NY/T 2595-2014
基本信息
标准号： NY/T 2595-2014
中文名称：大豆品种鉴定技术规程 SSR分子标记法
标准类别：农业行业标准(NY)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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出版信息
相关单位信息
标准简介
NY/T 2595-2014 大豆品种鉴定技术规程 SSR分子标记法
NY/T2595-2014
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标准内容
ICS01.040.67
中华人民共和国农业行业标准
NY/T2595—2014
大豆品种鉴定技术规程
SSR分子标记法
Identification of soybean varietics-SSR marker method2014-03-24发布
2014-06-01实施
中华人民共和国农业部
1范围
2规范性文件
术语和定义
仪器设备及试剂
溶液配制
操作步骤
等位基因数据采集
10判定方法
附录A（规范性附录）
附录B(规范性附录)
附录C(规范性附录)
仪器设备及试剂
济液配制
核心引物
NY/T 2595-2014
NY/T2595—2014
本标准按照B/T1.1
2009给出的规则起草。
请注意本文件的某些内容川能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的质任本标准农业种子管理局提出。
本标准由全国植物新品种测试标准化技术委员会（SAC/T(277)回1。本标准起草单位：黑龙江省农业科学院作物台种研究所、农业部科技发展中心。本标准上要起草人：李冬梅、刘平、陈立君、店浩、孙连发、退水芹、上翔宁，马楠1范围
大豆品种鉴定技术规程
星SSR分子标记法
NY/T 2595-2014
本标准规定了利简单重复序列（Simpleeucncercpeais，ssR）标记进行大豆[geinemax（l.）Merr.品种鉴定的试验方法、数据记录格式和判定标准，本标准适用下大豆SSR标记分子数据的采集和品种鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的成所足必不可少的，凡是注日期的引而文件，仅注期的版木适H了本义件。凡是不注且期的引用文件其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。（GH3/T35.3.2农作物种子检验规程托样NY/T2594-2012植物品种鉴定DVA指纹方法总则（B/I1957，1植物新品种特异性、-致性和稳定性测试指南总则乃/T19557.4：植物新品种特异性、·致性和稳定性测试指南大臣3术语和定义
VY/T25942014界定的以及下列术语和定义适川丁本义件。3. 1
核心引物corepriner
多态性、稳定性、重复性等综合特性好，用于T)NA指纹鉴定的引物。核心引物作为统一用FDNA指纹效据库构建和品种鉴定的引物，可保证不同实验牢数据具右可比性。3.2
参照品种referencevariety
参照品种指对应于SSR位点不同等位基闪的组品种。参照品种用丁辅功确定待测样品等位因的大小，校止仪器设备的系统误差。4原理
SSR广泛分布于大豆基内组中，不伺品种问每个SSR位点重复单位的数量可能不间，山于每个SSR位点两侧的序列般是高度保守和单拷贝的，困而可根据其两侧的序列设计-对特异引物，利用PCR技术对两条引物问的INA序列进行扩增，在电泳过程中，丰要由于SSR位点重复单位的数不同引起的不同长度的R扩增片段在电场作用下得到分离，经硝酸银染色或者光染料标记加以区分。因此、根据SSR位点的多态性,利用PCR扩增和电泳技术可以鉴定大豆品种。5仪器设备及试剂
仪器设备及试剂见附求A
6溶液配制
游液配制方决见附录13。
7引物
引物相美信息见附录（
NY/T2595—2014
8操作步骤
8.1样品准备
8.1.1对」种于样品的分样和保存，按（B/T3513.2的规定执行。8.1.2每份样品中至少随机抛取于个个体，混合分析对一致性差的样品，成分别随机抽取10个以上的个体，每个个体单独分析。
8.2DNA提取
8. 2. 1 叶片 DX4 的提取
取0.3新鲜幼嫩叫片卷好放入2离心管，并置于液氮中30后，迅速较.加液氮研磨至粉未，加750L预热（65%>的NA提取液，摇句：将离心管置入65℃温水浴锅45nin60min，在此期间，每隔10min颠倒滋句「次；较出离心管，冷却至案溢；加人等体积的氛伤-异戊醇（24：上），轻缓颠倒混句，12000离心101min：转移上清液至1.5ml离心等4，加入0.6倍体积的异丙醇（：20%）轻缓颠倒混勺，置一20℃的冰箱中坐少1h；12000g离心5min，充」清加500ul.75%乙醇、洗涤沉症2次，次10min；室温风T，加100μl.超纯水落解沉淀。检测1)NA浓度，将DNA稀释到200ng/l，一20℃条件下保存备用。
8.2.2种子提取DNA方法
将研磨灯的臣于装丁-2t离心答，加人200ul提取缓冲液（Extractbuffor）、oul.SLxs10%）涡旋s混到.60℃水浴30nin隔10min颠倒1次，水浴居训人100L醋骏钟（5M/L)，洒旋5.冰浴30Inin,冰后加入等体积的Tris平衡谢/氯仿（1：1），涡旋20:$，1200g离心10min,离心后取「清.加人等体积的氯仿，涡旋20)s，12000多离心10min，离心后取上清，加人等体积的异丙醇（一20℃预冷）：下颠例20次，12000g离心10mm弃上清，加人700m70%乙醇.12000g离心1nm冷风吹干，加入无陷水溶解，加人2l.RNA酶（10mg/ml)，37C温浴30min1℃短期保存，一20℃长期保存，注：以L为推荐的种JNA提取方法。所获[NA质量能够衍合『CR扩增需要的LNA提收方法都适用于本标8.3PCR扩增
8.3.1参照品种的使用
在进行PCR扩增和等位闪检测时，不同位点的参照品种参见附录（。同-名称不同来源的参照品种的某位点「的等位基闪可能不相同，在使而前，与原参照品种进行核对。对」附录C中末包括的等位基因;应按本标准的方法过便历DNA分析仪与参品种回时逊行检测确定其人。注：多个品种在某一位点上可能部具有扣同的等位基因。在确认这些品冲某-位点上等位基因大小后,这些品种也可以代替附录（的参照品种使用8.3.2反应体系下载标准就来标准下载网
反应体积为20u，红分配制见表1。表 1 PCR扩增反应体系
反虚纽分
IXPCR缓冲液
氯化镁溶波
P混合溶液
TAR DNA 聚合峰
双蒸爪
终液度
1. 88 rm/1
0, 18 nmo./1.
0. 3 frm:l/ 1.
2n ng/ al.
体积，pl.
8.3.3反应程序
NY/7 2595--20t4
94~预变性5mil;94℃变性453.47℃或55℃退火455，72℃延伸45%.共38个坏，72%延仲7min,℃条件下保存。
8.4变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染检测8.4.1玻璃板处理
将平，叫玻离板反复擦洗十净，再用燕馏水冲洗后晾干。用无水乙醇擦洗2遍，吸水纸擦干。在平板玻璃上涂上0.5ml.亲和硅烧T.作液，凹板玻璃上涂0.5mL刺离硅烧工作液。操作过程中防止湖块玻璃板工相污染。待玻璃板彻底下燥后.将塑料隔条整齐放在半板两侧，盖上叫板、用火子固定后.用水仪调。
8. 4. 2灌胶
在50mL6.0※PAGF胶中分别加人400的10※过硫酸铵和50uLTEMED（过硫酸铵和TEMED的用量视不境温度做适当调整），轻轻混匀后，灌胶。待胶液充满坡璃板夹层，在.上部凹而处轻轻地插人鲨负齿梳端，使胶液在室温下繁合2h以上。8.4.3预电泳
拨出样品梳，冲洗凹槽处戏余的胶，将玻璃板与也冰槽组装，在正极柳（下槽）加人1×T3E缓冲液800m，在负极槽（上槽）加人0.3×TBl缓冲液1000ml.85W恒功率顶预电泳40min-~60min。8.4.4PCR扩增产物变性处理
在PCR产物中加人8μL6×加样缓冲液，混匀后，在PCR仪上95℃变性5min，取山后，立即置丁碎冰上羚却。
8.4.5电泳
用移液器吸取缓冲液冲洗凝胶顶端儿次，清除气泡和杂质。将踏佳齿梳齿端插人凝胶III~~2rm，衔个样孔点人6样品扩增物（上样量可根据加样孔的大小适当调整），除待测样品外，还前同时加入标准品种的扩增产物：在70W恒功率下电冰，使凝咬温度保持在50℃左有。符1部的指示带（一叫苯)到达胶板底部，结束电泳、8.4.6银染
a）固定：电泳结束后，小心分开两块陂璃板。将附着凝胶的玻璃板放人固定液中，在摇床上轻轻昆动20min.
漂洗，取出胶极，用蒸馅水快速漂洗2次，不超过10b)
染色：将胶板放在染色液中，轻轻摇动染色!5min；c
漂洗：蒸馏水快速漂洗，时闻不超过10%d
显影：将胶板放入显影液中轻轻光动至带纹出现；e
定影：将胶板放入固定液中定影5min；f）
g）漂洗：蒸馏水漂洗5min.取出晾十。8.4.7照相及结果记录
将板放在观片灯上，记录结果，拍照保存。8.5DNA分析仪检测
8.5.1样品制备
将6-FAM租IIFX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30信，TAMRA利RX炭光标记的PCR产物稀释i0倍，分别取等体私的1述4种PCR产物稀释后混合从混合液中吸取1l.加入到DNA分析仪专深孔板孔。在板巾各孔分别加人0.1证LZ00分了量内标和8.9证去离酰胺。除待测样品外，还成同州包括参照品种的扩增产物，将样品在cR仪℃变性5min.迅速取出置丁碎冰上.冷却10min。瞬时离心10s后上机亚泳。3
NY/T2595—2014
8.5.2开机准备
打开DNA分析仪，检查仪器工作状态。更换缓冲液，剂胶，将装有样品的欲孔板置放于样品架基座上。打开数据收集软件。
8.5.3编辑电泳板
点;l菜单小的\platcmaluager\按钮，然后在右侧窗点击“Ncw\按钮创建-个新的电冰板，在“Narne\和\ID\栏中翰人电泳板的名称，在“applieation\选项，选“Gencnapper-（rcnrtic\，在\PiateType\选项中选择\96-well”，在“owncr\和\operator\项分别输入板所有者和操作者的名字，点山“K\按钮.
8.5.4电泳
在\Runschecaulcr”工具栏中，点\Search\按钮，选中已编辑好的电泳板.点击样品板，使电泳械和样品板关联.然后点击工具条中左1角的绿色，角按钮，升始电泳，2h之后，束电泳。9等位基因数据采集
9.1数据格式
样品链个SSR位点的等位基因人小用扩增片段长度表示。9.1.1变性聚丙烯凝胶电泳银染检测将待测样品扩增片段的借型和泳动位置与对应的参照品种进行比较，马与待测样品相同的参照品种的片段大小即为待测样品该号物位点的等位基因大小，9.1.2N4分析仪检测
使用IVA分析仪的片段分析软件，读山每个位点每个样品的等位基因大小数据。通过使川参照品种，消除不同型少IDNA分析仪间可能存在的系统误差。比较参照品种的等位基固大小数据与表（.中的数据。如两者不·致、其差数即是系统误差的大小。从待测样品的等位盐因数据中去除该系统误荒，获得的数括即为待测样品的等位基因大小。9.2数据记录方法
纯合位点的等位基闪扩增片段数据记录为X/X，其中X为该位点等位基因扩增片段大小，杂合位点的等位基闪护增片段数据记录为X/Y.其中X、Y分别为该位点上两个不同的等位基内，小片段数据在前，大片段效热在后;缺失位点的等位基因数据记录为0/0。示例1：
个品的1个SR位点为纯合位点，等位基围扩增片段大小为12bp，则该品种在该位点上的等位基因扩增片段数据记录为120/12℃
示例2：
-个品种的1个SsR位点为杂合位点，2个等位基因扩增片般大小分别为12cbp.126hp.则该品种在该位点上的等位基因扩增片段数据记录120/126。10判定方法
10.1品种鉴定
品种整定包括对2个或2个以「的品种同时进行检测“直接比较”)和对待测品种逆行检测后利用其检测数和数据库中品种的数据进行比刘对（“数据库比较\)两种情况。10.1.1直接比较
对待测品种和对照间时避行检测“直接比较”)时，用附录中核心引物检测，获得待测品种在这比引物位点的等位基因数据，利用这些数据进行品种问比较：a）请种间差异点数学2.判定为不间品种：b）品种闻差异位点数=1,判定为近似品种；）品种问差异待点数一,判定为疑同品种，NY/T2595—2014
对寸-b）利c）的两种情况，成按照B/T19357.1和G3/19557.4给出的原则进行用问测试，确定品种问在形态性状上是否存在明显差异。10.1.2数据库比较
对待测品种进行检测后利用其检测数据和数据库中品种的数据进行比对（“数据库比较\>时，用附录C中核心引物检测，获得待测品种在上述引物位点的等位基因数，利用这些数据和数搬库中品种进行比较：
a）品种问差异位点数≥2.判定为不同鼠种；b）品种间差异位点数=1，判定为近似品种；）品种间差异位点数=.判定为疑同品种对b)利c)的情况，将这些相近品种或疑同品种与待测品种按照10.1.1的方法进行整定。NY/T2595—2014
A.1仪器设备
A. 1. 1 PCR 仪
A.1.2企自动遗传分析议，
附录A
(规范性附录）
仪器设备及试剂
A1.3微量加样器(1020ul，100200μl1000,5000),A. 1.4
电泳槽及配套的制胶件。
高压电泳仪。
6脱色。
胶片观察灯，
恒温水浴锅。
恒凝培养箱。
水平摇味。
电子平。
酸度计。
磁力搅拌：
高压灭菌锅，
高速行式离心机
数码相机。
紫外分光光度计，
A.2试剂
腰闪乙酸
一羟甲基氰基甲烷，
浓盐较。
A.2.4氢氰化钠。
A.2.5矿物油。
A.2.6去肉于甲胺。
溴酚蓝。
冲苯青
A.2.9十二烷片磺酸钠
三甲烷：
异戊醉。
异丙醇，
甲叉双闪烯酰胺，
丙烯酰胺。
硼酸。
尿素。
亲和硅烷。
剃离能烷。
二甲基二氯烷，
无水乙醇。
四甲基乙胺，
过硫酸铵。
冰醋酸。
硝酸银
甲醛。
缓冲液（不含Mg2+），
四种脱氧核节酸（dNTPs：dATP、dTTP、dGTP,dCTP)混介液Tay IDNA聚合酶。
SSR 物。
去离子水。
分了量内标。
校准基质。
DNA分子量标记。
NY/T2595—2014
NY/T2595-2014
B.1DNA提取溶液
附录B
(规范性附录）
溶液配制
B.1. 10.5 mol/L 乙二胺四乙酸二钠盐(FDTA-2Na)(pH8. 0)溶液称取186.1g乙二胺四乙酸二钠（FDTANa，·2H，0)，加800mL去离了水溶解，用固体NaOH调H至8.0,斯加去离于水定容至100心mL,混匀;过滤，高压灭菌片在4℃条件下保存。B. 1. 21 rmal/ L 三羧甲基氨基甲烷盐酸(Tris -HC1) (pH8. 0)溶液称取60.55Tris,倒人 500 nL烧杯中,加400 ml.去离了水溶解,加 IICl调 pII至 8.0,冉刚去离予水定容笔5C0mL，混匀，高原灭菌后在4℃条件下保存。B.1.30.5mol/LIICI提取液
称取25ml.浓盐酸（36%~38%），加去离了水定容至500mlB. 1. 41 nol/I, CIAB溶液
称敢36.21g（AB.倒人100mL.烧杯中，加人70tml.去离水加热溶解，冉册去离水定容至100n
B.1.55mol/LNaCI溶液
称取292.2氮化钠，加人750ml.水中，在磁力搅拌器「搅拌溶解，加水定容个1000mL，在103.4kPa火菌 min。
B.1.6三氧甲烷/异戊醇(24:1)
取240ml三氯甲烷和10 m异戊婷，泥勾。B.2PCR扩增溶液的配制
B.2.1四种脱氧核苷酸(dNTPs)混合溶液配制取浓度为1C0mmol/I.的dATR、dCTP,dGTP和dTTP磷存液20uL,而超纯水{20ul配成终浓度1).0mmo1/1.的1.作液.也可川相同浓度的四种脱氧核酸（lNTPs）商品混合溶液。20条作下保存。
B.2.2引物稀释
根据与物个成单，将引物加人适量的超纯水.分别配制成前引物和后引物终浓度均为10um01/1的磷存液，各取10ul.混-人超纯水480配成浓度为2μmol/I.的工作液，B.2.36×加样缓冲液
称漠酚蓝0.125只、二中苯3.125-分别人太离子甲酰胺49m和0.5rmo1/1.的EI)TA济液(H8.0)m混句备用。
B.3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制B.3.16i.0%(W/V)变性聚丙烯酰胺凝胶分别称取内烯酰胺57和义双两烯酰胺3g，放人1000ml.烧杯±加人60ml.去离了水，再加入10×I13F缓冲液50ml.和尿素120+川去离了水定容窄1600mL，混勾，过滤。A%℃条件下保存孩.3.2亲和硅烷工作液
在1亲和链烷缓液中加人5l亲和烷源液，混匀。B.3.3剥离硅烷工作液
取10ml.别离硅烷原液，加到490mL氯仿中，混勾，配制成2%工作液，B.3.410%(W/V)过硫酸铵溶液
将0.1g过硫酸铵溶J:1ml.去离子水tt.混匀，4℃条件下保存（保存期7d)B.3.5J0×TBE缓冲液
NY/T2595—2014
分别称取108gTris+55硼酸，放入1000mL烧杯中，加人800ml.去离了水加热溶解，再加入37ml.0.5mol/1.ELrrA溶液.混勾定容至1000mL，银染溶液的配制H.3.61XTBE缓冲液
10xTE缓冲液50ml，加去离子水定容至500ml.B.4银染、显影溶液配制
B.4.1固定液
取100 mL冰醋酸,加去离了水定容卒1 000 mJB.4.2染色液
称取1g硝酸银，加去离子水定容仓1000tnL。加入1.3ml.甲醛济液（37%），混勺。B.4.3显影液
称取10g氯鼠化钠和2证4解加入1000ml.蒸馏水中，混匀
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Identification of soybean varietics-SSR marker method2014-03-24发布
2014-06-01实施
中华人民共和国农业部
1范围
2规范性文件
术语和定义
仪器设备及试剂
溶液配制
操作步骤
等位基因数据采集
10判定方法
附录A（规范性附录）
附录B(规范性附录)
附录C(规范性附录)
仪器设备及试剂
济液配制
核心引物
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NY/T2595—2014
本标准按照B/T1.1
2009给出的规则起草。
请注意本文件的某些内容川能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的质任本标准农业种子管理局提出。
本标准由全国植物新品种测试标准化技术委员会（SAC/T(277)回1。本标准起草单位：黑龙江省农业科学院作物台种研究所、农业部科技发展中心。本标准上要起草人：李冬梅、刘平、陈立君、店浩、孙连发、退水芹、上翔宁，马楠1范围
大豆品种鉴定技术规程
星SSR分子标记法
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本标准规定了利简单重复序列（Simpleeucncercpeais，ssR）标记进行大豆[geinemax（l.）Merr.品种鉴定的试验方法、数据记录格式和判定标准，本标准适用下大豆SSR标记分子数据的采集和品种鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的成所足必不可少的，凡是注日期的引而文件，仅注期的版木适H了本义件。凡是不注且期的引用文件其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。（GH3/T35.3.2农作物种子检验规程托样NY/T2594-2012植物品种鉴定DVA指纹方法总则（B/I1957，1植物新品种特异性、-致性和稳定性测试指南总则乃/T19557.4：植物新品种特异性、·致性和稳定性测试指南大臣3术语和定义
VY/T25942014界定的以及下列术语和定义适川丁本义件。3. 1
核心引物corepriner
多态性、稳定性、重复性等综合特性好，用于T)NA指纹鉴定的引物。核心引物作为统一用FDNA指纹效据库构建和品种鉴定的引物，可保证不同实验牢数据具右可比性。3.2
参照品种referencevariety
参照品种指对应于SSR位点不同等位基闪的组品种。参照品种用丁辅功确定待测样品等位因的大小，校止仪器设备的系统误差。4原理
SSR广泛分布于大豆基内组中，不伺品种问每个SSR位点重复单位的数量可能不间，山于每个SSR位点两侧的序列般是高度保守和单拷贝的，困而可根据其两侧的序列设计-对特异引物，利用PCR技术对两条引物问的INA序列进行扩增，在电泳过程中，丰要由于SSR位点重复单位的数不同引起的不同长度的R扩增片段在电场作用下得到分离，经硝酸银染色或者光染料标记加以区分。因此、根据SSR位点的多态性,利用PCR扩增和电泳技术可以鉴定大豆品种。5仪器设备及试剂
仪器设备及试剂见附求A
6溶液配制
游液配制方决见附录13。
7引物
引物相美信息见附录（
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8操作步骤
8.1样品准备
8.1.1对」种于样品的分样和保存，按（B/T3513.2的规定执行。8.1.2每份样品中至少随机抛取于个个体，混合分析对一致性差的样品，成分别随机抽取10个以上的个体，每个个体单独分析。
8.2DNA提取
8. 2. 1 叶片 DX4 的提取
取0.3新鲜幼嫩叫片卷好放入2离心管，并置于液氮中30后，迅速较.加液氮研磨至粉未，加750L预热（65%>的NA提取液，摇句：将离心管置入65℃温水浴锅45nin60min，在此期间，每隔10min颠倒滋句「次；较出离心管，冷却至案溢；加人等体积的氛伤-异戊醇（24：上），轻缓颠倒混句，12000离心101min：转移上清液至1.5ml离心等4，加入0.6倍体积的异丙醇（：20%）轻缓颠倒混勺，置一20℃的冰箱中坐少1h；12000g离心5min，充」清加500ul.75%乙醇、洗涤沉症2次，次10min；室温风T，加100μl.超纯水落解沉淀。检测1)NA浓度，将DNA稀释到200ng/l，一20℃条件下保存备用。
8.2.2种子提取DNA方法
将研磨灯的臣于装丁-2t离心答，加人200ul提取缓冲液（Extractbuffor）、oul.SLxs10%）涡旋s混到.60℃水浴30nin隔10min颠倒1次，水浴居训人100L醋骏钟（5M/L)，洒旋5.冰浴30Inin,冰后加入等体积的Tris平衡谢/氯仿（1：1），涡旋20:$，1200g离心10min,离心后取「清.加人等体积的氯仿，涡旋20)s，12000多离心10min，离心后取上清，加人等体积的异丙醇（一20℃预冷）：下颠例20次，12000g离心10mm弃上清，加人700m70%乙醇.12000g离心1nm冷风吹干，加入无陷水溶解，加人2l.RNA酶（10mg/ml)，37C温浴30min1℃短期保存，一20℃长期保存，注：以L为推荐的种JNA提取方法。所获[NA质量能够衍合『CR扩增需要的LNA提收方法都适用于本标8.3PCR扩增
8.3.1参照品种的使用
在进行PCR扩增和等位闪检测时，不同位点的参照品种参见附录（。同-名称不同来源的参照品种的某位点「的等位基闪可能不相同，在使而前，与原参照品种进行核对。对」附录C中末包括的等位基因;应按本标准的方法过便历DNA分析仪与参品种回时逊行检测确定其人。注：多个品种在某一位点上可能部具有扣同的等位基因。在确认这些品冲某-位点上等位基因大小后,这些品种也可以代替附录（的参照品种使用8.3.2反应体系下载标准就来标准下载网
反应体积为20u，红分配制见表1。表 1 PCR扩增反应体系
反虚纽分
IXPCR缓冲液
氯化镁溶波
P混合溶液
TAR DNA 聚合峰
双蒸爪
终液度
1. 88 rm/1
0, 18 nmo./1.
0. 3 frm:l/ 1.
2n ng/ al.
体积，pl.
8.3.3反应程序
NY/7 2595--20t4
94~预变性5mil;94℃变性453.47℃或55℃退火455，72℃延伸45%.共38个坏，72%延仲7min,℃条件下保存。
8.4变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染检测8.4.1玻璃板处理
将平，叫玻离板反复擦洗十净，再用燕馏水冲洗后晾干。用无水乙醇擦洗2遍，吸水纸擦干。在平板玻璃上涂上0.5ml.亲和硅烧T.作液，凹板玻璃上涂0.5mL刺离硅烧工作液。操作过程中防止湖块玻璃板工相污染。待玻璃板彻底下燥后.将塑料隔条整齐放在半板两侧，盖上叫板、用火子固定后.用水仪调。
8. 4. 2灌胶
在50mL6.0※PAGF胶中分别加人400的10※过硫酸铵和50uLTEMED（过硫酸铵和TEMED的用量视不境温度做适当调整），轻轻混匀后，灌胶。待胶液充满坡璃板夹层，在.上部凹而处轻轻地插人鲨负齿梳端，使胶液在室温下繁合2h以上。8.4.3预电泳
拨出样品梳，冲洗凹槽处戏余的胶，将玻璃板与也冰槽组装，在正极柳（下槽）加人1×T3E缓冲液800m，在负极槽（上槽）加人0.3×TBl缓冲液1000ml.85W恒功率顶预电泳40min-~60min。8.4.4PCR扩增产物变性处理
在PCR产物中加人8μL6×加样缓冲液，混匀后，在PCR仪上95℃变性5min，取山后，立即置丁碎冰上羚却。
8.4.5电泳
用移液器吸取缓冲液冲洗凝胶顶端儿次，清除气泡和杂质。将踏佳齿梳齿端插人凝胶III~~2rm，衔个样孔点人6样品扩增物（上样量可根据加样孔的大小适当调整），除待测样品外，还前同时加入标准品种的扩增产物：在70W恒功率下电冰，使凝咬温度保持在50℃左有。符1部的指示带（一叫苯)到达胶板底部，结束电泳、8.4.6银染
a）固定：电泳结束后，小心分开两块陂璃板。将附着凝胶的玻璃板放人固定液中，在摇床上轻轻昆动20min.
漂洗，取出胶极，用蒸馅水快速漂洗2次，不超过10b)
染色：将胶板放在染色液中，轻轻摇动染色!5min；c
漂洗：蒸馏水快速漂洗，时闻不超过10%d
显影：将胶板放入显影液中轻轻光动至带纹出现；e
定影：将胶板放入固定液中定影5min；f）
g）漂洗：蒸馏水漂洗5min.取出晾十。8.4.7照相及结果记录
将板放在观片灯上，记录结果，拍照保存。8.5DNA分析仪检测
8.5.1样品制备
将6-FAM租IIFX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30信，TAMRA利RX炭光标记的PCR产物稀释i0倍，分别取等体私的1述4种PCR产物稀释后混合从混合液中吸取1l.加入到DNA分析仪专深孔板孔。在板巾各孔分别加人0.1证LZ00分了量内标和8.9证去离酰胺。除待测样品外，还成同州包括参照品种的扩增产物，将样品在cR仪℃变性5min.迅速取出置丁碎冰上.冷却10min。瞬时离心10s后上机亚泳。3
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8.5.2开机准备
打开DNA分析仪，检查仪器工作状态。更换缓冲液，剂胶，将装有样品的欲孔板置放于样品架基座上。打开数据收集软件。
8.5.3编辑电泳板
点;l菜单小的\platcmaluager\按钮，然后在右侧窗点击“Ncw\按钮创建-个新的电冰板，在“Narne\和\ID\栏中翰人电泳板的名称，在“applieation\选项，选“Gencnapper-（rcnrtic\，在\PiateType\选项中选择\96-well”，在“owncr\和\operator\项分别输入板所有者和操作者的名字，点山“K\按钮.
8.5.4电泳
在\Runschecaulcr”工具栏中，点\Search\按钮，选中已编辑好的电泳板.点击样品板，使电泳械和样品板关联.然后点击工具条中左1角的绿色，角按钮，升始电泳，2h之后，束电泳。9等位基因数据采集
9.1数据格式
样品链个SSR位点的等位基因人小用扩增片段长度表示。9.1.1变性聚丙烯凝胶电泳银染检测将待测样品扩增片段的借型和泳动位置与对应的参照品种进行比较，马与待测样品相同的参照品种的片段大小即为待测样品该号物位点的等位基因大小，9.1.2N4分析仪检测
使用IVA分析仪的片段分析软件，读山每个位点每个样品的等位基因大小数据。通过使川参照品种，消除不同型少IDNA分析仪间可能存在的系统误差。比较参照品种的等位基固大小数据与表（.中的数据。如两者不·致、其差数即是系统误差的大小。从待测样品的等位盐因数据中去除该系统误荒，获得的数括即为待测样品的等位基因大小。9.2数据记录方法
纯合位点的等位基闪扩增片段数据记录为X/X，其中X为该位点等位基因扩增片段大小，杂合位点的等位基闪护增片段数据记录为X/Y.其中X、Y分别为该位点上两个不同的等位基内，小片段数据在前，大片段效热在后;缺失位点的等位基因数据记录为0/0。示例1：
个品的1个SR位点为纯合位点，等位基围扩增片段大小为12bp，则该品种在该位点上的等位基因扩增片段数据记录为120/12℃
示例2：
-个品种的1个SsR位点为杂合位点，2个等位基因扩增片般大小分别为12cbp.126hp.则该品种在该位点上的等位基因扩增片段数据记录120/126。10判定方法
10.1品种鉴定
品种整定包括对2个或2个以「的品种同时进行检测“直接比较”)和对待测品种逆行检测后利用其检测数和数据库中品种的数据进行比刘对（“数据库比较\)两种情况。10.1.1直接比较
对待测品种和对照间时避行检测“直接比较”)时，用附录中核心引物检测，获得待测品种在这比引物位点的等位基因数据，利用这些数据进行品种问比较：a）请种间差异点数学2.判定为不间品种：b）品种闻差异位点数=1,判定为近似品种；）品种问差异待点数一,判定为疑同品种，NY/T2595—2014
对寸-b）利c）的两种情况，成按照B/T19357.1和G3/19557.4给出的原则进行用问测试，确定品种问在形态性状上是否存在明显差异。10.1.2数据库比较
对待测品种进行检测后利用其检测数据和数据库中品种的数据进行比对（“数据库比较\>时，用附录C中核心引物检测，获得待测品种在上述引物位点的等位基因数，利用这些数据和数搬库中品种进行比较：
a）品种问差异位点数≥2.判定为不同鼠种；b）品种间差异位点数=1，判定为近似品种；）品种间差异位点数=.判定为疑同品种对b)利c)的情况，将这些相近品种或疑同品种与待测品种按照10.1.1的方法进行整定。NY/T2595—2014
A.1仪器设备
A. 1. 1 PCR 仪
A.1.2企自动遗传分析议，
附录A
(规范性附录）
仪器设备及试剂
A1.3微量加样器(1020ul，100200μl1000,5000),A. 1.4
电泳槽及配套的制胶件。
高压电泳仪。
6脱色。
胶片观察灯，
恒温水浴锅。
恒凝培养箱。
水平摇味。
电子平。
酸度计。
磁力搅拌：
高压灭菌锅，
高速行式离心机
数码相机。
紫外分光光度计，
A.2试剂
腰闪乙酸
一羟甲基氰基甲烷，
浓盐较。
A.2.4氢氰化钠。
A.2.5矿物油。
A.2.6去肉于甲胺。
溴酚蓝。
冲苯青
A.2.9十二烷片磺酸钠
三甲烷：
异戊醉。
异丙醇，
甲叉双闪烯酰胺，
丙烯酰胺。
硼酸。
尿素。
亲和硅烷。
剃离能烷。
二甲基二氯烷，
无水乙醇。
四甲基乙胺，
过硫酸铵。
冰醋酸。
硝酸银
甲醛。
缓冲液（不含Mg2+），
四种脱氧核节酸（dNTPs：dATP、dTTP、dGTP,dCTP)混介液Tay IDNA聚合酶。
SSR 物。
去离子水。
分了量内标。
校准基质。
DNA分子量标记。
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B.1DNA提取溶液
附录B
(规范性附录）
溶液配制
B.1. 10.5 mol/L 乙二胺四乙酸二钠盐(FDTA-2Na)(pH8. 0)溶液称取186.1g乙二胺四乙酸二钠（FDTANa，·2H，0)，加800mL去离了水溶解，用固体NaOH调H至8.0,斯加去离于水定容至100心mL,混匀;过滤，高压灭菌片在4℃条件下保存。B. 1. 21 rmal/ L 三羧甲基氨基甲烷盐酸(Tris -HC1) (pH8. 0)溶液称取60.55Tris,倒人 500 nL烧杯中,加400 ml.去离了水溶解,加 IICl调 pII至 8.0,冉刚去离予水定容笔5C0mL，混匀，高原灭菌后在4℃条件下保存。B.1.30.5mol/LIICI提取液
称取25ml.浓盐酸（36%~38%），加去离了水定容至500mlB. 1. 41 nol/I, CIAB溶液
称敢36.21g（AB.倒人100mL.烧杯中，加人70tml.去离水加热溶解，冉册去离水定容至100n
B.1.55mol/LNaCI溶液
称取292.2氮化钠，加人750ml.水中，在磁力搅拌器「搅拌溶解，加水定容个1000mL，在103.4kPa火菌 min。
B.1.6三氧甲烷/异戊醇(24:1)
取240ml三氯甲烷和10 m异戊婷，泥勾。B.2PCR扩增溶液的配制
B.2.1四种脱氧核苷酸(dNTPs)混合溶液配制取浓度为1C0mmol/I.的dATR、dCTP,dGTP和dTTP磷存液20uL,而超纯水{20ul配成终浓度1).0mmo1/1.的1.作液.也可川相同浓度的四种脱氧核酸（lNTPs）商品混合溶液。20条作下保存。
B.2.2引物稀释
根据与物个成单，将引物加人适量的超纯水.分别配制成前引物和后引物终浓度均为10um01/1的磷存液，各取10ul.混-人超纯水480配成浓度为2μmol/I.的工作液，B.2.36×加样缓冲液
称漠酚蓝0.125只、二中苯3.125-分别人太离子甲酰胺49m和0.5rmo1/1.的EI)TA济液(H8.0)m混句备用。
B.3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制B.3.16i.0%(W/V)变性聚丙烯酰胺凝胶分别称取内烯酰胺57和义双两烯酰胺3g，放人1000ml.烧杯±加人60ml.去离了水，再加入10×I13F缓冲液50ml.和尿素120+川去离了水定容窄1600mL，混勾，过滤。A%℃条件下保存孩.3.2亲和硅烷工作液
在1亲和链烷缓液中加人5l亲和烷源液，混匀。B.3.3剥离硅烷工作液
取10ml.别离硅烷原液，加到490mL氯仿中，混勾，配制成2%工作液，B.3.410%(W/V)过硫酸铵溶液
将0.1g过硫酸铵溶J:1ml.去离子水tt.混匀，4℃条件下保存（保存期7d)B.3.5J0×TBE缓冲液
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分别称取108gTris+55硼酸，放入1000mL烧杯中，加人800ml.去离了水加热溶解，再加入37ml.0.5mol/1.ELrrA溶液.混勾定容至1000mL，银染溶液的配制H.3.61XTBE缓冲液
10xTE缓冲液50ml，加去离子水定容至500ml.B.4银染、显影溶液配制
B.4.1固定液
取100 mL冰醋酸,加去离了水定容卒1 000 mJB.4.2染色液
称取1g硝酸银，加去离子水定容仓1000tnL。加入1.3ml.甲醛济液（37%），混勺。B.4.3显影液
称取10g氯鼠化钠和2证4解加入1000ml.蒸馏水中，混匀
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