测时使用荧光标记的小物。引物的荧光染料种类见附录。注：反应休系的体积可以根据具体情况进行调整。9.4.2反应程序
9℃预变性4min：91%变性45.按附录C推荐的引物退火温度退火459,72℃延仲45%，其35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。9.5PCR产物检测
9.5.1变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染检测9.5.1.1清洗玻璃板
将玻璃板清洗干净，用去离了水冲洗后晾。用无水乙醇擦洗？遍，吸水纸擦干。在长板上涂上0.5ml.案和硅烷工作液，带凹槽的短板上涂0.5mL剥离硅烷T作液。操件过程中防止两块玻璃板卫相污染，
9.5.1.2组装玻璃板
玻璃板彻底十燥后，将其组装成电泳胶板，用水半仪调平。势片序度为0.4nm9.5.1.3制胶
在100mL6.U%PAGE胶中分别加人TEMEL)50μL和新配制的10%过硫酸铵溶液500mI迅速混勾后灌胶。待胶液充满玻璃板夹层，将0.4mm厚鲨鱼齿梳广平齐端向单轻轻插人胶液约0.4NY/T2475—2013
灌胶过程中防止出现气泡。使胶液聚合至少1h以上。胶聚合后.清理胶板表面滥出的胶液，轻轻拔出梳于，用水清洗+净备用。
9.5.1.4预电泳
将胶板安装下电泳剂.l:，向上槽中加人约800ml.预热至65%的0.25XTBE缓冲液，使其超过凝胶顶部约3cm，向下槽中加人800mL1×TBE缓冲液。在60W恒功率下，预电泳20tmin~30min，9.5.1.5样品制备
在20.PCR样品中加人8uL上样缓冲液，混匀。在水浴锅或PCR仪.上95℃变性5mi1.取山，迅速置于碎冰上，
9.5.1.6电泳
用注射器吸取缓冲液冲洗凝胶顶端儿次，清除气泡和聚丙烯酰胺碎片。将鲨鱼齿梳子梳齿端插人凝胶1mm-2nm。每一个加样孔点人2μl~-3μl.样品。除待测样品外，还应同时加人参照品种扩增产物。在50W~80W问功率下电泳，使凝胶温度保持在约50%>。电泳1.5l~2.5h（电泳时间取决于扩增片段的大小范围）。电泳结束后，小心分开两块玻璃板，取下凝胶附的长玻璃板准备固定。注：具体功率大小根据电泳槽的规格型号和实验室室温设定。9.5.1.7银染
a）固定：将凝胶附着的长玻璃板置于塑料盒中，加人约1000ml.银染固定液，使固定液没过凝胶，在摇床上轻轻晃动20nmin～30mis漂洗：取出玻璃板，在去离子水中漂洗1次-~2次，每次2minb)
染色：将玻璃板置放人约1000ml.染色液中，使染色液没过凝胶，在摇床上轻轻晃动30min；c
d）漂洗：在去离子水中快速漂洗，时间不超过10s号显影：将玻璃板在预冷的显影液中轻轻晃动至山现清晰节纹，e)
定影：将凝胶在固定液中定影5minf
g）漂洗：在去离子水中漂洗1min。9.5.2毛细管电泳荧光检测
9.5.2.1PCR产物样品准备
将6-FAM和HFX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，TAMRA和ROX炭光标记的PCR产物稀释10倍。分别取等体积的上述4种稀释后溶液混合，从混合液中吸取1uL加入到DNA分析仪专用深孔板孔中。板中各孔分别加人0.1L1.17500分了量内标和8.9=l.冬离子甲酰胺。将样品在PCR仪上95℃变性5min，取出立即置丁碎冰上，却10min以上。瞬时离心10s后置放到IDNA分析仪上。
除待测样品外，每个SSR位点还成同时包括2个～3个参照品种的扩增产物。注：不荧光标记的扩增产物的最适稀释倍数最好道过毛细管电泳荧光检测预试验确定。9.5.2.2开机准备
打开DVA分析仪，检查仪器工作状态。更换缓冲液，灌胶。将装有样品的深孔板置放于样品架基座上。打开数据收集软件。
9.5. 2.3编板
按照仪器操作程序，创建电泳板，输人电泳板名称，选择适合的程序和电冰板类型，输人样品编号或名称。
9.5.2.4运行程序
TNA分析仪自动将毛细管电泳数据、运行参数等存放在仪器中10等位变异数据采集
10.1数据表示
NY/T2475--2013
样品每个SSR位点的等位变异采用扩增片段大小的形式表示。10.2变性聚丙烯凝胶电泳与银染检测将某位点待测样品和相应的参照品种扩增片段的带型和移动位置进行比较，根据参照品种的移动位置和扩增片段人小，确定待测样品该位点的等位变异人小。10.3毛细管电泳荧光检测
使用INA分析仪的片段分析软件，读出每个位点每个样品的等位变异人小数据，比较参照品利的等位变异人小数据与附录（中参照品种相应的数据，两者之间的差值为系统误差。从待测样品的等位变异数据中去除该系统误差，得到的数据即为待测样品该位点的等位变异大小。示例1：参照品种“湘辣4号”“一金条\在Es297位点上的等位变片大小分别为118bp和124hp，附录C中“附球1 号\。“_:金条\和应的数据分别为 12G lbp 和 122 bp,系统误差为 2 bp。 ~个待测样品的等位变异大小原始数据为120bp.则待测样品在该位点上的等位变算数据应为1:8bp，示例2：参照品补\研4号”“苏椒13号”机椒：号\在Epms697位点上的等位变异人小为106bp.115lp和118bp.附录t:中“翼研1号\“苏椒13\和\杭椒1号\相应的数据分别为106bp.115bp和118hp，系统误差为0bp。一个待测样品的等位变异大小原始数据为106bp.则待测样品在该位点上的等位变异数据应为106E=p。10.4结果记录
纯合位点的等位变异记录为X/X，杂合位点的等位变异记录为X/Y。其中X、Y为该位点上2个不同的等位变异片段大小，小片段在前，人片段在后，无效等位变异的人小记录为0/0。示例1：个品种在Es297位点上有1个等位变异，大小为122bp，则该品种在该位点上.的等位变异数据记录为122/122.
示例2：一个品种在Fpms697位点1有2个等位变异：大小分别为106bp、115bp，则该品种在该位点上的等位变异数据记录为106/115
10.5数据处理
个位点2次重复检测数据相同时，该位点的等位变异数据即为该数据。2次重复不一致时，增加第三个重复，以其2个重复相同的检測数据为该位点的等位变异数据。当3次重复结果都不相同时，该位点视为无效位点。
11判定标准
依据22对引物的检测结果进行判定：a）品种间差异位点数3，判定为不同品种；b）品种间差异位点数3,判定为近似品种。主要仪器设备
A. 1. 1PCR 扩增仪。
高压电泳仪。
3电泳槽及配套的制胶附件。
附录A
(规范性附录）
仪器设备及试剂
NY/T2475—2013
A.1.4水平电泳槽及配套的制胶附件。5TNA分析仪：基丁毛细管电泳，有片段分析功能和数据分析软件，能够分辨最少1个核皆酸的A 1.5
差异。
高速离心机。
水平摇床。
胶片观察灯。
电了天平。
微量移液器。
紫外分光光度计。
高压灭菌锅。
磁力搅拌器。
A.1.14水浴锅、
5冰箱。
A.1.16凝胶成像系统或紫外透射仪。2试剂
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。A.2.1十八烷基-.乙基溴化铵(CTAB)。A.2.2聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
3三氯甲烷(chlaroform)。
A.2.4异戊醇(iso-Propyl alcohol)。A.2.5
乙二胺四乙酸二钠(EIA·Na)，
:三羟甲基氨基甲烷(Tris)。
A.2.7浓盐酸(IICI)。
A.2.8氢氧化钠(NaOH）。
A. 2. 9 Taq DNA 聚合酶。
10XPCR缓冲液。
氯化钠(NaC)>
NY/T2475—2013
24种脱氧核糖核节酸、
3SSR引物。
A.2.14矿物
5琼脂糖，
5核酸染色剂。
去离子甲酰胺。
漠酚蓝。
于叉双丙烯酰胺。
丙烯酰胺。
碘酸。
尿素。
亲和硅烷。
刺离硅烷。
无水乙醇。
四H基乙二胺（TEMED)，
过硫酸铵(APS)。
冰醋酸。
硝酸银（AgN)。
甲醛。
DNA分析仪用紧丙烯酰胺胶液。
3DNA分析仪用分子量内标：最大分子量500hp，l.iz.标记，A.2.34DNA分析仪用光谱校准基质：包括6-FAM、TAMRA.HEX和R(X 4种荧光染料标记的DNA片段。
5INA分析仪用电泳缓冲液。
B.1DNA提取溶液的配制
附录B
(规范性附录）
溶液配制
NY/T 2475—2013
B.1.11mol/L氢氧化钠溶液
称取10.0g氢氧化钠，溶于800mL去离厂水中，冷却至室温，定容至1000ml。B. 1. 20. 5 mol/ L 盐酸溶液
量取25mL36%~38%浓盐胶.加离子水定容至500mL。B.1.30.5mol/L乙二胺四乙酸二钠盐(pH8.0)溶液称取186.1g乙二胺四乙酸钠盐，加人800ml.去离水，再加人20g氧氧化钠，搅拌。待乙二胺四乙酸二钠完全溶解后，冷却率室温。再用氢氧化钠溶液（I1.1)准确调pII至8.0.定容至1000mL，在103.4kPa(121℃）条件下灭菌20minB.1.41mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸(pHl8.0)溶液称取60.55三羟甲基氨基中烷，溶」400nL去离了水中，用盐酸猝液(B.1.2)调PFHI至8.0，定容至500ml，在103.4kPa（121℃）条件下火菌20minaB. 1. 5 DNA 提取液
分别称取20.0g1六烷基三乙基溴化铵和81.82g氯化钠，分别入40ml.乙二胺四乙酸二钠盐溶液(pH8.0)(R.1.3)、100ml.1mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液(plI8.0)(B.1.4)和10.0g聚乙烯吡咯烷阐（PVP），再加入800ml.去离子水，65℃水浴中加热溶解，冷却后定容至1000ml在103.4kla(121℃)条件下火菌20 min，于4℃保存，B.1.6三氯甲烷一异戊醇混合液
V三氯甲烷）：V（异戊醇）241
B.1.7 TE缓冲液
分别量取5ml.二羟甲基氨基甲烷盐酸溶液（pH8.0）(B.1.4)和1mL乙二胺四乙酸\钠盐溶液(plI8.0）（B.1.3)，定容至500ml.，在103.4kPa(121℃）条件下灭菌20min。丁4%）下保存。B. 2 PCR 扩增溶液的配制
B. 2. 1 SSR 引物溶液
用超纯水分别配制正向引物和反向引物浓度为10mol/L的工作液。B.3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制B.3.110×TBE缓冲液
分别称取108.0g三羟甲基氢基甲烷和55.0g硼酸，溶于800ml.去离了水巾，加人37ml.乙一胺四乙酸二钠盐溶液（pH8.0)(B3.1.3),定容率1(00 mIB.3.240%丙烯酰胺溶液
分别称取190.0g丙烯酰胺和10.0g叉双内烯酰胺，济十400mL去离了水中，定容至500mLsB.3.36%变性聚丙烯酰胺胶溶液
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称取420.0g尿素，用去离了水溶解，分别加人100mI.10×TBE缓冲液（B.3.1)和150ml.40%内烯酰胺溶液（B.3.2），定容全1000ml.。B.3.4亲和硅烷缓冲液
分别量取19.75ml.无水乙醇和250山冰酷酸，去离子水定容至50mLB.3.5亲和硅烷工作液
分别量取5ul.亲和件烷和1mL亲和硅烷缓冲液，混勾B.3.6剥离硅烷工作液
分别量取98mL一氯甲烷溶液和2ml.二甲基二氟硅烷溶液，混勾。B.3.710%过硫酸铵溶液
称取1.0过硫酸铵，溶于10去离子水中，混勾。于一4℃保存。B.3.81×TBE缓冲液
量取500mI.10×TBE缓冲液（B.3.1），用去离子水定容至5000mL。B.3.96×加样缓冲液
分别称取0.25g漠酚蓝和0.25二甲苯青，分别加人98mL去离子甲酰胺羽1mL乙胺四乙酸钠盐溶液(pHT8.0),搅拌济解。
B.4银染溶液的配制
B.4.1固定液
量取100mL冰醋酸，加人1000mL去离子水。B.4.2染色液
称取1.g硝酸银，溶于1000ml.去离了水中。B.4.3显影液
称取10g氢氧化钠，溶丁1000mL去离子水中，再入5rnl.甲醛。基本核心引物见表C1。
Epm5-923
s1-214
Epts697
附录C
（规范性附录）
核心引物
表 C.1基本核心引物
引物序列(5°3')
F:GTAGCCATGGCAGAATTGGAAG
R: TTCAGCAGGTTCIGGTTCTGKT
F:CGCATCTACAICAAGAATCAACCA
R:GATGIAGAACAAGGAAGCAGGHG
F,GAGGAATTTTGGAGCCACACAC
R:AGGTGAAATGGGCAGTGGTAGA
F:CAAAAOCAAATAGGTCCGCC
R:CGCGCAATAATTCAATATCG
F: TGGAGTACXAGTTCITIUTAG
R:GGCAGTCCIGGGACAACTOG
F:ATGTCGGTXCAATTIUACT
R:CTAGKAGGAGCGATAGAG
F:CGGCCAAATTATTTTTECCAGT
R:TTCECATAGTTGAAGAGXIG
F: TACGTTCCTCATXXAGAAGA
R:AGGATACCAAIGTITTGUCTC
F,XTTCCCTTITCTOCCTTTT
R:CAGAAACAGCATTGATGATG
5'HIEX
5'TAMAR
5'6-FAM
S'TAMAR
NY/T 2475—2013
退火温度，℃
等位变片，bp
5'TAMRA
5'TAMRA
参照品种
杭橄1号www.bzxz.net
京甜1号
湘研：6号
热辣2号
辛香8号
湘掠1号
黄太了
热2号
杭椒1号
辛弄9号
福：号
苏椒13号
黄太子
辛8号
热辣2号
黄太子
杭椒1号
热辣2号
中報108号
国塔104
冀研4号
苏椒13号
杭椒1号
热辣2号
同塔109
搬1号
杭搬1号
热辣≥号
黄太子
杭椒1
赤椒13号
湘研16号
黄太子
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中华人民共和国农业行业标准
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辣椒品种鉴定技术规程
SSR分子标记法
Identification of pepper varieties-SSR marker method2013-12-13发布
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术语和定义
仪器设备放试剂
溶液配制
参照品种及其使
操作程序
10等位变异数据采集
1判定标准
仪器设备及试剂
附录A（规范性附录）
附录B规范性附录）溶液制...
附录规范性附录）
核心引物·
附录D(资料性附录）
参照品种名单
NY/T2475—2013
NY/T2475—2013
本标准按照GR/T1.1--2009给出的规则起草请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承拟识别这些专利的责任本标由农业部种手管理局提出。本标准由全国植物新品种测试标准化技术委员会(SAC/T℃277)归。本标准起草单位：中国农业科学院蔬菜花研究所、云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所、农业部科技发展中心。
本标准王娶起草人：张建华、张宝玺、管俊娇、毛胜利、王之浩、杨晓洪、张惠、张正海、王汀民、刘艳1范围
SSR分子标记法
辣椒品种鉴定技术规程
NY/T 2475--2013
本标准规定了利用简单重复序列（Simplescquence:rcpcats，SsR）分子标记进行辣椒（CupsicumL.)品种鉴定的试验方法、数据记录格式和判定标准。本标准适用于辣椒SSR标记分子数据的采集和品种鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的用文件，仪注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单适用于本文件。GB/T3543.2农作物种了检验规程扦样3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
核心引物
coreprimer
多态性好、PCR扩增稳定的一套SSR引物。3.2
参照品种referencevariety
对应丁SSR位点.上不同等位基因的一组品种。参照品种用于辅助确定待测样品等位基因的大小，校正仪器设备的系统误差，
4原理
SSR广泛分布于辣椒基因组中，不同品种间每个SSR位点重复单位的数量可能不同。由于每个SSR位点两侧的序列一般是高度保守和单拷贝的，因而可根据其两侧的序列设计一对特异引物，利用PCR技术对两条引物间的DNA序列进行扩增。在电泳过程中，主要由于SSR位点重复单位的数量不同引起的不同长度的[CR扩增片段在电场作用下得到分离，经硝酸银染色或者荧光染料标记加以区分。因此，根据SSR位点的多态性，利用PCR扩增和电泳技术可以鉴定辣椒品种。5仪器设备及试剂
仪器设备及试剂见附录A。
6溶液配制
溶液配制方法见附录。
7引物
引物相关信息见附录C。
8参照品种及其使用
参照品种的名称见附录,参照品种来源参见附录D，1
NY/T2475—2013
在进行等位变异检测时，应同时包括相应参照品种。注1：多个品种在某·SSR位点上可能都有相同的等位变异。在确认这些品种该位点等位变异人小与参照品种相同后，这些品种也可以代替附录（中的参照品种使用。注2：同名称不同来源的参照品种的某·位点上的等位变异可能不相同，在使用其他来源的参照而品种时，成与原参照品种核对，确认无误后使用
注3：对于附录（中未包括的等位变异，应按本标准的方法，确定其大小和对应参照品种，9操作程序
9.1重复设置
设定2次生物学重复。
9.2样品准备
种子样品的分样和保存，成符合GB/T3543.2的规定。每个品种分别取2个样品，每个样品30个个休（片)，等量混合。9.3DNA提取
来用CTAB法：收幼嫩组织卷好0.2g放人1.5tnL离心管中，在液氮中研碎；或将种子研，放入1.5mL离心管中。加400L预热（65%)的DNA提取液，烯匀：将离心管置人65℃恒温水浴45mim~60min，在此期问，每隔10min颠倒混句1次；取出离心管.冷却至室温；加人等休积的氯仿异戊醇（21：1)，轻缓颠倒混句，10000g离心10min转移f:清液200uL至另一支1.5ml离心管中，加人400μl.一20℃预冷无水乙醇沉淀DNA。10000g离心1ni1，弃清液，加50075%乙醇，洗涤沉淀2次，每次10min;室温风干，加100μLTE(pHI8.0)溶液溶解DNA。用紫外分光光度计检测DNA浓度，将DNA稀释到2001乌/μL，·20℃保存注：以上为推荐的一种TNA提取方法。所获DNA质量能够符合PR扩增需要的DNA提取方法都适用」本标谁
9.4PCR扩增
9. 4. 1反应体系
20μl的反应体积，含每种dNTPn.25mmol/L，I反向引物各0.3μumol/L，IagDNA聚合酶0.4U,1×PCR缓冲液(含 Mg2+）.样品 DNA 50 ng。利用毛细管电泳炎光检测时使用荧光标记的小物。引物的荧光染料种类见附录。注：反应休系的体积可以根据具体情况进行调整。9.4.2反应程序
9℃预变性4min：91%变性45.按附录C推荐的引物退火温度退火459,72℃延仲45%，其35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。9.5PCR产物检测
9.5.1变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染检测9.5.1.1清洗玻璃板
将玻璃板清洗干净，用去离了水冲洗后晾。用无水乙醇擦洗？遍，吸水纸擦干。在长板上涂上0.5ml.案和硅烷工作液，带凹槽的短板上涂0.5mL剥离硅烷T作液。操件过程中防止两块玻璃板卫相污染，
9.5.1.2组装玻璃板
玻璃板彻底十燥后，将其组装成电泳胶板，用水半仪调平。势片序度为0.4nm9.5.1.3制胶
在100mL6.U%PAGE胶中分别加人TEMEL)50μL和新配制的10%过硫酸铵溶液500mI迅速混勾后灌胶。待胶液充满玻璃板夹层，将0.4mm厚鲨鱼齿梳广平齐端向单轻轻插人胶液约0.4
灌胶过程中防止出现气泡。使胶液聚合至少1h以上。胶聚合后.清理胶板表面滥出的胶液，轻轻拔出梳于，用水清洗+净备用。
9.5.1.4预电泳
将胶板安装下电泳剂.l:，向上槽中加人约800ml.预热至65%的0.25XTBE缓冲液，使其超过凝胶顶部约3cm，向下槽中加人800mL1×TBE缓冲液。在60W恒功率下，预电泳20tmin~30min，9.5.1.5样品制备
在20.PCR样品中加人8uL上样缓冲液，混匀。在水浴锅或PCR仪.上95℃变性5mi1.取山，迅速置于碎冰上，
9.5.1.6电泳
用注射器吸取缓冲液冲洗凝胶顶端儿次，清除气泡和聚丙烯酰胺碎片。将鲨鱼齿梳子梳齿端插人凝胶1mm-2nm。每一个加样孔点人2μl~-3μl.样品。除待测样品外，还应同时加人参照品种扩增产物。在50W~80W问功率下电泳，使凝胶温度保持在约50%>。电泳1.5l~2.5h（电泳时间取决于扩增片段的大小范围）。电泳结束后，小心分开两块玻璃板，取下凝胶附的长玻璃板准备固定。注：具体功率大小根据电泳槽的规格型号和实验室室温设定。9.5.1.7银染
a）固定：将凝胶附着的长玻璃板置于塑料盒中，加人约1000ml.银染固定液，使固定液没过凝胶，在摇床上轻轻晃动20nmin～30mis漂洗：取出玻璃板，在去离子水中漂洗1次-~2次，每次2minb)
染色：将玻璃板置放人约1000ml.染色液中，使染色液没过凝胶，在摇床上轻轻晃动30min；c
d）漂洗：在去离子水中快速漂洗，时间不超过10s号显影：将玻璃板在预冷的显影液中轻轻晃动至山现清晰节纹，e)
定影：将凝胶在固定液中定影5minf
g）漂洗：在去离子水中漂洗1min。9.5.2毛细管电泳荧光检测
9.5.2.1PCR产物样品准备
将6-FAM和HFX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，TAMRA和ROX炭光标记的PCR产物稀释10倍。分别取等体积的上述4种稀释后溶液混合，从混合液中吸取1uL加入到DNA分析仪专用深孔板孔中。板中各孔分别加人0.1L1.17500分了量内标和8.9=l.冬离子甲酰胺。将样品在PCR仪上95℃变性5min，取出立即置丁碎冰上，却10min以上。瞬时离心10s后置放到IDNA分析仪上。
除待测样品外，每个SSR位点还成同时包括2个～3个参照品种的扩增产物。注：不荧光标记的扩增产物的最适稀释倍数最好道过毛细管电泳荧光检测预试验确定。9.5.2.2开机准备
打开DVA分析仪，检查仪器工作状态。更换缓冲液，灌胶。将装有样品的深孔板置放于样品架基座上。打开数据收集软件。
9.5. 2.3编板
按照仪器操作程序，创建电泳板，输人电泳板名称，选择适合的程序和电冰板类型，输人样品编号或名称。
9.5.2.4运行程序
TNA分析仪自动将毛细管电泳数据、运行参数等存放在仪器中10等位变异数据采集
10.1数据表示
NY/T2475--2013
样品每个SSR位点的等位变异采用扩增片段大小的形式表示。10.2变性聚丙烯凝胶电泳与银染检测将某位点待测样品和相应的参照品种扩增片段的带型和移动位置进行比较，根据参照品种的移动位置和扩增片段人小，确定待测样品该位点的等位变异人小。10.3毛细管电泳荧光检测
使用INA分析仪的片段分析软件，读出每个位点每个样品的等位变异人小数据，比较参照品利的等位变异人小数据与附录（中参照品种相应的数据，两者之间的差值为系统误差。从待测样品的等位变异数据中去除该系统误差，得到的数据即为待测样品该位点的等位变异大小。示例1：参照品种“湘辣4号”“一金条\在Es297位点上的等位变片大小分别为118bp和124hp，附录C中“附球1 号\。“_:金条\和应的数据分别为 12G lbp 和 122 bp,系统误差为 2 bp。 ~个待测样品的等位变异大小原始数据为120bp.则待测样品在该位点上的等位变算数据应为1:8bp，示例2：参照品补\研4号”“苏椒13号”机椒：号\在Epms697位点上的等位变异人小为106bp.115lp和118bp.附录t:中“翼研1号\“苏椒13\和\杭椒1号\相应的数据分别为106bp.115bp和118hp，系统误差为0bp。一个待测样品的等位变异大小原始数据为106bp.则待测样品在该位点上的等位变异数据应为106E=p。10.4结果记录
纯合位点的等位变异记录为X/X，杂合位点的等位变异记录为X/Y。其中X、Y为该位点上2个不同的等位变异片段大小，小片段在前，人片段在后，无效等位变异的人小记录为0/0。示例1：个品种在Es297位点上有1个等位变异，大小为122bp，则该品种在该位点上.的等位变异数据记录为122/122.
示例2：一个品种在Fpms697位点1有2个等位变异：大小分别为106bp、115bp，则该品种在该位点上的等位变异数据记录为106/115
10.5数据处理
个位点2次重复检测数据相同时，该位点的等位变异数据即为该数据。2次重复不一致时，增加第三个重复，以其2个重复相同的检測数据为该位点的等位变异数据。当3次重复结果都不相同时，该位点视为无效位点。
11判定标准
依据22对引物的检测结果进行判定：a）品种间差异位点数3，判定为不同品种；b）品种间差异位点数3,判定为近似品种。主要仪器设备
A. 1. 1PCR 扩增仪。
高压电泳仪。
3电泳槽及配套的制胶附件。
附录A
(规范性附录）
仪器设备及试剂
NY/T2475—2013
A.1.4水平电泳槽及配套的制胶附件。5TNA分析仪：基丁毛细管电泳，有片段分析功能和数据分析软件，能够分辨最少1个核皆酸的A 1.5
差异。
高速离心机。
水平摇床。
胶片观察灯。
电了天平。
微量移液器。
紫外分光光度计。
高压灭菌锅。
磁力搅拌器。
A.1.14水浴锅、
5冰箱。
A.1.16凝胶成像系统或紫外透射仪。2试剂
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。A.2.1十八烷基-.乙基溴化铵(CTAB)。A.2.2聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
3三氯甲烷(chlaroform)。
A.2.4异戊醇(iso-Propyl alcohol)。A.2.5
乙二胺四乙酸二钠(EIA·Na)，
:三羟甲基氨基甲烷(Tris)。
A.2.7浓盐酸(IICI)。
A.2.8氢氧化钠(NaOH）。
A. 2. 9 Taq DNA 聚合酶。
10XPCR缓冲液。
氯化钠(NaC)>
NY/T2475—2013
24种脱氧核糖核节酸、
3SSR引物。
A.2.14矿物
5琼脂糖，
5核酸染色剂。
去离子甲酰胺。
漠酚蓝。
于叉双丙烯酰胺。
丙烯酰胺。
碘酸。
尿素。
亲和硅烷。
刺离硅烷。
无水乙醇。
四H基乙二胺（TEMED)，
过硫酸铵(APS)。
冰醋酸。
硝酸银（AgN)。
甲醛。
DNA分析仪用紧丙烯酰胺胶液。
3DNA分析仪用分子量内标：最大分子量500hp，l.iz.标记，A.2.34DNA分析仪用光谱校准基质：包括6-FAM、TAMRA.HEX和R(X 4种荧光染料标记的DNA片段。
5INA分析仪用电泳缓冲液。
B.1DNA提取溶液的配制
附录B
(规范性附录）
溶液配制
NY/T 2475—2013
B.1.11mol/L氢氧化钠溶液
称取10.0g氢氧化钠，溶于800mL去离厂水中，冷却至室温，定容至1000ml。B. 1. 20. 5 mol/ L 盐酸溶液
量取25mL36%~38%浓盐胶.加离子水定容至500mL。B.1.30.5mol/L乙二胺四乙酸二钠盐(pH8.0)溶液称取186.1g乙二胺四乙酸钠盐，加人800ml.去离水，再加人20g氧氧化钠，搅拌。待乙二胺四乙酸二钠完全溶解后，冷却率室温。再用氢氧化钠溶液（I1.1)准确调pII至8.0.定容至1000mL，在103.4kPa(121℃）条件下灭菌20minB.1.41mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸(pHl8.0)溶液称取60.55三羟甲基氨基中烷，溶」400nL去离了水中，用盐酸猝液(B.1.2)调PFHI至8.0，定容至500ml，在103.4kPa（121℃）条件下火菌20minaB. 1. 5 DNA 提取液
分别称取20.0g1六烷基三乙基溴化铵和81.82g氯化钠，分别入40ml.乙二胺四乙酸二钠盐溶液(pH8.0)(R.1.3)、100ml.1mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液(plI8.0)(B.1.4)和10.0g聚乙烯吡咯烷阐（PVP），再加入800ml.去离子水，65℃水浴中加热溶解，冷却后定容至1000ml在103.4kla(121℃)条件下火菌20 min，于4℃保存，B.1.6三氯甲烷一异戊醇混合液
V三氯甲烷）：V（异戊醇）241
B.1.7 TE缓冲液
分别量取5ml.二羟甲基氨基甲烷盐酸溶液（pH8.0）(B.1.4)和1mL乙二胺四乙酸\钠盐溶液(plI8.0）（B.1.3)，定容至500ml.，在103.4kPa(121℃）条件下灭菌20min。丁4%）下保存。B. 2 PCR 扩增溶液的配制
B. 2. 1 SSR 引物溶液
用超纯水分别配制正向引物和反向引物浓度为10mol/L的工作液。B.3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制B.3.110×TBE缓冲液
分别称取108.0g三羟甲基氢基甲烷和55.0g硼酸，溶于800ml.去离了水巾，加人37ml.乙一胺四乙酸二钠盐溶液（pH8.0)(B3.1.3),定容率1(00 mIB.3.240%丙烯酰胺溶液
分别称取190.0g丙烯酰胺和10.0g叉双内烯酰胺，济十400mL去离了水中，定容至500mLsB.3.36%变性聚丙烯酰胺胶溶液
NY/T2475—2013
称取420.0g尿素，用去离了水溶解，分别加人100mI.10×TBE缓冲液（B.3.1)和150ml.40%内烯酰胺溶液（B.3.2），定容全1000ml.。B.3.4亲和硅烷缓冲液
分别量取19.75ml.无水乙醇和250山冰酷酸，去离子水定容至50mLB.3.5亲和硅烷工作液
分别量取5ul.亲和件烷和1mL亲和硅烷缓冲液，混勾B.3.6剥离硅烷工作液
分别量取98mL一氯甲烷溶液和2ml.二甲基二氟硅烷溶液，混勾。B.3.710%过硫酸铵溶液
称取1.0过硫酸铵，溶于10去离子水中，混勾。于一4℃保存。B.3.81×TBE缓冲液
量取500mI.10×TBE缓冲液（B.3.1），用去离子水定容至5000mL。B.3.96×加样缓冲液
分别称取0.25g漠酚蓝和0.25二甲苯青，分别加人98mL去离子甲酰胺羽1mL乙胺四乙酸钠盐溶液(pHT8.0),搅拌济解。
B.4银染溶液的配制
B.4.1固定液
量取100mL冰醋酸，加人1000mL去离子水。B.4.2染色液
称取1.g硝酸银，溶于1000ml.去离了水中。B.4.3显影液
称取10g氢氧化钠，溶丁1000mL去离子水中，再入5rnl.甲醛。基本核心引物见表C1。
Epm5-923
s1-214
Epts697
附录C
（规范性附录）
核心引物
表 C.1基本核心引物
引物序列(5°3')
F:GTAGCCATGGCAGAATTGGAAG
R: TTCAGCAGGTTCIGGTTCTGKT
F:CGCATCTACAICAAGAATCAACCA
R:GATGIAGAACAAGGAAGCAGGHG
F,GAGGAATTTTGGAGCCACACAC
R:AGGTGAAATGGGCAGTGGTAGA
F:CAAAAOCAAATAGGTCCGCC
R:CGCGCAATAATTCAATATCG
F: TGGAGTACXAGTTCITIUTAG
R:GGCAGTCCIGGGACAACTOG
F:ATGTCGGTXCAATTIUACT
R:CTAGKAGGAGCGATAGAG
F:CGGCCAAATTATTTTTECCAGT
R:TTCECATAGTTGAAGAGXIG
F: TACGTTCCTCATXXAGAAGA
R:AGGATACCAAIGTITTGUCTC
F,XTTCCCTTITCTOCCTTTT
R:CAGAAACAGCATTGATGATG
5'HIEX
5'TAMAR
5'6-FAM
S'TAMAR
NY/T 2475—2013
退火温度，℃
等位变片，bp
5'TAMRA
5'TAMRA
参照品种
杭橄1号www.bzxz.net
京甜1号
湘研：6号
热辣2号
辛香8号
湘掠1号
黄太了
热2号
杭椒1号
辛弄9号
福：号
苏椒13号
黄太子
辛8号
热辣2号
黄太子
杭椒1号
热辣2号
中報108号
国塔104
冀研4号
苏椒13号
杭椒1号
热辣2号
同塔109
搬1号
杭搬1号
热辣≥号
黄太子
杭椒1
赤椒13号
湘研16号
黄太子
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