NY/T 544-2015
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NY/T 544-2015 猪流行性腹泻诊断技术
NY/T544-2015
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ICS11.220
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 5442015
代替NY/T544—2002
猪流行性腹泻诊断技术
Diagnostic technigues for porcine epidemic diarrhea2015-05-21发布
2015-08-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准按照（B/T1.1-2009给出的规则起草，本标准代替NY/T544—·2002《猪流行性腹泻诊断技术》。本标准与NY/T544—2002相比·病原检测部分增加了RT-PCR检测方法本标推由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归1。本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，本标准丰要起草人：冯力、陈建飞、时洪艳、张鑫本标准的历次版本发布情况为：-NY/T 544—2002.
NY/T544—2015
１范围
猪流行性腹泻诊断技术
NY/T 544—2015
本标准规定了猪流行性腹泻的病原学检测和血清学检测。病原学检测包括病毒分离与鉴定、直接免疫荧光法、双抗体心酶联免疫吸附试验和反转录一聚台酶链式反成。血清学检测包括而滑中和试验和问接酶联免疫吸附试验，
本标准适用丁对猪流行性腹泻的诊断、产地捡疫及流行病学调查等，2规范性引用文件
下列文件对于本文件的成用是必不可少的。凡是注口期的引用文件.仅注口期的版木适本文件。凡是不注口期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/I27401实验室质量控制规范动物检疫3术语和定文
下列术语和定义适用于本文件。3.1
猪流行性腹泻porcineepidemicdiarrhea，PED猪流行性腹泻是由尼多目（Nidouirules)、冠状病毒科(Coronuviridae）、a-冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒（porcineepidemtrdiarrheuirus，PEDV)引起的猪的一种离度接触传染性的肠道疾病以呕吐、腹泻、脱水和哺育仔猪高死亡率为卡要特征。4缩略语
下列缩略语适于本文件，
cPE：cylopathic eect细胞病变作用。DIA;direct immunoflunresrcnee assay接免疫荧光法。ELISA：enzyme-linked immunosorbentesaay酶联免疫吸附t试验PBS：phosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液。PED:porcine epidemic diarrhea 猪流行性腹PEDV:porcine epidemic diarrhea virus猪流行性腹泻病毒。RTPcR：leversetranscription pelymerase chainreaction反转录象合酶链式友应，5临床诊断
5.1流行特点
本病年四季均可发生，主要发生在每的12月到翌年的3月，有时也发生于夏季，秋季。各种年龄的猪均可感染尤其是1周龄内的哺乳猪，发病率和死亡率可高达100不。病猪、带毒猪利隐性感染猪是本病的土要传染源。病毒通过粪一口途径或感染母猪的乳汁进行传播。5.2临床症状
病猪首先表现为呕吐，多发生在乳或吃食后，吐出的胃内容物是黄色或乳白色，随后出现水样腹1
NY/T 544—2015
泻，胶泻物兰灰黄色、灰色，或呈透明水样、顺肛门流川，沾污臀部、表现脱水，眼窝下陷·行走螨卿，精神沉郁，食欲减退或停食。症状与年龄大小有关，年龄越小症状越重。1周龄以内的仔猪在发生腹泻3d-1d后，常因严重脱水而死亡，断乳猪，育肥猪以及母猪症状较哺乳仔猪轻.表现精神不振、厌食，持续膜泻4d～7{后逐渐燃复正常，少数猪牛长发育不良。成年猪表现为厌食和腹泻，个别表现为呕吐：5.3病理变化
肉眼可见的病理变化只限于小肠，可见小肠膨胀，肠壁变薄，外观明亮，肠管内有黄色或灰色澈体或带有气体。肠系膜充血及肠系膜淋凸结肿大。组织学检查可见，小肠绒毛细胞的空泡形成和脱落，肠绒毛萎缩、变短，绒毛高度与隐窝深度从正常的7：降低为3：1。超微结构的变化，主要发生在肠细胞的胞浆，见细胞器的减少，产生电子半透明区，微绒毛终末网消失。细胞变得肩平。细胞脱落，进入肠腔，在结肠也可见到细胞变化.但末见到脱落。6实验室诊断
6.1病毒分离与鉴定
6.1.1仪器、材料与试剂
除特别说明以外.本标准所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的灭菌双蒸水或超纯水，倒置显微镜、冷冻离心机、微孔滤器、细胞培养瓶、盖坡片、温箱等。Ver细胞系、仔猪空肠内容物及小肠内容物或粪便。磷酸盐缀冲液(PIS).细胞培养液、病毒培养液、N-2-羟乙紫嗪-N'-2-乙烷磺酸（HEPES)液（配制方法见附录A)。6.1.2病毒分离
将采集的小段空肠连同肠内溶物或类便用含1000JU/1uL背霉素，1(00μg/Inl.链霉素的P3S制成5倍悬液，在4C条件下3000r/nin离心30min,取上清液，经0.22μm微孔滤膜过滤，分装，即使用或置20℃:保存备用。将过滤液（病毒培养液的10%)接利于Vero细胞单层上.同时加过滤液量50%的病毒培养液，37℃吸附1H根据纠织培养瓶大小添加病毒培养液个病毒培养总量，置37℃.培养.逐日观察3d~-4d，按致细胞病变作用(CPE)变化情况.可盲传2代～3代。6.1.3结果判定
（IE变化的特点足细胞面粗糙、颗粒增多，有多核细胞（7个-~8个甚至儿个）并叫见空斑样小区，细胞逐渐脱落。这是特征性的CPF,可与猪传染性胃肠炎（TGE)病毒的CPE相区别同时，在细胞培养瓶中加盖坡片，收毒后用直接荧光做鉴定试验。有条件吋可进行电镜观察，用负染法在阳性样品中中镜观察，可见到冠状病毒粒子，6.2直接免疫荧光法
6.2.1器、材料与试剂
除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的火菌双蒸水或超纯水。荧光显微镜、冷冻切片机，载玻片、盖玻片、湿箱、滴苦等，荧光抗体（FA）、急性期内（5～7l)心猪空肠中段的黏膜上皮或肠段。磷酸盐缓冲液（PIS).0.1%伊文思蓝原液磷酸盐缓冲甘油（配制方法见附录 B)。
6.2.2标本片的制备
6.2.2.1组织标本
采急性期内（5cl~7l)患猪空肠f1段的黏模上皮做涂片或肠段做冷冻切片（4pm~7μm)，丙酮巾中周定 10 min,置于 PIs中没泡 l0 min~15 min,风干或凹然于燥6.2.2.2细胞培养盖玻片
将分离毒细胞培养24h~-48h的盖玻片及阳性、例性对赠片衣PBS中冲洗数次-放人内酮中固定10 min,再置于 F3S 中没泡 10 min~15 min.风十2
6.2.3FA染色
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用 0.C2%伊文思原液将FA稀释至工作浓度(1：8以上合格)。4000 r/min离心10i.取1:消液滴于标本上。37C恒温恒湿染色30rmin用PBS冲洗3次，依饮为3min.4min.5min.风干，滴加磷酸盐缓冲廿油.盖玻片封固，荧光显微镜检查。6.2.4结果判定
判定标准：在荧光显微镜下检查，被检标本的细胞结构应先整清晰，并在性、阴性对照均成立时判定。在胞浆中见到特界性苹果绿色荧光判定为阴性，如所有细胞浆中无特异性荧光判定为阴性。川根据细胞内荧光亮度强、弱分别做如下记录a）十十一十:呈闪亮苹果绿色荧光：b）++十:呈明亮苹果绿色荧光；c）十干:呈般苹果绿色炭光;
）十：呈较弱绿色炭光
e）—:呈红色,
结果为 a)~)者均判为阳性。
6.3双抗体夹心ELISA
6.3.1仪器、材料与试剂
除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯-水为符合GB/T6682规定的火菌双蒸水或超纯水定量加液、微量移液器及記套吸头、96孔或10孔骤乙烯微量反应板、酶标测试仪。猪抗PE）lgG、猪抗PED-IgG-HRP(HRP为辣根过氧化物酶）,发病仔猪类粪便或肠内容物：洗液,包被稀释液、样品稀释液、酶标抗体稀释液、底物液、终止液（配制方法见附录（）6.3.2操作方法
将发病仔猪粪使或肠内容物用浓盐水 1：5稀释,3 000 r/min离心20 min.取上清液待检。6.3.2.1冲洗包被板
向各孔注入无离了水，浸泡3min甩十，重复3次，甩干孔内残液，在滤纸上吸干。6.3.2.2包被抗体
用包被稀释液稀释猪抗PFI)-IgG至使用倍数，每孔加100uL，置于4℃过夜，弃液.用洗液冲洗3次，每次3min.
6.3.2. 3加样品
将被检样品用样品稀释液（见附录C.3)做5倍稀释，加入两孔，每孔100L：每块反成板设阴性抗源、阳性抗原及稀释液对照各两孔。置于37℃作用2h+弃样品，冲洗向6.3.2.2.6.3.2.4加酶标记抗体
每孔加100L经悔标抗体稀释液稀释至使用浓度的猪抗FEDIgG-IIRP，37C2h，弃液、冲洗同 6.3.2.2。
6.3.2.5加底物溶液
每孔加新配置的底物溶液100山.罩F37℃30min。6.3.2.6终止反应
每孔加终止液50μL,置于室温15min。6.3.3结果判定
酶标测试仪在波长492nm下测定吸光度（OT)值。阳性抗原对照两孔平均OD值0.8.阴性抗原对照两孔平均（D值.2为正常反应，按以下两个条件判定结果：P/N值2，H披检抗原网孔平均0)值0.2判为阳性.否则为阴性注：P为陷性孔的OD值.N为阴性对照孔的O心值，3
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6.4RT-PCR
6.4.1校器、材料与试剂
除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，水为衍合GB/T6632规定的灭菌双蒸水或超纯水PCR扩增仪、1.5mL离心管、0.2mLPCR反应管、电热恒温水槽、台式高速低温离心机、电泳仪、微量移液器及配套吸头、微波炉，紫外凝胶成像仪、冰箱，TRIzol@试剂、核糖核酸酶（RNase)抑制剂（40U/ul）.反转录静（M-MI.V)(200U/uL）、tNTPs混合物（各J0mM）、无RNasedHO.EmeraldAmpMPCRMastcrMix(2×）DL200CINAMarker、10X或6×DNA上样缓冲液、PRS(配制方法见附录A）、TAE电泳缓冲液（配制方法见附录D）氯甲烷、异内醇，三羟甲基氨基I!I烷（Tris碱）、琼脂糖、艺胺四乙酸二钠（NaELTA）、冰乙酸、氯化钠、溴化乙锭、灭菌双蒸水。6.4.2引物
6.4.2.1反转录引物(ORF3RL)
5'GGTGACAAGTGAAGCACAGA-3'；
引物忙存浓度为10μmol/1..使用时终浓度为500prnol/L，6.4.2.2PCR反应引物
上游物ORF3U)：5'-CCTAGACTICAACCITACGA3'；F游[物(ORF3I):5'-CAGGAAAAAGAGTA(XAAAA3:引物贮存浓度为10sumo1/L.使用时终浓度为200pmol/L。6.4.3样品制备
将小肠内容物或粪便与灭菌PBS按1：5的重量体积比制成悬液在涡旋混合器上混勾后4C50G0r/min离心10min，取上清液丁无RNA酶的灭菌离心管中、备用。制备的样品在4保存时不应超过24h.长期保存应分装成小管，置了70以下，避免反复冻融。6.4.4病毒总RNA提取
取6.. 3制备的待检样品上清 300uL无RNA酶的灭菌离心管(1.5mL)巾,入 500I.RNA提取液（TRlzolRcageni），充分混勾，室温静置10min；入500uL三氯甲烷，充分混勾，军温静置10min，4%12000r/min离心10min，取上清（500L）于新的离心管（1.5ml）中，加入1.0ml.异丙醇，充分混勾，20%静置30min.4℃1200)r/min离心10min，小心弃上清，倒置于吸水纸t，室温白然风干。加人20μL无RNastlHz辫解流淀.瞬时离心.进行 cDNA合成或置于一70℃以下长期保行，若条件允诈.病毒总RNA还可用病点RNA提取试剂盒提取，6.4.5DNA合成
反应在20ul.体系中进行。取6.4.4制备的总RNA12.5L于光RVA酶的火菌离心管（1.5mL）中，加入1L反转录引物（0RF3RL）混勺.70℃保温10minF池速在冰上冷却2min，瞬时离心使模板RNA/引物混合液聚集于管底；然后，依次加人4nL5XM-MLV缓冲被1LdVTPs混个物（各1Cminol/L)0.5μLRNas:迎制剂,1.0uL反转录酶MMLV混匀12℃保温1h;最后.70℃保温15min后冰1:冷却.得到心DNA溶液·立即便用或置1一20℃保存6.4.6PCR反应
6.4.6.1反应体系(25uL)
2XEmeraldAmpMPCRMasterMix
模极(cl)NA)
无菌双蒸水加至
12. 5 μl.
PCR反应时.要设立阳性对照利空白对照：阳性对照模被为猪流行性腹病RF3坚因重组历4
粒，空白对照模板为提取的总RNA。6. 4. 6. 2PCR 反应程序
>Y/T 544—2015
94℃预变性min然后30个环（98℃变性105.55℃退火3℃s.72℃延仲5Cs）.最后72°延仲7 min.4℃保存，
6.4.7电泳
6.4.7. 1制胶
1头琼脂糖凝胶板的制备：将1g琼脂糖放入100ml.1×TAF电泳缓冲液中，微波炉加热融化。得温度降至垒60℃左右时，加人10mg/ml溴化之锭（FB)5ul均勾铺板，厚度为31m~5I1。6.4.7.2加样
PCR反应结束后，取5μJ.扩增产物（包括被检样品、阳性对照、空白对照）,5μLDL2C00 DVAMarker进行琼脂糖凝胶电泳。
6.4.7.3电泳条件
15C V 电泳 10 min~15 min。
6.4.7.4凝胶成像仪观察
反应产物电泳结束后，用凝胶成像仪规察检测结果、拍照、记录试验结架。6.4.8PCR结果判定
各被检样品在同一块凝胶板上电泳后，当IDNA分子质量标准，各组对照尚时成立时，被检样品电泳出现一条774lbp的条带，判为阳性（十）；被检样品电泳道没有出现大小为774hP>的条带，判为阴性（—）。缩果判定参见附录D图D.1，6.5血清中和试验
6.5.1仪器、材料与试剂
除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，水为符合（B/T6582规定的灭菌双蒸水或超纯水。微量移液器及配套吸头、96孔微晟平底反应板、二氧化碳培养箱或温箱、倒置显微镜、微量振荡器、小培养瓶等。Vcro细胞系病毒抗原和标准阴性血清.阳性血清、指示毒（毒价测定后立即小量分装，一30℃冻存，避免反复冻融，使用剂量为500TCID501000TCIDs）同头份的健康（或病初）血消和康复3周后的双份被检血消或单份而清。稀释液、细胞培养液、病毒培养液,HEPES液。6.5.2操作方法
用稀释液倍比稀释血清，每份血清加4孔，每孔50ul.再分别加50，l指示毒。经微量振荡器震荡1min~2min置于37℃中和1h。每孔加细胞悬液100μL（2×105个细胞/ml.~3×105个细胞/rmlL）微量板置于37℃、氧化碳培养箱或用胶带封口置于37℃温箱培养，72h～96h判定结果。设阴性对照、阳性对照，病毒对照和细胞对照，阴性而血消与待检血清同倍稀释.阳性血清做2-\稀释。6.5.3结果判定
当病毒抗原及阴性血清对照组均出现CPE，阳性血消及细胞对照组均无CPF时，试验成立、以能抑制50%以上细胞出现CPF的血清最高稀释度的倒数判定为该血清PED抗体效价的滴度，血消中和抗体效价18以上为阳性反应；1：4为疑似反应；小11：4为阴性反成。疑似邮清复检一欲·仍为叫疑时,则判为阴性。发病后3周以上的康复血清滴度是健康（或病初)血清滴度的4倍或以上-判为阴性反应。6.6间接ELISA
6. 6. 1仪器、材料与试剂
除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯.水为符合GB/T6682规定的灭菌双蒸水或超纯水，定量加液器、微量移液器及配套吸头、96孔或40孔聚乙烯微量反应板、酶标测试仪等。抗原和酶标抗体。磷酸盐缓冲液、包被稀释液、样品稀释液、酶标抗体稀释液、底物溶液及终止液。NY/T 544—2015
6.6.2操作方法
6.6.2.1冲洗包被板
向各孔注人无离子水.这泡3 min,甩下,重复3次。甩十孔内残液，在滤纸上啵十，6.6.2.2抗原包被
用包被稀释液稀释抗原至使用浓度包被量为每孔10℃uL.置于4℃冰箱湿盒内过夜，弃掉包被液，用冲洗澈洗3次.每次3min
6.6.2.3加被检及对照血清
将每份被检血清样品用血清稀释液做1：100稀释，加人两个孔，每孔100uL。每块反应板设阴性、阴性血清及稀释液对照各两孔.每孔100μL.盖好包被板置37℃湿盒内1h.冲洗尚6.6.2.2.6.6.2.4加酶标抗体
用酶标抗体稀释液将酶标抗体稀释至便而浓度.每孔加1C0mL.置于37℃湿盒内1i.冲洗同6. 6. 2. 2.
6.6.2.5加底物溶液
每孔加新配制的底物溶液10mL.在37%湿盒内反成5min-~1cmin，6.6.2.6终止反应
每孔加终止液50μl。
6.6.3结果判定
6.6.3.1目测法
阳性对照血清孔显鲜明的橘黄色，阴性对照血清孔无色或基本无色，被检血清孔凡显色者即判抗休阴性。
6.6.3.2比色法
用酶标测试仪，在波长492nm下.测定各孔（D值：附性对照血清的两孔平均（D值>0.6.阴性对照血清的两孔平均OD值≤0.162为止常反应，OD值0.200为阳性；(0D值为0.200～0.400时判为+\：0.400~-0.800判为\十十”，()D值0.800判为+十一\，0D值在0.163~~0.200之间为疑似；(OD值C.163为\一”。对疑似样品可复检一次，复检结果如仍为疑似范围，则布P/N比值.P/V比值2 判为阳性,P/N比值2 若判为阴性。7结果判定
只要实验室诊断中的任何：种方法的结果成立，即可判断该病为猪流行性腹泻心
附录A
(规范性附录）
溶液的配制
A.10.02mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)的配制-VY/T 544—2015
A1.10.2ml/L磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢钠N&HP(),·12H0)71.6g.先加适量无离-子水溶解，最后定容至100Cml..混匀。A.1.2(.2mol/1.磷酸二氢钠溶液：称取磷酸二钠（NaH2P0·12HO)31.21g，先加适量光离水溶解，最后定容至1000ml，混勾。A.1.3量取0.2nol/L磷酸氢二钠济液360mL，0,2mo1/L磷酸.氢钠溶液140ml.称取氯化钠38g.用无离子水溶解至稀释至500011L.4℃C保存，A.2细胞培养液的配制
含10%灭活特牛血清的1640营养液，加100IU//trL市霉素，100μg/mL链等素，用5.6%碳酸氧钠(NaTIC)调pH至7.2。如需换液，则而清含量为5。A.3病毒培养液的配制免费标准下载网bzxz
1640培养液中加下列成分，使最终浓度各达到：1%甲基亚砌(DMSO);
5μg/mL-~10pg/mL胰酶
1001U/mL青霉素；
100μg/mL链霉素；
以5.6%碳酸氢钠(NaH).)调节pH至7.2。A.4HEPES液的配制
称取C.2385gHEPES溶于100mL无离广水中，用1mol/L氢氧化钠NaCH)调节pH至7.0.~7.2.过滤后置4℃备用。
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0.1%伊文斯蓝原液的配制
附录B
【规范性附录]
直接荧光抗体法溶液的配制
称取伊文斯蓝0.1g溶于10CmL0.02mol/LpH7.2的PBS中，4C保存，使用时.稀释成0.02%的浓度。
磷酸盐缓冲甘油的配制
量取丙三醇90tL.0.02mo1/LpH7.2的PBS10mL振荡混合均每即成，4℃保存。8
C.1洗液的配制
附录C
（规范性附录】
双抗体夹心ELISA溶液的配制
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量取50μl.吐温-20,加人100mL0.02uol/LpH7.2麟酸盐缓冲液（见A.1)4，C.2包被稀释液的配制
C.2.1.0.1mol/LPH9.5碳酸盐缓冲液：0.1mol/t.碳酸钠液：称取碳酸钠10.6g，加无离子水至1000mL0.1Tmol/1.碳酸氢钠液：称取嵌酸氢钠8.4g加无离子水至100CmLC.2.2量取0.1mol/L碳酸钠液200ml0.1mol/1.碳酸氢钠液700ml..混合即成。C.3样品稀释液的配制
加0.05必吐温-20.1%明胶的0.02101/1.PH7.2磷酸盐缓冲液，C.4酶标抗体稀释液的配制
加0.15%吐温-2C,1%明胶及5%灭活筷牛血清的0.02mo1/LpH7.2磷酸盐缓冲液。C.5底物溶液的配制
pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液（内含0.04%邻苯二胺及0.015%过氧化氢）。rl15.0磷酸盐柠檬酸缓冲液：称取柠檬酸21.0l片，加无离子水1000mI.量取24.3ml.与0.21mol/L磷酸氢钠液（见A.1.1)257mL混合，4℃C冰箱中保存不超过1周。称取4Cmg邻苯二胺，溶于1000ml.pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液中（用前从4冰箱中取出，在室温下放置20min-~30min）。待溶解后，加入150μL过氧化氢，根据试验需要量可按此比例增减。C.6终止液的配制
2mol/I.硫酸，并取浓硫酸4mI.加人32ml.无离子水中混勺。NY/T544—2015
D.1TAE电泳缓冲液（pH8.5)的配制50XTAE电泳缓冲储存液：
三羟甲基氨基甲烷(Tris碱）
乙胺四乙酸二钠(NaEDTA)
双蒸水
附录D
（资料性附录）
RT-PCR
待上述混合物完全溶解后，加入57.1mL的醋酸充分搅拌溶解.加双蒸水至1L后，置于室温保存。应用前，用双蒸水将50XTAE电泳级冲液50倍稀释。D.2样品检测结果判定图
见图D.1。
1000bp
500 bp
250 bp
100 hp
说明：
DL200C DNAMarker;
阳性对照；
阴性对照；
样品检测结果
3.5.6——阳性样品；
—阴性样品。
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本标准规定了猪流行性腹泻的病原学检测和血清学检测。病原学检测包括病毒分离与鉴定、直接免疫荧光法、双抗体心酶联免疫吸附试验和反转录一聚台酶链式反成。血清学检测包括而滑中和试验和问接酶联免疫吸附试验，
本标准适用丁对猪流行性腹泻的诊断、产地捡疫及流行病学调查等，2规范性引用文件
下列文件对于本文件的成用是必不可少的。凡是注口期的引用文件.仅注口期的版木适本文件。凡是不注口期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/I27401实验室质量控制规范动物检疫3术语和定文
下列术语和定义适用于本文件。3.1
猪流行性腹泻porcineepidemicdiarrhea，PED猪流行性腹泻是由尼多目（Nidouirules)、冠状病毒科(Coronuviridae）、a-冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒（porcineepidemtrdiarrheuirus，PEDV)引起的猪的一种离度接触传染性的肠道疾病以呕吐、腹泻、脱水和哺育仔猪高死亡率为卡要特征。4缩略语
下列缩略语适于本文件，
cPE：cylopathic eect细胞病变作用。DIA;direct immunoflunresrcnee assay接免疫荧光法。ELISA：enzyme-linked immunosorbentesaay酶联免疫吸附t试验PBS：phosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液。PED:porcine epidemic diarrhea 猪流行性腹PEDV:porcine epidemic diarrhea virus猪流行性腹泻病毒。RTPcR：leversetranscription pelymerase chainreaction反转录象合酶链式友应，5临床诊断
5.1流行特点
本病年四季均可发生，主要发生在每的12月到翌年的3月，有时也发生于夏季，秋季。各种年龄的猪均可感染尤其是1周龄内的哺乳猪，发病率和死亡率可高达100不。病猪、带毒猪利隐性感染猪是本病的土要传染源。病毒通过粪一口途径或感染母猪的乳汁进行传播。5.2临床症状
病猪首先表现为呕吐，多发生在乳或吃食后，吐出的胃内容物是黄色或乳白色，随后出现水样腹1
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泻，胶泻物兰灰黄色、灰色，或呈透明水样、顺肛门流川，沾污臀部、表现脱水，眼窝下陷·行走螨卿，精神沉郁，食欲减退或停食。症状与年龄大小有关，年龄越小症状越重。1周龄以内的仔猪在发生腹泻3d-1d后，常因严重脱水而死亡，断乳猪，育肥猪以及母猪症状较哺乳仔猪轻.表现精神不振、厌食，持续膜泻4d～7{后逐渐燃复正常，少数猪牛长发育不良。成年猪表现为厌食和腹泻，个别表现为呕吐：5.3病理变化
肉眼可见的病理变化只限于小肠，可见小肠膨胀，肠壁变薄，外观明亮，肠管内有黄色或灰色澈体或带有气体。肠系膜充血及肠系膜淋凸结肿大。组织学检查可见，小肠绒毛细胞的空泡形成和脱落，肠绒毛萎缩、变短，绒毛高度与隐窝深度从正常的7：降低为3：1。超微结构的变化，主要发生在肠细胞的胞浆，见细胞器的减少，产生电子半透明区，微绒毛终末网消失。细胞变得肩平。细胞脱落，进入肠腔，在结肠也可见到细胞变化.但末见到脱落。6实验室诊断
6.1病毒分离与鉴定
6.1.1仪器、材料与试剂
除特别说明以外.本标准所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的灭菌双蒸水或超纯水，倒置显微镜、冷冻离心机、微孔滤器、细胞培养瓶、盖坡片、温箱等。Ver细胞系、仔猪空肠内容物及小肠内容物或粪便。磷酸盐缀冲液(PIS).细胞培养液、病毒培养液、N-2-羟乙紫嗪-N'-2-乙烷磺酸（HEPES)液（配制方法见附录A)。6.1.2病毒分离
将采集的小段空肠连同肠内溶物或类便用含1000JU/1uL背霉素，1(00μg/Inl.链霉素的P3S制成5倍悬液，在4C条件下3000r/nin离心30min,取上清液，经0.22μm微孔滤膜过滤，分装，即使用或置20℃:保存备用。将过滤液（病毒培养液的10%)接利于Vero细胞单层上.同时加过滤液量50%的病毒培养液，37℃吸附1H根据纠织培养瓶大小添加病毒培养液个病毒培养总量，置37℃.培养.逐日观察3d~-4d，按致细胞病变作用(CPE)变化情况.可盲传2代～3代。6.1.3结果判定
（IE变化的特点足细胞面粗糙、颗粒增多，有多核细胞（7个-~8个甚至儿个）并叫见空斑样小区，细胞逐渐脱落。这是特征性的CPF,可与猪传染性胃肠炎（TGE)病毒的CPE相区别同时，在细胞培养瓶中加盖坡片，收毒后用直接荧光做鉴定试验。有条件吋可进行电镜观察，用负染法在阳性样品中中镜观察，可见到冠状病毒粒子，6.2直接免疫荧光法
6.2.1器、材料与试剂
除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的火菌双蒸水或超纯水。荧光显微镜、冷冻切片机，载玻片、盖玻片、湿箱、滴苦等，荧光抗体（FA）、急性期内（5～7l)心猪空肠中段的黏膜上皮或肠段。磷酸盐缓冲液（PIS).0.1%伊文思蓝原液磷酸盐缓冲甘油（配制方法见附录 B)。
6.2.2标本片的制备
6.2.2.1组织标本
采急性期内（5cl~7l)患猪空肠f1段的黏模上皮做涂片或肠段做冷冻切片（4pm~7μm)，丙酮巾中周定 10 min,置于 PIs中没泡 l0 min~15 min,风干或凹然于燥6.2.2.2细胞培养盖玻片
将分离毒细胞培养24h~-48h的盖玻片及阳性、例性对赠片衣PBS中冲洗数次-放人内酮中固定10 min,再置于 F3S 中没泡 10 min~15 min.风十2
6.2.3FA染色
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用 0.C2%伊文思原液将FA稀释至工作浓度(1：8以上合格)。4000 r/min离心10i.取1:消液滴于标本上。37C恒温恒湿染色30rmin用PBS冲洗3次，依饮为3min.4min.5min.风干，滴加磷酸盐缓冲廿油.盖玻片封固，荧光显微镜检查。6.2.4结果判定
判定标准：在荧光显微镜下检查，被检标本的细胞结构应先整清晰，并在性、阴性对照均成立时判定。在胞浆中见到特界性苹果绿色荧光判定为阴性，如所有细胞浆中无特异性荧光判定为阴性。川根据细胞内荧光亮度强、弱分别做如下记录a）十十一十:呈闪亮苹果绿色荧光：b）++十:呈明亮苹果绿色荧光；c）十干:呈般苹果绿色炭光;
）十：呈较弱绿色炭光
e）—:呈红色,
结果为 a)~)者均判为阳性。
6.3双抗体夹心ELISA
6.3.1仪器、材料与试剂
除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯-水为符合GB/T6682规定的火菌双蒸水或超纯水定量加液、微量移液器及記套吸头、96孔或10孔骤乙烯微量反应板、酶标测试仪。猪抗PE）lgG、猪抗PED-IgG-HRP(HRP为辣根过氧化物酶）,发病仔猪类粪便或肠内容物：洗液,包被稀释液、样品稀释液、酶标抗体稀释液、底物液、终止液（配制方法见附录（）6.3.2操作方法
将发病仔猪粪使或肠内容物用浓盐水 1：5稀释,3 000 r/min离心20 min.取上清液待检。6.3.2.1冲洗包被板
向各孔注入无离了水，浸泡3min甩十，重复3次，甩干孔内残液，在滤纸上吸干。6.3.2.2包被抗体
用包被稀释液稀释猪抗PFI)-IgG至使用倍数，每孔加100uL，置于4℃过夜，弃液.用洗液冲洗3次，每次3min.
6.3.2. 3加样品
将被检样品用样品稀释液（见附录C.3)做5倍稀释，加入两孔，每孔100L：每块反成板设阴性抗源、阳性抗原及稀释液对照各两孔。置于37℃作用2h+弃样品，冲洗向6.3.2.2.6.3.2.4加酶标记抗体
每孔加100L经悔标抗体稀释液稀释至使用浓度的猪抗FEDIgG-IIRP，37C2h，弃液、冲洗同 6.3.2.2。
6.3.2.5加底物溶液
每孔加新配置的底物溶液100山.罩F37℃30min。6.3.2.6终止反应
每孔加终止液50μL,置于室温15min。6.3.3结果判定
酶标测试仪在波长492nm下测定吸光度（OT)值。阳性抗原对照两孔平均OD值0.8.阴性抗原对照两孔平均（D值.2为正常反应，按以下两个条件判定结果：P/N值2，H披检抗原网孔平均0)值0.2判为阳性.否则为阴性注：P为陷性孔的OD值.N为阴性对照孔的O心值，3
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6.4RT-PCR
6.4.1校器、材料与试剂
除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，水为衍合GB/T6632规定的灭菌双蒸水或超纯水PCR扩增仪、1.5mL离心管、0.2mLPCR反应管、电热恒温水槽、台式高速低温离心机、电泳仪、微量移液器及配套吸头、微波炉，紫外凝胶成像仪、冰箱，TRIzol@试剂、核糖核酸酶（RNase)抑制剂（40U/ul）.反转录静（M-MI.V)(200U/uL）、tNTPs混合物（各J0mM）、无RNasedHO.EmeraldAmpMPCRMastcrMix(2×）DL200CINAMarker、10X或6×DNA上样缓冲液、PRS(配制方法见附录A）、TAE电泳缓冲液（配制方法见附录D）氯甲烷、异内醇，三羟甲基氨基I!I烷（Tris碱）、琼脂糖、艺胺四乙酸二钠（NaELTA）、冰乙酸、氯化钠、溴化乙锭、灭菌双蒸水。6.4.2引物
6.4.2.1反转录引物(ORF3RL)
5'GGTGACAAGTGAAGCACAGA-3'；
引物忙存浓度为10μmol/1..使用时终浓度为500prnol/L，6.4.2.2PCR反应引物
上游物ORF3U)：5'-CCTAGACTICAACCITACGA3'；F游[物(ORF3I):5'-CAGGAAAAAGAGTA(XAAAA3:引物贮存浓度为10sumo1/L.使用时终浓度为200pmol/L。6.4.3样品制备
将小肠内容物或粪便与灭菌PBS按1：5的重量体积比制成悬液在涡旋混合器上混勾后4C50G0r/min离心10min，取上清液丁无RNA酶的灭菌离心管中、备用。制备的样品在4保存时不应超过24h.长期保存应分装成小管，置了70以下，避免反复冻融。6.4.4病毒总RNA提取
取6.. 3制备的待检样品上清 300uL无RNA酶的灭菌离心管(1.5mL)巾,入 500I.RNA提取液（TRlzolRcageni），充分混勾，室温静置10min；入500uL三氯甲烷，充分混勾，军温静置10min，4%12000r/min离心10min，取上清（500L）于新的离心管（1.5ml）中，加入1.0ml.异丙醇，充分混勾，20%静置30min.4℃1200)r/min离心10min，小心弃上清，倒置于吸水纸t，室温白然风干。加人20μL无RNastlHz辫解流淀.瞬时离心.进行 cDNA合成或置于一70℃以下长期保行，若条件允诈.病毒总RNA还可用病点RNA提取试剂盒提取，6.4.5DNA合成
反应在20ul.体系中进行。取6.4.4制备的总RNA12.5L于光RVA酶的火菌离心管（1.5mL）中，加入1L反转录引物（0RF3RL）混勺.70℃保温10minF池速在冰上冷却2min，瞬时离心使模板RNA/引物混合液聚集于管底；然后，依次加人4nL5XM-MLV缓冲被1LdVTPs混个物（各1Cminol/L)0.5μLRNas:迎制剂,1.0uL反转录酶MMLV混匀12℃保温1h;最后.70℃保温15min后冰1:冷却.得到心DNA溶液·立即便用或置1一20℃保存6.4.6PCR反应
6.4.6.1反应体系(25uL)
2XEmeraldAmpMPCRMasterMix
模极(cl)NA)
无菌双蒸水加至
12. 5 μl.
PCR反应时.要设立阳性对照利空白对照：阳性对照模被为猪流行性腹病RF3坚因重组历4
粒，空白对照模板为提取的总RNA。6. 4. 6. 2PCR 反应程序
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94℃预变性min然后30个环（98℃变性105.55℃退火3℃s.72℃延仲5Cs）.最后72°延仲7 min.4℃保存，
6.4.7电泳
6.4.7. 1制胶
1头琼脂糖凝胶板的制备：将1g琼脂糖放入100ml.1×TAF电泳缓冲液中，微波炉加热融化。得温度降至垒60℃左右时，加人10mg/ml溴化之锭（FB)5ul均勾铺板，厚度为31m~5I1。6.4.7.2加样
PCR反应结束后，取5μJ.扩增产物（包括被检样品、阳性对照、空白对照）,5μLDL2C00 DVAMarker进行琼脂糖凝胶电泳。
6.4.7.3电泳条件
15C V 电泳 10 min~15 min。
6.4.7.4凝胶成像仪观察
反应产物电泳结束后，用凝胶成像仪规察检测结果、拍照、记录试验结架。6.4.8PCR结果判定
各被检样品在同一块凝胶板上电泳后，当IDNA分子质量标准，各组对照尚时成立时，被检样品电泳出现一条774lbp的条带，判为阳性（十）；被检样品电泳道没有出现大小为774hP>的条带，判为阴性（—）。缩果判定参见附录D图D.1，6.5血清中和试验
6.5.1仪器、材料与试剂
除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，水为符合（B/T6582规定的灭菌双蒸水或超纯水。微量移液器及配套吸头、96孔微晟平底反应板、二氧化碳培养箱或温箱、倒置显微镜、微量振荡器、小培养瓶等。Vcro细胞系病毒抗原和标准阴性血清.阳性血清、指示毒（毒价测定后立即小量分装，一30℃冻存，避免反复冻融，使用剂量为500TCID501000TCIDs）同头份的健康（或病初）血消和康复3周后的双份被检血消或单份而清。稀释液、细胞培养液、病毒培养液,HEPES液。6.5.2操作方法
用稀释液倍比稀释血清，每份血清加4孔，每孔50ul.再分别加50，l指示毒。经微量振荡器震荡1min~2min置于37℃中和1h。每孔加细胞悬液100μL（2×105个细胞/ml.~3×105个细胞/rmlL）微量板置于37℃、氧化碳培养箱或用胶带封口置于37℃温箱培养，72h～96h判定结果。设阴性对照、阳性对照，病毒对照和细胞对照，阴性而血消与待检血清同倍稀释.阳性血清做2-\稀释。6.5.3结果判定
当病毒抗原及阴性血清对照组均出现CPE，阳性血消及细胞对照组均无CPF时，试验成立、以能抑制50%以上细胞出现CPF的血清最高稀释度的倒数判定为该血清PED抗体效价的滴度，血消中和抗体效价18以上为阳性反应；1：4为疑似反应；小11：4为阴性反成。疑似邮清复检一欲·仍为叫疑时,则判为阴性。发病后3周以上的康复血清滴度是健康（或病初)血清滴度的4倍或以上-判为阴性反应。6.6间接ELISA
6. 6. 1仪器、材料与试剂
除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯.水为符合GB/T6682规定的灭菌双蒸水或超纯水，定量加液器、微量移液器及配套吸头、96孔或40孔聚乙烯微量反应板、酶标测试仪等。抗原和酶标抗体。磷酸盐缓冲液、包被稀释液、样品稀释液、酶标抗体稀释液、底物溶液及终止液。NY/T 544—2015
6.6.2操作方法
6.6.2.1冲洗包被板
向各孔注人无离子水.这泡3 min,甩下,重复3次。甩十孔内残液，在滤纸上啵十，6.6.2.2抗原包被
用包被稀释液稀释抗原至使用浓度包被量为每孔10℃uL.置于4℃冰箱湿盒内过夜，弃掉包被液，用冲洗澈洗3次.每次3min
6.6.2.3加被检及对照血清
将每份被检血清样品用血清稀释液做1：100稀释，加人两个孔，每孔100uL。每块反应板设阴性、阴性血清及稀释液对照各两孔.每孔100μL.盖好包被板置37℃湿盒内1h.冲洗尚6.6.2.2.6.6.2.4加酶标抗体
用酶标抗体稀释液将酶标抗体稀释至便而浓度.每孔加1C0mL.置于37℃湿盒内1i.冲洗同6. 6. 2. 2.
6.6.2.5加底物溶液
每孔加新配制的底物溶液10mL.在37%湿盒内反成5min-~1cmin，6.6.2.6终止反应
每孔加终止液50μl。
6.6.3结果判定
6.6.3.1目测法
阳性对照血清孔显鲜明的橘黄色，阴性对照血清孔无色或基本无色，被检血清孔凡显色者即判抗休阴性。
6.6.3.2比色法
用酶标测试仪，在波长492nm下.测定各孔（D值：附性对照血清的两孔平均（D值>0.6.阴性对照血清的两孔平均OD值≤0.162为止常反应，OD值0.200为阳性；(0D值为0.200～0.400时判为+\：0.400~-0.800判为\十十”，()D值0.800判为+十一\，0D值在0.163~~0.200之间为疑似；(OD值C.163为\一”。对疑似样品可复检一次，复检结果如仍为疑似范围，则布P/N比值.P/V比值2 判为阳性,P/N比值2 若判为阴性。7结果判定
只要实验室诊断中的任何：种方法的结果成立，即可判断该病为猪流行性腹泻心
附录A
(规范性附录）
溶液的配制
A.10.02mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)的配制-VY/T 544—2015
A1.10.2ml/L磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢钠N&HP(),·12H0)71.6g.先加适量无离-子水溶解，最后定容至100Cml..混匀。A.1.2(.2mol/1.磷酸二氢钠溶液：称取磷酸二钠（NaH2P0·12HO)31.21g，先加适量光离水溶解，最后定容至1000ml，混勾。A.1.3量取0.2nol/L磷酸氢二钠济液360mL，0,2mo1/L磷酸.氢钠溶液140ml.称取氯化钠38g.用无离子水溶解至稀释至500011L.4℃C保存，A.2细胞培养液的配制
含10%灭活特牛血清的1640营养液，加100IU//trL市霉素，100μg/mL链等素，用5.6%碳酸氧钠(NaTIC)调pH至7.2。如需换液，则而清含量为5。A.3病毒培养液的配制免费标准下载网bzxz
1640培养液中加下列成分，使最终浓度各达到：1%甲基亚砌(DMSO);
5μg/mL-~10pg/mL胰酶
1001U/mL青霉素；
100μg/mL链霉素；
以5.6%碳酸氢钠(NaH).)调节pH至7.2。A.4HEPES液的配制
称取C.2385gHEPES溶于100mL无离广水中，用1mol/L氢氧化钠NaCH)调节pH至7.0.~7.2.过滤后置4℃备用。
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0.1%伊文斯蓝原液的配制
附录B
【规范性附录]
直接荧光抗体法溶液的配制
称取伊文斯蓝0.1g溶于10CmL0.02mol/LpH7.2的PBS中，4C保存，使用时.稀释成0.02%的浓度。
磷酸盐缓冲甘油的配制
量取丙三醇90tL.0.02mo1/LpH7.2的PBS10mL振荡混合均每即成，4℃保存。8
C.1洗液的配制
附录C
（规范性附录】
双抗体夹心ELISA溶液的配制
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量取50μl.吐温-20,加人100mL0.02uol/LpH7.2麟酸盐缓冲液（见A.1)4，C.2包被稀释液的配制
C.2.1.0.1mol/LPH9.5碳酸盐缓冲液：0.1mol/t.碳酸钠液：称取碳酸钠10.6g，加无离子水至1000mL0.1Tmol/1.碳酸氢钠液：称取嵌酸氢钠8.4g加无离子水至100CmLC.2.2量取0.1mol/L碳酸钠液200ml0.1mol/1.碳酸氢钠液700ml..混合即成。C.3样品稀释液的配制
加0.05必吐温-20.1%明胶的0.02101/1.PH7.2磷酸盐缓冲液，C.4酶标抗体稀释液的配制
加0.15%吐温-2C,1%明胶及5%灭活筷牛血清的0.02mo1/LpH7.2磷酸盐缓冲液。C.5底物溶液的配制
pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液（内含0.04%邻苯二胺及0.015%过氧化氢）。rl15.0磷酸盐柠檬酸缓冲液：称取柠檬酸21.0l片，加无离子水1000mI.量取24.3ml.与0.21mol/L磷酸氢钠液（见A.1.1)257mL混合，4℃C冰箱中保存不超过1周。称取4Cmg邻苯二胺，溶于1000ml.pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液中（用前从4冰箱中取出，在室温下放置20min-~30min）。待溶解后，加入150μL过氧化氢，根据试验需要量可按此比例增减。C.6终止液的配制
2mol/I.硫酸，并取浓硫酸4mI.加人32ml.无离子水中混勺。NY/T544—2015
D.1TAE电泳缓冲液（pH8.5)的配制50XTAE电泳缓冲储存液：
三羟甲基氨基甲烷(Tris碱）
乙胺四乙酸二钠(NaEDTA)
双蒸水
附录D
（资料性附录）
RT-PCR
待上述混合物完全溶解后，加入57.1mL的醋酸充分搅拌溶解.加双蒸水至1L后，置于室温保存。应用前，用双蒸水将50XTAE电泳级冲液50倍稀释。D.2样品检测结果判定图
见图D.1。
1000bp
500 bp
250 bp
100 hp
说明：
DL200C DNAMarker;
阳性对照；
阴性对照；
样品检测结果
3.5.6——阳性样品；
—阴性样品。
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