NY/T 2594-2014 植物品种鉴定 DNA指纹方法 总则 NY/T2594-2014 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

ICS 65.020.01
中华人民共和国农业行业标准
NY/T2594-2014
植物品种鉴定
DNA指纹方法
General guideline for identification of plant varieties by DNA fingerprinting2014-03-24发布
2014-06-01实施
中华人民共和国农业部发布
范围·
2规范性引用文件
术谱和定义
技术方法及检测平台
样品要求
试验程序
数据库构建
判定标准
NY/T 2594—2014
Y/T 2594—2014
本标准按照F1.1—26给出的规则起节，请注意本文件的某些内容可能涉及专利.木文件的发布机构不承担认别这些专利的贵任本标推出中华人民共和国农业部提山本标准由全国植物新品种测试标准化技术委员会（SAC/TC277)口本标准起草单位：北京农标科学院玉米研究中心农业部科技发展中心：本标准手要起草人：土凤格、易红薄、赵久然吕波，苑苑、的红丽1范围
植物品种鉴定DNA指纹方法总则
NY/T 2594-2014
本标准规定了植物品种)NA指纹鉴定的基本原则、通用方法（或程序）及判楚标准。本标准适用于站物品种！NA措纹鉴定方法的建立：2规范性引用文件
下列文件对于木文件的成是必不可少的，凡是F期的引用义件.仅注口期的版木适用于本文件、凡尼不注日期的引用文件.其最新版本(包括所有的修收单)适用下本文件GB/T19557.1-2004植物新品种特异性、-致注和稳定性测试指南总则3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
DvA指纹技术DNAfingerprintingterhnology由十不同品种叫遗传物质D>A的碱基组分、排列顺序不同，具有尚度的特异性，将能够川视化识别遗传物质NA的械基纠分，H列顺序差异而区分不同品种的技不称为INA指纹技术，3.2
简单重复序列simplesequence repeal(SSR)类巾几个核自酸（般为2个-5个)为正复单位组成的菌单联复序列。根共保守的边界序列设川物，可通过P尺电流技术分析重复序死的重复次数变片3.3
单核苷酸多态性singfe nuclentidle polymorphism(SVP)指在内组水上由单个核件酸的变异所起的A序列多态性3.4
核心引物coreprimer
指品种1VA批纹鉴定优先选用的一套SSR引物，具有多态性高平复性好等综合特性·作为统一用于品种DNA指纹数据采集和品种鉴定的可物，以保证不向实验室数热具有可比性。3.5
参照品种referencevariety
对应十特定位点不同等位变异的一组品种.用丁辅助确定待测样品在某个位点等位变异扩增片段的大小，校止仪器设备的系统误并，以保证不同实验室数拥其有可比性4原理
巾于不间品利的基因组IA存作核酸序列差异（如简单重复序列的重复次数差异或单核苷酸差异），这种关异而采用PCR扩增及电泳、芯片杂交、测序等检测手段获得的A拆纹加以区分.从而对不同品耐进行鉴定。
5技术方法及检测平台
5.1DNA指纹技术
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5.1.1DNA指纹技术选择的基本原则\）标记多态性「宦；
实验重复性好：
数据易丁标准化；
(l）标记位点分布情况清楚：
标沉为其显性：
[技术不受专利限制;
\）技术成熟：
5.1. 2不同DVA指纹技术的选择
基F上述原则.推荐SSR标记作为当前行植物品种DVA指纹鉴定的十安标记方法，SVP标记作为各物物种垂点研究的标记方法·适时推。以下均是针对SSR标记诉作的规范，5.2核心引物
5.2.1核心引物的基本要求
5.2.1.1一套核心引物组合的选择标准）引物位点问无遇传连锁：
b）根据植物染色体数目的多少确定核心引物的最低数量，原则上每条柒色体上成至少选择1对号物：开视不同插翻物种的惠内红大小皮多态性水平确是含适的数量：）号物增产物大小范合适·具有多重扩增或多电泳的潜力：5.2.1.2单个核心引物的选择标准为）在所研究植物物种的不同品种间多态性高；b)
能够准确区分千等位变异.数据容易统计：非持异扩增片殿少，缩果稳定·重复性好：d）染色体分布情况清楚；
突变率低；
避免选择零等位变异.
核心引物的筛选评估及等位变异的确定5.2.2.1引物筛选
根据国内外研究文献、拍物遗传信息数据库等列出的S位点及其多态性评价等信息，过行引物的初步筛选。每条染色体窄少筛选4）个多态性高、扩曾效渠好、退火温度-敛的引物对初筛出的候选物采用套代表性材料进行试验筛选。试验材料应包括代表不同遗传背景的若干材料（具体数量板据不同植物特点而定）生产上卡要推」种植的10个15个品种及H亲4本（对杂交种而吉）和几：宾遇传近似材料：经过试验筛选，确定至少10对控增效果好，多态性较高，数培易统的候选引物。剔除扩增吓有异常带型（如不刘称扩增、零带等）。5.2.2.2引物评估与确定
将候选引物作密个实验室和不同的检测设备上进行再复性利稳定性评估.结合评估结果与核心引物选择标准确定核心引物名单。核心引物数量：-股为其同源染色体数量的2倍或2倍以工，5.2.2.3核心引物等位变异的确定对每个核心引物检测-纠只有泛代表性的后种，采片荧光标记毛细管电泳检测系统统评出每个位点出现的等位变异.确征各位点的等位变异片段人小，对等位变岸进行命名，作为等位变异统计时的参考，对检测到的主要等位变异和稀有等位变异了以标注在务物NA指纹检测方法分则中.应将核心物名单及其信息作为规范性要系附在标准中5.3参照品种及参照DNA
5.3.1参照品种选择的基本原则
）样品内不围个体问“致性尚；h容易扩繁保种：
）尽量以般少的品种数代表最多种基内型，5.3.2参照DNA的基本要求
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为了降低繁殖和发放参照品种的工作量，也可出指定的实验室统一按规定的IDNA提放方法--次性足量提取参照品种的DNA经TNA指纹分析验证其真实的指纹带型所统发放，参照I)NA的本本要求如卜
a）DNA质量经检测260/280(OD值在1.8~-2.0：b）INA经过指纹分析验证.证明能够稳定护增出预期大小的等位变异片段：）同一批次提收的每个参照样品DNA量总量在50以上：5.4电泳检测
5.4.1选择电泳检测系统的基本原则a）分辨率高，对SSR位点的不同等位变异能够有效区分1p差导；b）数据统计容易，不同电泳板数据窄易整合，适于构建数据库；）技术行汰成熟、操作简单。
5.4.2电泳检测系统的确定
采用变性聚内烯酰胺凝胶电泳检测系统·包括常规变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和荧光标记毛细管电涿
5.5数据编码及处理
5.5.1DNA指纹数据的编码方式
1）对变性聚内烯酰胶凝胶电泳检测平台，每次试验时，参照DNA与待测样品一并试验，些待测样品扩增片段位置与参照INA提供的等位变异片段位置进行比较，按扩增片段从小创人的序记录迁移位置机同的等位变异名称。b）对荧光标记拒纠管电泳检测平台.可先刘参照样品NA进行NA指纹卡构建校正不同！家、不同型号的电泳分析平台差异，在分析软件上设定旬个引物位点的等位变轨开形成各位点等位变异分析参数。电泳缩束后，在分析软件上使用各位点等位变异认别参数对扩增产物片段巡行分析·读取扩增产物片段等位变异名称。5.5.2异常带型的数据处理方式
试验中出现的异常作型卡要包括稀有带、弱带对稀有带应如实记录，并正复实验确定为真实等位变异：对竭带成尽量重新扩增以提高数据质量。6样品要求
6.1样品类型
1)NA指纹鉴定样品类型包括种子、幼齿，叶片、根等材料。需要注点不同组织器白代表的世代。6.2样品分析数量
样品分种数量取决于种子繁殖方式及样品-敏性情况。根据物种察殖类型及神繁殖力式不同，可分为无性繁殖品种.严格白花授粉品种、人工白交品种、常带异花授粉品种、人然异花授粉品种、人工杂交品种：
6.2.1无性熟殖品种、严格自花授粉品种、人工自交品种、常异花授粉品种对十无性繁品种和严格片花授粉品种实际检测中成分析至少10个个体的混台样品·必要时可分析全少个个体的单个样品
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对于人工的交品种，实际检测应分析至少2个以上个体的混合样品-必要时可分析至少5个个体的单个样品，
对丁常异花授粉品种·出丁不间消物的大然异交率存在差异.不同植物成根据其具体特点硫定个适的分析数量-原则上对天然异交率较低的.可参考人土白交品种，对天然算交率较高的·可参考大然异花授粉品种
6.2.2天然异花授粉品种
实际捡测中成分析至少20个个体的单个样品：6.2.3人工杂交品种
当质期品种一致性较高时（划示的单交种），应分析至少20个以工个体的混合样品，或分析至少个个体的单个样品。当预期品种一致注较低时（如玉米的一:交种、双交种等）价析至少2！个个体的单个样品，
7试验程序
7. 1 DNA提取
可根恶实际情况选择适方的方法，对一种植物可以提供几种常用的1NA提取方法，应允许其他提取方法的使用，提取的INA应满足稳定获得PCR扩增产物的要求。7.2PCR扩增反应
7.2. 1反应体系
反应本积可选择在l25l.模板T)NA浓度可在20ng/L--200ng/L根据不同植物的实际情况可另行采用特定植物物利适宜的反应体系。7.2. 2反应程序
支应程序根据植物物种不同或引物小同逃行优化调。7.3电泳检测
普通引物使而变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测.荧光引物模川荧光毛纠管电泳检测，7.4数据统计记录
7.4.1基因型的记录方式
对变性聚丙烯胺凝胶电泳，将每个抗增位点的等位变元与参照样品提供的等位变异片段人小进行比较-确定样品的等位变导。对荧光标记毛细管电泳-使月片段分析软件按读取核心引物位点等待变异片殿，
二倍体植物物种的纯舍位点的基因型数垢记录为X/X,杂合位点的基因型数据记录为X/}.其巾买1分别为该位点上两个不同等位变异大小，小片段数据在能·大片段数据在后；缺火位点基因型数据记录为（0，对于其他倍性的植物物种，可参考“样休物耐的数据记录方式·根据物种的特获性进行适当谢
示例1：
玉米样品在来个点上仅片现个等位签异，为！u.在该整点的型周型记录为【0/15！示例2：
玉本样品在某个位点[有两个等位变异,分别为1品53,160 bp允该位点的基因型记录为16；1ri0)7.4.2原始数据统计方式
对得测群品统引物位点的径种基因载及所古比率，当来混株提取「A进行分析时，如果样品-致性高·可直接进行品种间成对比较；如果样品某个位点一致性差.出现混杀片段，影响到对成对比较分析时，应毛新提取至少20个单株的IVA，而该引物新打增统计各单侏的基因型及各种基内型斯占比例。
8数据库构建
8.1数据库基本信息
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NA指纹数措库基本信息应包括物种、品种、技术、位点.标记和等变异6个最核心的部分作一个数据库中.将定义好的每一顶填人衣格中江）物种：物种指的足植物学名称或常用名·如于米，水稍等，bh）品种：品神指的是所检测样战的名你和类型。必要时可进一形细分品种类型（如玉米可分为白交系/杂交种：水稻可细分为常规品种/杂变种等）技术：指的是措纹鉴是所用的标记类型.如 SSR，SNP等，山）位点：所选多态性位点的名称。标记：鉴定多念件位点所用的标记序列：t)
1等位变异：多态性位点的等位变异编码或数值8.2数据库构建
对一个植物物种，不同实验成选而相同的A指纹紧定方法，规定样品取样量、样品处理方式、战验流程以及IXA质量、试剂、仪器等保说条件·选用来H权威部门的标准样品构建D>A指纹数据库。
为保证不同来源A指纹数据能够有效整合在统一的数据库，川单独或结合采取以下与种方式：提供参照品种，提供参照IA，确定引物等位变异，规定对异带带型的数据处理方武和观定数据的编钨方式：Www.bzxZ.net
8.3数据库构建方式
8.3.1构建DNA指纹库
不同实验率或不同检测系统采Ⅲ相同的标准程序共同建文代表性品种的数据库：在此础上·出个实验室采用确定的标准程序逐步扩大建库名单形该物和完备的数据库，8.3.2INA指纹数据库质量控制
在进行数瑞库构建时，可设置两纠或两组以上平行试验·将平行试验结果柏同尚的数据百接人库，为了评信建库数据质量·所机抽取若丁样品（一般为5火～10为）采月统一规定的标准程序进行方测.验证详评价数据库的质量，
9判定标准
9.1判定指标的选择
采品种间荒异位点数作为判定品种问是否机同的依9.2差异位点的确定
差异位点的确定视植物繁始方式不同有差只：a：无性繁殖品种、人工杂交品种、天然异花授粉品种：对特定位点雨京，成对比较两份样品作该位点的基因型.妇果两份样品具有不同基两型的比例达到8乐及以上划定两份样品在该估点上为差异位点：反之，则为无差异位点如果两份样品的在该位点的基风型均！有种，则立接比较其基闪型是否相同，如果相同，判定两份样品在该位点L为无差异位点;反之，则为差异位点。当放对比较的两份伴品至少有一个存在多种基因型时，则比较所有基因型，两份样品具有不同基因型的比例到80及以上，判定两份样品存该位点上为差异位点：反之，则为无差异位点b）严格自花授粉品种、人工白交品种：对特位点而台.当两份栏品在该位点均为纯合基闪型，差异位点的判定同9.2.a：当至少-份样品在该位点为杂个基两型时·则战对比较两份样品NY/T2594—2014
在该位点是否只有共同等位变异，如果只有的不司等位变异的比例达到80%及以工，判定两样品在该位点上为差异位点：反之.测为无差异位点。常异花授粉品种：原则上对天然异交率较低的.可参考严格白花授粉品种：对丁天然异交率较高的，可参考大然异花授粉品种，9.3基本判定原则
成对比较的两个样品·选用该植物的核心引物进行鉴定，比较结果中应将检测出的差异位点列出。当差异位点数法X时.判定为不同：当Y差异位点数X时，判案为近似：当并异位点数Y时，灯抢为疑同。X、Y的具体数值可根据不同植物的其本情况分别研定对未检测到明显差的两个样品-如架样品被检单位提出其样品区别于其他样品的引物位点·并经多次重复能稳定地检测出两份栏品在该点的差异，其提叫的引物位点可作为待测样品的特定标记进行备案·在今后凡涉及该样品的！A指纹鉴定时，检测其特定标记。对核心物未检测山差异上被检单位提冶特定称记的情况，必要时，可选步进行书间IS测试，6
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