NY/T 2634-2014 棉花品种真实性鉴定 SSR分子标记法 NY/T2634-2014 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

ICS 65.020.01
中华人民共和国农业行业标准
NY/T2634—2014
棉花品种真实性鉴定
SSR分子标记法
Identification genuineness of cotton varieties using SsR markers2014-10-17发布
2015-01-01实施
中华人民共和国农业部
本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草本标准由农业部种植业管理司提出并归口。NY/T 2634—2014
本标准起草单位：安微省农业科学院、农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心（合肥）。本标准土要起草人：杨剑波、路曦结、何团结、陆徐忠、郑曙峰.张小娟、倪金龙。T
1范围
棉花品种真实性鉴定
SSR分子标记法
本标准规定了棉花品种真实性鉴定SSR分子标记法。本标准适用丁陆地棉品种黑实性鉴定。2规范性引用文件
NY/T 2634—2014
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适月丁本义件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T3543.2农作物种子检验规程样GB/T3543.4农作物种子检验规程发芽试验GB4407.1经济作物种子纤维类
GI3T5682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
varietal genuineness
品种真实性
供检品种与文件记录（如标签等）是否相符。本标准中指品种间在DNA分了标记带型上的一致性。
SSR分子标记simple sequencerepeatmarker是指由儿个核甘酸（一般为2个～6个)为重复单元的多达儿-1-至几百次的串联重复：出丁基本单元重复次数的不同，进而形成SSR座位的多态性；根据SSR座位两侧保守的单拷贝序列设计一对特异引物米扩增SSR序列，即可揭示其多态性。3.3
标准样品 standard sarmplie
经权威机构认定认证的代表已知品种特征特性的样品，对有性繁殖作物而言，般为种子，3.4
带型patterTs
某核心引物扩增特定单株INA得到的条带类型。4原理
根据SSR序列两辩保守的单拷贝序列设计特异引物，利用PCR技术扩增和电泳分析，获得样品各单株的SSR电泳带型。将受检样品与标准样品就单株间的带型逐一进行差异比较和判读分析，进行棉花品种真实性鉴定。
5试剂与溶液
除非另有说明.在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T6682规定的一级水，NY/T2634—2014
5.1B-巯基乙醇。
5.2另丙醇。
5.3剃离硅烷
5.4四甲基乙二胺（TFMEL')。
5.5Taq DNA 聚合酶。
5. 6 PCR 反应缓冲液(lCXBulfer)5.725 IHrnol/L氯化镁溶液（MgCl:)5. 81 mul/ L 三羟甲基氨基甲烷一盐酸溶液(Tris-HCI)称取1211g三羟甲基氨基甲烷（Tris)溶解十800tnl.水中，用盐酸（FHC1)调pH至8.0.加水定容到1000ml，在103.4kPal121℃)条件下灭菌201nin.4C储存，5.910mol/L氢氧化钠溶液(NaOH)在160ml.水中加人80.0g氢氧化钠、溶解后冷却至室温，再加水定穿到200mL，5.100.5mol/I.乙二铵四艺酸二钠溶液(EDTA—Na2(pH8.0)称取187.6g乙二铵四乙酸二钠（EDTA一Va）加人800mI.水中，再加人适量氢氧化钠溶液，加热至完全溶解后，冷却至室，用氢氧化钢溶液调pH至8.0,册水定容到1000ml在103.1kPa(121℃）条件下灭菌20min,4℃储存，
5.11DNA抽提液
分别称取 69.3”葡萄糖,20.0聚乙烯吡咯烷酮(PVP),1.0g二乙毕二碗代氨升I酸(DIFCA)溶于 500 mlL 水中-然后分别如入 100 mL 1 mol/L 的 Tris-HC1 溶液、10 mI. 0, 5: mal/1. 的 FDTA一Naa济液（pH8.0）.定容到10c0ml。在103.1kPa121℃）条件下灭菌20min，4℃储存。5.12DNA裂解液
分别称取81.7g氯化钠（NalCl）.20.0g聚乙烯吡咯烷酮(I\VP）.20.0号十六烷基中基况化铵CTAB).1.0 g-.乙基硫代氨基中酸(DIECA)溶于 500 mL水中,然后分别加人100ml.1mol/I.的Iris HCl溶液,4 mL 0. 5 mol/ L 的 EIYTA Na溶液(pH 8. 0),定容到 1 000 mL。在 103. 4 kP:(121℃）条件卜火菌2Cmit.4℃储存5.13苯酚+氧仿+异戊醇混合液
体积比为 25+24+1 ,
5.14氨仿+异戊醇混合液
体积比为 21十1。
5.1570%乙醇
量取70ml.尤水乙醇，加水定容到100mL。5.16SSR引物工作液
引物序列见附录A.将引物配制成终浓度均为10也mol/「.的上、下游引物工作液。5.17dNTPs混合溶液
浓度为2.5 Innol/L 的 dNTPs混合溶液。5.185×三羟甲基氧基甲烷/硼酸电泳缓冲液(5×TBE)分别称收50.0g1ris.27.5g谢酸溶下500mL水中，加入10mL0.5mal/L的EDTA-Na溶液(pH8.C).定容到1C00mL,1C储存。5.19加样缓冲液
在98ml.去离子甲酰胺中加人250 mg溴酚蓝,2501Ig二甲苯氰,2mL 0.51ol/L的 EIYTA-Naz溶液（pH8.0)，溶解混句，常温保存。2
5.20亲和硅烷工作液
在1ml.无水乙醇中加人5μl.亲和硅烷原液，混勾。5.216%变性聚丙烯酰胺溶液
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称取57.0g丙烯酰胺，3.0g甲叉双内烯酰胺，420.0g尿素溶于200l.水中.加人200mL5×TBE，室温充分游解后.定容到100CmL，4%储存。注：丙烯酰胺具神经毒性，配制时应注意防护，5.2210%过硫酸铵溶液
称取1℃.0g过硫酸铵溶于100ml.水中，4℃储存，5.231%硫代硫酸钠
称取1.0g硫代硫酸钠，溶于100ml,水，室温储存。5.24固定液
在89.5ml.水中加人10tmL无水乙醇.0.5mL冰醋酸，根据胶板数量调整固定液的量.现用现配。5.25染色液
在1001nL水中加人0.2g硝酸银（AgN()），极据胶板数量调整染色液的量，现用现配。5.26显影液
在100mL水中加人1.5g氢氧化钠和0.4mL甲醛（37%），根据胶板数量调整显影液的量，现用现配。
6仪器和设备
6.1 PCR 扩增仪。
6.2电子天平：感量0.1g和0.1g
6.3台式高速冷冻离心机：最大离心力210000g。6.4电泳检测系统：垂直电泳系统。6.5酸度计：精度土0.01pH，
6.6单道微量移液器；2.5、10L20L.100、200L、1000μl。6.7多道微量移液器：8道或12道，10ul、100ul.。6.8冰箱：4℃、20%。
6.9高压灭菌锅。
0温水浴锅：温控精确度=1℃。
6.11脱色摇床。
6.12胶片观察灯。
7操作步
7.1试样的制备
受检样品和标准样品可为棉花的种子，幼节、幼嫩叶片等。样品纯度应符合（B4407.1的规定，种子托样按G/T3543.2的规定执行，种子发芽按GB/T3513.4的规定执行，以变检样品所标注品种的标准样品作为对照.同时检测受检样品和标准样品。7.2DNA提取
分别从受检样品和标准样品中随机抽取12粒种子或单株利用CTAB法分单株（或单粒种广)提取基因组 DNA。
7.2.1取单粒种子，剥壳并将利1磨碎，移人2.0tmL离心管；或取棉花幼嫩叶片约200mg~300mg：3
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置于2.0ml.离心管中t，加液氮充分研磨。7.2.2加人 1 ml.4℃预冷的 DNA抽提液和 2 uL 3-疏4乙醇.充分混勺,4℃:静置 5 min,12 000 r/min离心10 min,弃上清。
7.2.3加人1tmL65℃预热的I)VA裂解液和2μI.3统基乙醇,充分混勾,65℃水浴30 min.12000r/min离心10min
7.2.4将上清滋转移至新离心管中，并加入等体积的苯酚十氯仿十异戊醇混分液.充分混匀.12000r/nin.室温离心I min
7.2.5将上清液再次转移至新离心管中，并加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，充分泥勾，12000r/min，室温离心10min
7.2.6吸瑕上清液至新离心管，并加,人等体积的异丙醇，混勾，一20℃放罩3Ii1以L.充分沉淀DNA。
7.2.75000r/min，1℃离心5mil.充上消，沉淀经70%乙醇洗涤后.案温晾下。7.2.8加入100水，将DNA充分溶解后备而。7.3PCR扩增
利用39对SSR核心引物（见附录A逐一对受检样品和标准样品各单株DNA进行扩增。7.3.1PCR扩增反应体系
在PCR反应管中接表1依次加人反应试剂,混匀。表 1 PCR 扩增反应体系
ICXBuffer
2: mmeil/ I. MgCl, 济液
dNTPs混合溶液（各2. 5 mmol/L10 μmol/1. 1:游引物
10unol/下游引物
TcaIDNA聚合酶
INA模板
总体积
终浓度
2. 5 mmol/ 1.
务 0. 25 mm/ [
0. 2 μtol/ L
c.2 μumol/L.
\ד表示体积不确定。如巢PCR缓冲液中含有MuC2.则不加MgC溶液；根据Tay嗨的浓度确定其体积，并相调整水的体积，使反成体系总体积达到！I7.3.2PCR扩增反应程序
反应程序为：95℃变性3min；94℃变性50s.55℃退火45s,72℃延伸5Cs.其进行35次循坏，在72℃延伸7min.4℃保存
7.4PCR产物的电泳检测
PCR产物来用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(参见附录13)检测。7.5差异位点比较与判读
根据核心引物在受检样品和标准样品间所扩增带型的差异，比较受检样品和标准样品在每个位点的异同（参见附录（）。
7.5.1某核心引物在受检样品和标催样品间扩增出的条带类型完全一致.表现为无差异带型，记为相同位点。
7.5.2某核心引物在受检样品和标准样品间扩增出的条带类型不完全一致，当表现异类带型的单株数≤2时,该老异带型为偶然差异带型.记为疑似相同位点。4
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7.5.3某核心引物在受检样品和标准样品间扩增出的条带类型不完全-致，当表现异类带型的单株数2时，该差异带型为异型，记为差异位点，8结果判定
按7.5的方法分别统计受检样品和标准样品在39对SSR核心引物上表现山的相同位点数、疑似相同位点数和差异位点数，当差异位点数>2时，判定为不同品种；当差异位点数2时，判定为近似或极近似品种，
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附录A
（规范性附录】
SSR核心引物
核心引物名称、片段大小范围、引物序列和染色体定位见表A.1。表A、1核心引物名称、片段大小范围、引物序列和染色体定位名称
MUSS2?
NAU2277
MUCS:01
NAU1269
NAU905
NAU1048
DPL0220
DPLC431
1NE449
JFSPR42
ENI598
TM10312
[FSFRI56
CIRIO5
NAL5120
HL0354
DPI0249
NAU2274
片段大小范圃(bp
200--300
100~-180
20:-~330
120~-200
120~-200
140-~300
200--300
120--160
180--300
14C~-18C
100-110
160~300
80--120
120200
10C--120
F—「游引物
R游引物
F-TGGTTTTGCCEATCTTTACG
R-GAAAGGGAAGATGAGGAGGG
FGAACIAGCCACATGATGGAC
R-TTGTTGAGGCATTAGTTTGC
F-GTTCCCAACTTATTIGT
R-GGTGCFCCEGGATTAGATTT
F-AGCETCTCTCTCCTTCAGGC
R-GAGTCATATCGCTTGGGAGC
F TACCTGAAACCCA4AATGGT
R-ACGCTGTTATAGGGCTCATC
F-TGCTGAAETTTGCAATTTA
R--.AAGCAAGGGAGGTAAIUCTT
F-GGICATATTATTGCAGAAOC
R-ACAGCCTIGAGITGAGCTTT
GTIGGCTAAGOTATAAIGATGA
R-AACAAGGTTCATAACTICTGGTGG
F--CTATCACOCTTCTCTAGTTCOGTT
R-ATUGGGCTCACAAACATCA
F-ATCTTTCAAACAACGGCAGC
CGATICGGACICTTGATGI
F-CGT'TGCCGTCTTCGAGTCCTT
R-GTGGGTGGCTAATATGTAGTAGTCG
F-TATCTCCTICACGATTCCATCAT
RAAAAGAAAACAGGGTCAAAAGAA
: FAGCITTICCATTUCAGAGCA
RGGTTGTTGCAAGAGTTCACG
F-GCTTCAATCAATTCATAEG
R: GAAGXGAGAAAGCAACGAATTAG
FGTCTCTTTCTTTETTTCTTACwwW.bzxz.Net
RAACCAAACTGAACCCA
F-GCXACCAATAAAGCAAGTUT
R-TGGATCCTGAAGAAGAGACA
H-TAGTGGTGGITAAGAAGAAGGIGG
R CGCIICAGTCITIIGKTTTAACTA
FACAGAGCIATGGGAAAITATGGIA
R-TGTACIGCAAATIYGTGCTAAGAC
TCCICGGATTATCAAAACCT
RTGAAGAGGACATTGAIGACG
染色体定位
JESPR158
1BN14030
JESPR:14
NAU322
NAU2026
JESPRG5
NAU895
CIR328
JESPR197
JESPR274
NAU5064
TESPR153
CIR246
BNI8:3O
BNL243
NAU1102
DPLOCY
片段大小范用（bp）
140~180
10--140
1C0--140
80-100
160-~200
185--300
120--180
180~300
180--300
60~100
209-300
100-180
189--300
100--160
20-180
:23--2C0
109120
100-~120
200--300
160--300
表A.1（续）
F--」游引物
R一下游引物
F GATGCCAGTAAGTTCAGGAATG
R-GCCAACTTATATTGGGTTUCT
F-CACCATICGGCAGGTAITTC
: R-CTGCAAACCTTAGCCTAGACG
F TCCCTACTTAAGGTGCA
R-ATGTTGTAAGGGTGCAAGGC
F-GATTTAAGGICTTIGATX
IR-CAAGGGTTAGTAGGIGIHATAC
F CTCCAATCGAATGATITIT
R-GGTAGGGTTIIGGAGGTTTT
F- -GAATCTUGAAAAGCCCAIUE
R-ATTTGGAAGAAGTACCAG
F-OCACTCAATTIAAGAAGAAATTG
R -GGTTAGITGTATTAGGGICGTTG
F CATGATGCACACTTCACACA
R-CGGTTAAGCTITCAGAEATT
F-ATCCTATGGTTGTCATC
RATTFACCATTCAITCAAC
FCAATACCTGGAACATAGACAAATG
R-CTTGAGCTTGAAAAAAIG
-CGTTIGIITTOGIGTAACAGG
TGGTGGATTCACATCAAAG
GCCCACTCTTTTTCAACAC
R-TGATGICAIGTGGTTGC
F-TGITTCGACACACACCTAC
R-TCTTGGGAGAGAACGAGAAC
F -GATTACCTTCATAGGCEACTG
R GAAAACATGAGCATCCTGTG
F-CTCTUCATAAGCAAAAGTTG
R-ACXAACAATGGIGAXTCTT
F-TTAGGGITTAGTIGAATGG
R-ATGAACACACGCACG
ITCCGGGITTTLAATAAAG
R GTTAATACTITTTTICTTTTGTGTGTGF-GGGTTTTCTGGGTATITATACAACA
R-TCATCXACTTCAGCAGGATC
F-ATCTCICIGTCTLCCCLTTG
R-GCATATCTGGGGGTATAAT
F GCAAACACCATCCTACCACAA
R-- GGITGTATGATCAAGGCTTGGTTTNY/T 2634—2014
染色体定位
C12,C22
C9,C23
C13,C18
C3,C14
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B.1电泳样品准备
附录B
【资料性附录】
6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
在PCR*物中加人等体积加样缓冲液.充分混勾后在95℃变性5min，1℃冷却10min以上。B.2凝胶制备
B.2.1玻璃板处埋：取消洗T净的长短玻璃板.用去离子水冲洗干净后晾十，用无水乙醇分别擦洗满遍.晾干；在长板1涂亲和硅烷工作液，短板（带抑槽)涂剥离硅烷工作液。操作过程中防止两块玻璃板互相污染。
B.2.2玻离板纠装：待玻璃板彻底干燥后使用0.4mm均厚的垫片组装凝胶胶膜夹层，注意垫片与玻璃极的边、压紧对齐。
B.2.3灌胶：在6CmL6%变性丙烯酰胺溶液中加人10=LTEMED和100μL10%的过硫酸铵溶液匀后立即灌胶。待胶充满整个凝胶火层，轻轻的插人梳·子，梳齿期外，使其聚合至少1h。灌胶过程中防止出现汽范
B.3预电
待胶凝固后，将玻璃板安装到电泳槽上.在正极槽和负极槽小分别加入0.5×1BE缓冲液，使凝胶夹层能浸泡在缓冲液中，拨拔出梳子。80W恒功率预电泳10min~20min。B.4电泳
用移液器吹吸加样槽清除气泡和杂质.将梳齿刺内插人梳子形成加样孔每孔加样5，即W功率电泳至指示带(二甲米氰)到达胶板的中部，电泳结束，关闭电源。B.5卸胶
取下玻璃板.将两块玻璃板轻轻撬开，凝胶会紧贴在长板上，及时做记号以区别胶板，B.6银染
B.6.1固定：将胶板浸人固定液，置于搭床L摇动固定5minB.6.2染色：将胶板移人染色液，摇动染色5min.B.6.3漂洗：将胶板移人llH0中摇动45s.弃去ddH：再加人含0.02杀体积1%硫代硫酸钠的ddH,o摇动lmin。
B.6.4显影：将胶板移人显影液摇动至显出清晰的条带.B.6.5记录：用数码相机照相或在胶片观察灯上白接记录结果。注：固定.染色，漂洗，显影时游液的量可根据胶板数虽调整，以没过胶面为雅。8
C.1相同位点的统计
附录C
（资料性附录）
差异位点比较与判读示例
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图C.1（a）为A，B样品在引物CM45上的扩增结果，两样品表现出扩增一致的无差异带型，因此该引物在此记为相同位点；
图C.1(b）为A、B样品在引物NAU1269上的扩增结果.A样品共扩增出2种带型（图中箭头标示的IⅡ）；B样品也扩增出相同的2种带型（图中箭头标示），两样品也表现出扩增一致的无差异带型，因此该引物在此也记为相同位点。2315678910111212345618910112祥品用
图C.1引物CM45(a)、NAU1269(b）扩增标准样品与受检样品图谱C.2疑似相同位点的统计
图C.2(a）为A，B样品在引物BNL598上的扩增结果，A样品扩增出一种带型I.B样品除了扩增出与A样品相同的带型1，还新出现了1株（1号单株，异类带型单株数≤2)带型Ⅱ，将这种偶然的带型差异记为疑似相同位点：
图C.2（b）为A、B样品在引物DPLC431上的扩增结果，A样品扩增出一种带型I，B样品除了扩增出与A样品相同的带型I还新出现了2株（6号、9号单株，异类带型单株数2)带型Ⅱ，本标准中，也将这种差异看作偶然的带型差异，记为疑似相同位点。9
NY/T2634—2014
123456789101112
1样品B
567840112
祥品会
1234567891011
样品A
引物BNL598（a）、DPL0431（b）扩增标准样品与受检样品图谱图C.2
C.3差异位点的统计
图C.3（a）为AB样品在引物JESPR156上的扩增结果，A样品扩增出带型I.B样品扩增出带型II·两样品扩增出的条带类型不同，因此该引物在此表现为差异位点，图C.3(h)为A，B样品在引物DPL.0071上的扩增结果，A样品扩增出带型1，B样品除了扩增出与A样品相同的带型I，还新出现了5株（1号、4号、5号11号和12号单株，异类带型单株数>2）带型Ⅱ，该引物在此也表现为差异位点。样品B
B910111212
34567890
图C.3引物JESPR156（a)、DPL0071(b）扩增标准样品与受检样品图谱10
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