NY/T 548-2015 猪传染性胃肠炎诊断技术 NY/T548-2015 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

ICS11.220
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 548—2015
代替NY/T548—2002
猪传染性胃肠炎诊断技术
Diagnostic technigues for transmissible gastroenteritis2015-05-21发布
2015-08-01实施
中华人民共和国农业部
本标准按照GB/T1.1—2009给出的舰则起草本标准代替NY/T5482002猪传染性催肠炎诊断技术。本标准与NY/T 54820C2相比.病原检测部分增加了RT-PCR检测方法本标准由中华人民共和国农业部提出本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨养医研究所。本标准主要起草人：冯力、陈建飞、时洪艳、张本标准的历次版本发布情况为：—NY/T548—2002。
NY/T 548--2015
1范围
猪传染性胃肠炎诊断技术
NY/T548—2015
本标准规定了猪传染性胃肠炎的病原学检测和而清学检测，病原学检测包拓病毒分离鉴定、百接免疫荧光法双抗体夹心酶联免疫吸附试验和反转录一聚合酶链式反应，血清学检测包括血清中和试验和间接酶联免疫吸附试验。
本标准适用丁对猪传染性胃肠炎的诊断、产地检疫及流行病学调查等：2规范性引用文件
下列文件对于本文件的成而是必不可少的。凡是注日期的引用义件，仅注日期的版本适川」本文件。凡是不注日期的引旧文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本义件。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB19489实验室生物安个通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
猪传染性胃肠炎transmissiblegastroenteritis，TGE猪传染性胃肠炎是由尼多目（Nidoirules）、冠状病毒科（Coronauiridae）、α-冠状病毒属的猪传染性用肠炎病毒（transmissiblegastroenteritisuirus，TGFV）引起的猪的一种急性、高度接触传梁性的肠道疾病,以呕吐、水样腹泻、脱水和10 日龄以内仔猪的高死广率为主要特征，4缩略语
下列缩略语适用于本文件，
CPE:cytopathic effect细胞病变作用。DLA：directImmunolluorescenceassay直接免疫荧光法ELISA:enzyme-linked immunosorbenl assay酶联免疫吸附试验。PBS:phosphatebulferedsaline磷酸盐缀冲液。PRCV：porcincrcspiraiorycoronavirus猪呼吸道冠状病毒TGE：transmissiblegastrventeritis猪传染性胃畅炎。RT-PCR：reversctranscriptian-polymcrasechainIeaction反转录一聚合酶链式反应5临床诊断
5.1流行特点
TGE的发生和流行有暴发流行、地方流行和周期性地方流行3种形式。若感染TGEV的变异株PRCV.则会出现不同的流行模式，从而使TGFV的流行更加复杂化。本病一年四季均可发生，-般多发生在冬季和春季，有时也发牛于夏季，秋季，各种年龄的猪均可感染，尤其是10日龄以内的哺乳仔猪，发病率和死亡率可高达100%。病猪带毒猪和隐性感染猪是本病的主要传染源。病毒通过粪1
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途轻，气熔胶或感染母猪的乳汁进行传播，5.2临床症状
本病的潜伏期较短,通常为18 l1至3d。感柒发生后，传播迅速,2. l~3 l可波及整个猪群。临床表现因猪龄大小而异.新牛存猪的典型症状呕吐、水样腹、脱水、体重迅速下降.导致新生仔猪高发病率和高死亡率。腹泻严重的仔猪，常出现未消化的乳凝块。粪便腺與，病程短,症状出现后2 -7死亡，泌乳时猪发病，则一过性体温升高,呕吐、腹泻,厌食,无乳或泌乳量急刷减少，小猪得不到足够乳汁.进一步抑剧病情，营养严重失调，增加广小猪的病死率，3周喰猪，王长期猪和出栏期绪感染时设表现携食，腹鹅程度较轻，扑续期相对较短，偶尔拌有呕吐，极少发牛死亡。5.3病理变化
TCEV引起的腹泻，尽管疗状很严重，促是病理变化较轻微，肉眼可见的病理变化常局限于消化道，特别是胃和小肠。胃澎胀，胃内充满凝乳块：胃黏膜充血或出血，胃大弯部黏膜淤而。小肠壁弛缓·膨满.肠壁非薄望平透明。小肠内容物呈黄色、透明范沫状的液体含有凝乳块。空肠黏膜可见肠绒萎缩，埔乳仔猪肠系膜淋巴智的乳糜管消失：组织学变化主要以空肠为主，从胃牟直肠是广范围的渗出性卡他性炎症变化。其特征是肠绒毛萎缩变短回肠变化稍轻微。小肠变化有较明显的年龄特征，新生猪变化严重，电子显微镜观察，可见小肠上皮细跑的微绒毛，线粒体，内质网以及其他细膜质内的成分变性。在细跑质空泡内有病毒粒存在。
6实验室诊断
6.1仪器、材料与试剂
除特别说明以外，本标准所用试剂购为分析纯，水为符台C13/T6682规定的灭菌双然水或超纯水。
倒置显微镜，冷冻离心机.微孔滤膜，滤器、细胞培养瓶，盖玻片.温箱，荧光显微镜、冷冻切片机、载玻乃、滴管、定量加液器、微量吸液器及配套吸头、96孔或40孔聚乙烯微量反应板、单通道、8通道微量吸液器及配套吸头、二氧化磁培养箱.微量振荡器及小培养瓶，酶标检测仪等。仔肾原代细胞或PK15、ST纫胞系。荧光抗体（FA）,猪抗IE-Ig及猪抗TEIgGHRP.病毒抗原和标推阴性而清、性缸清.抗原和酶标抗体，磷酸盐缓冲液(PBS)、细胞培养液、病毒培养液、HFPFS液、U.I%伊文斯蓝原液、磷酸盐缓冲甘油、吸液、包被稀释液、样品稀释液、酶标抗体稀释液、底物溶液、终止液（配制方法见附录4）
6.2病毒分离鉴定
6.2.1病料处理
将采集的小段空肠剪碎及肠内容物或类便用含10000IU/ml,青霉素，l0C00pg/tnL链需素的磷酸盐缓冲液（PBS)(见A.1)制成5倍悬液，在4℃条件下3c00r/min离心30tmiz，取上清液，经0.22μm微孔滤膜过滤：分装，20℃保存备用，6.2.2接种及观察
将过滤液（病毒培养液的10%）接种细胞单层上，37℃吸附1h后补加病毒培养液，逐口观察细胞病变(CPE)，连续3d~4d-按（PE变化情况可言传2代-3代。6.2.3病毒鉴定
CPE变化的特点：细胞颗粒增多，阅缩：呈小堆状或葡萄串样均匀分布，细胞破损，脱落。对不同细胞培养物，（IPE可能有些差异。分离病毒几细胞瓶中加盖玻片培养，收毒时取山盖玻片（包括接毒与不接毒对照片)用直接荧光法做鉴定。鉴定方法和结果判定见6.3，6.3直接免疫荧光法
6.3.1样品
组织样本：从急性病例采取空肠(中段)戒肠系膜淋巴结6.3.2操作方法
6.3.2.1标本片的制备
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将组织样本制或4uI1~7um冰冻划片。或将组纠\\样本制成涂片：肠系膜淋巴结用横断面涂抹片；空肠则刮取黏膜面做压片。标本片制好后风十。于内酮中固定15min。再置于PBS中没泡10min-15 min.风于
细胞培养益玻片：将分离毒细胞培养24h~48h的盖玻片及阳性、阴性对照片在PBS中冲洗3次，风十。于内酮中固定15min，冉置于PRS中浸泡10min~15trin，风千。6.3.2.2染色
用0.02%文思蓝溶液（见A.5）将FA稀释至工作浓度（1：8以上合格）。1000r/min离心10min，取上清液滴于标木上，37℃恒温恒湿染色30min，取出后用PBS冲洗3次，依饮为3min，4nin和5min，风+。
6.3.2.3封固
滴加磷酸盐缓冲H洲（见A.6）.用盖玻片过固。尽快做荧光显微镜检查。如当月检查不完则将荧光片置于1℃冰箱中.不超过18h内检查。6.3.3结果判定
被检标本的细胞结构应完整清晰，并在阳性、阴性对照均成立时判定。细胞核暗黑色、胞浆呈苹果绿色判为阳性;所有细胞浆中无特异性荧光判定为阴性。按荧光强度划为1级：
a）十++十：胞浆内时见闪亮苹果绿色荧光；b）+十十：胞浆内为明亮的苹果绿色荧光；c）十十：胞浆内呈一般苹果绿色荧光：d）跑浆内可见微弱荧光，伯清晰町见，凡出现a）~l)不同强度荧光者均判定为阳性。当无特异性荧光.细胞浆被伊文斯蓝染成红色.胞核黑红色者判为阴性。
6.4双抗体夹心ELISA
6.4.1材料准备
6.4.1.1洗液、包被稀释液、样品稀释液酶标抗体稀释液、底物溶液、终止液配制方法见附录A。6.4.1.2待检样品：取发病仔猪粪便或仔猪肠内容物.用浓盐水1：5稀释，3000r/min离心20mim取上清液，分装，·20℃保存备用。6.4.2操作方法
6.4.2.1冲洗包被板
向各孔注入洗液（见A7)，浸泡3min，甩干，注人洗液，重复3次。甩去孔内残液，在滤纸上吸于。
6.4.2.2包被抗体
用包被稀释液（见A.8)稀释猪抗TGE-1gG全使用倍数.每孔加100p1.置丁4℃过夜.弃液.冲洗同6.4.2.1.
6.4.2.3加样品
将制备的被检样品而样品稀释液（见人.9)做5倍稀释.加入两个孔，每孔100I。每块反应板设阴性抗原.阳性抗原及稀释液对照各两孔，置于37%作用2h，弃样品，冲液，冲洗同6.4.2.1。3
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6.4.2.4加酶标记抗体
每孔加10CμI.经酶标抗休稀释液（见A.1C)稀释至使用浓度的猪抗IGElgG-HRP.置于37℃2 h.冲洗 6.4.2. 1。
6.4.2.5加底物溶液
每孔加新配制的底物辫澈（见A.11)100ul置于373min，6.4.2.6终止反应
每孔终止液（见A.12)50μL，置于室温15min6.4.3结果判定
用酶标测试仪在波长492nm1，测定吸光度(0D)值。阳性抗原对照两孔平均OI)值>0.8（参考值）.阴性抗原对照两孔平均（L值≤C.2为正常反应：按以下两个条件判定结果：P/N(被检抗原OI值/标阴性抗原（山值)值2.Ⅱ被检抗原两孔平均（江)值学2判为阳性；否则为阴性，如其中：个条件稍低十判定标准：川复捡一次，最后仍按照两个条件判定结果6.5 RT-1CR
6.5.1仪器、材料与试剂
PCR扩增仪、1.5mL离心管、0.2mLICR反应管、电热恒温水槽、台式高速低温离心机,电泳仪微量移液器及配套吸头、微波炉.紫外凝胶成像仪、冰箱。TRIzu间试剂、核糖核酸酶（RVase）抑制剂(10 U/μmL).反转录酶(MMLV)）（200 U/μL),dNTPs 混合物（各 10 mM).无 RNase dH,0.EmeraldAmpTM PCR Mastcr Mix（2X),DI2000 DNAMarker.10×或6× DNA 上样缓冲液、PRS(配制方法见附录A）、TAE电泳缓冲液（配制方法见附录B).氯甲烷、异丙醇、二羟甲基氢基甲烷（Tris碱）、琼脂糖、乙“胺四乙酸钠(Na?EDTA）、冰乙酸.氯化钠、溴化乙键、火菌双蒸水。6.5.2引物
6.5.2.1反转录引物(F,)
5- TTAGTTCAAACAAGGAGT - 3':
引物购存浓度为10mol/1..使用时终浓度为500pmol/16.5.2.2PCR反应引物
FIL游引物):5'-ATAIGCAGTAGAAGACAAT-3:F2(下游|物):5'-TTAGTTCAAACAAGGAGT- 3 引物贮存浓度为10μno1/ 1.,使用时终浓度为20pmnl/16.5.3样品制备
将小肠内容物或粪便与灭菌PBS按1：5的重量体积比制成悬液.在涡混合器上混勾后4C5 000 1/inin离心10 min,取上清液于无RVA酶的灭荫离心管中,备用。制备的样品在1 保存时不应超过24.长期保存应分装成小管.置十一70℃以下，避免反复冻融。6.5.4病毒总RNA提取
取6..3制备的待检样品1清30C L十无RNA酶的火菌离心管（1.5m)中，加人500.RVA提取液（TR1zulReagent），充分混勺，室温静置lomin;加人500μ三氯甲烷，充分混匀，牵温静置!0Imin.4℃ 12c00 r/min离心l0 nin.取」清(500 μl)丁新的离心管(l.5mI)中,加人1.CmI. 异丙醇,充分混勾，一20℃静置30 min.4℃:12(c0 r/min离心10 min。小心弃f.清，倒置于破水纸上，率温自然风于。加入20α.无RNas:dH0溶解沉淀，瞬时离心·进行cl)NA合成或置一70℃以下长期保存，若条件充许，病毒,总RVA还可用病毒RNA提取试刹盒提胶。6.5.5cDNA合成
反成在20μI,体系中进行。取6. 5.4制备的总RNA12.5L于无RNA酶的灭菌离心管(1.5ml）中，加人1ul.反转录引物(F2)混匀.7CC保温10min后迅速在冰上冷却2tmi，瞬时离心使模板RVA/4
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引物混合液聚集于管底，然后，依次加入1ul.5×MMLV缓冲液、1nLdNPs混合物（各10mM）、0.5μLRVase抑制剂.1.0μuL反转录酶M-MI.V混匀.42℃保温1h：最后70℃保温15min后冰上冷却,得到 cDNA济液，立即使用或置于20℃保存。6.5.6PCR反应
6. 5. 6. 1反应体系(25 μL)
2XFmeraldAmpTil PCR Master MixF1
模板（eIDNA)
无菌双蒸水加至
12.5 μuL
0. C5 μL
0.05 μl.
PCR反应时,要设立阳性对照和空白对照。阳性对照模板为猪传染性胃肠炎病毒)RF3 基内重组质粒,空白对照模板为提取的总RNA。6.5.6.2PCR反应程序
91预变性5min，然后30个循坏（98℃变性10、55℃退火30s、72℃延仲84s）.最后72℃延7min,4保存。
6.5.7电泳
6.5.7.1制胶
1%琼脂糖凝胶板的制备：将1g琼脂糖放人100ml.1×TAE电泳缓冲液中,微波加热融化，衬温度降至60℃左右时，加人10mg/mL溴化乙锭（EB)l，均句铺板，厚度为3mm~5mm6.5.7.2加样
PCR反成结束后.取5μL扩增产物（包括被检样品、阳性对照、空白对照）、5 μL DL2 00!DNAMarkcr进行琼脂糖凝胶电泳。
6.5.7.3电泳条件
150V电泳10rrin~15min
6.5.7.4凝胶成像仪观察
反应产物电泳结束后，用凝胶成像仪观察检测结果、拍照、记录试验结果。6.5.8结果判定
在同一块凝胶板上电泳后，半DNA分子质量标准、各组对照同时成立时，被检样品电泳道出现条1400bp的条带,判为阳性（十）：被检样品电泳道没有出现大小为1400bp的条带，判为阴性（一）。结果判定见附录C
6.6血清中和试验
6.6.1指示病毒
指示病毒毒价测定后立即小量分装，置于一30℃冻存，避免反复冻融，使用剂量为500TC1Dm1000TCI
6.6.2样品
被检血清·问一动物的健康血清（或病初)血清和康复3周后血清(双份），被单份血清也可以进行检测.被检样品需56C灭活30mine
6. 6.3溶液配制
稀释液、细胞培养液、病毒培养液、HEPES液，配制方法见附录A6.6. 4 操作方法
6. 6. 4. 1 常量法
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川稀释液倍比税释血清，与稀释至L作浓度的指示每等量混合，置于37℃感作1h（中问摇动2次）。选择长满单层的细胞瓶，每份样品接4个培养瓶-再置十37℃吸附1h（中间摇动2钦），取山后，加病毒培养液.置丁37℃C温箱培养，逐月观察细胞病变（CPE)72h-~96h最终判定，每批对照设标准阴性血清对照、阳性血清对照，病毒抗原和细胞对照各2施，均加丁作浓度指示毒.阴性血清、阳性血清做2'稀释。
6.6.4.2微量法
用稀释液倍比稀释血清，每个稀释度加4孔，每孔50uL.再分别加人50μL工作浓度指小毒，经微量拆荡器振荡1i~2min.胃于37℃:中和1h后，每孔加人细胞悬lc0μI(1.5×10°个细胞/ml.~~2.0×10个纵胞/mL），微量板置厂37℃二氧化碳培养箱，或用胶带封口置37℃温箱培养，72h-~96判定结果，对照组设置同常量法。6.6.5结果判定
在对照系统成立时（病毒抗原及阴性血清对照组均出现（PE，阳性血清及细胞对照组均无CPE)，以能保护半数接种细胞不山现细胞病变的血清稀释度作为终点，并以抑制细胞病变的最高血消稀释度的倒数来表示中和抗体滴度。
发病后3固以上的复血消滴度是健康（或病初）血清滴度的4倍，或单份血清的中和抗体滴度达18或以上，均判为阳性。
6.7间接ELISA
6.7.1操作方法
6.7.1.1冲洗包被板
向各孔注入无离子水，浸泡3min.再注人洗液（见A.7），重复3次。甩下孔内残液，在滤纸上吸干。6.7.1.2抗原包被此内容来自标准下载网
用包被稀释液（见A.8）稀释抗原至使用浓度，包被量为每孔1001置于4℃冰箱湿盒内21h.掉包被液，用洗液冲洗3次，每次3min。6.7.1.3加被检及对照血清
将每份被检而清样品用血清稀释液（见A.12)做1：100稀释，加人2个孔，每个孔10)L。符块反应板设阳性血清、阴性血清及稀释液对照各2孔.每孔100，1.盖好包被板置于37湿盒内11，冲洗同G. 7. 1. 2。
6.7.1.4加酶标抗体
酶标抗体稀释液(见A.1C)将酶标抗体稀释充使用浓度，每孔加100μl.,置下37℃湿盒内1h,冲洗同 6. 7. 1. 2.
6.7.1.5加底物溶液
每孔加新配制的底物溶液100nL,在37℃褪盒内反应5min～10min，6.7.1.6终止反应
每孔加终止液50μl
6.7.2结果判定
6.7.2.1目测法
阳性对照而清孔呈鲜明的橘黄色·阴性对照血清孔无色或基本先色。被检而清孔凡显色者即判抗体阴性，
6.7.2.2比色法
用酶标测试仪,作波长492m下.测定务孔Q)值。阳性对照血清的两孔平均0D值>0.7参考值），阴性对照血清的两孔平均（)D值≤0.183为正常反应。OD值≥0.2为阳性；D值<0.183时为阴性：(值在0.183~0.2之间为疑似，对疑似样品可复检次如仍为疑似范，则右P/N比值：P/N6
比值2判为阳性,P/N比值2者判为阿性结果判定
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只要实验室诊断中的任何一种方法的结果成，即可判断该病为猪传染性肠炎。7
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附录A
（规范性附录）
溶液的配制
A.10.02mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)的配制A.1. 10.2 mol/L磷酸氟二钠溶液磷酸氢二钠(NaHPO：12Hz())71.64g.无离厂水加至1000nL。A.1.20.2 mol/L磷酸二氢钠溶液磷酸二氢钠(NaH,P()-2H,O)31.21g,无离子水加全1C00ml.A. 1. 30. 2 mL/ L 磷酸氢二钠溶液 360 mL0.2mol/l磷酸二氢钠溶液140ml氯化钠38g无离了加至5000mL。1℃保存A.2细胞培养液的配制
含10%灭活楼牛而清的1G40常养液，加100IL:/mL肯霉素及100μg/mL链霉索，用5.6%碳酸氢钠(NaH).)调H至7.2。如需换液.则血清含量为5%。A.3病毒培养液的配制
1640培养液中加下列成分，便最终浓度各达到：1%HEPES.1%二甲基业磁（IMSO），5g/ml.~10ug/ml.\\酶（原代肾细胞为）5ug/ml.100IU/mL青霉索、100ug/1mL链霉素，以5.6%碳酸氢钠(NaHCO,)谢至pH7. 2.
A. 4 HEPES 液的配制
称取0.2385gHEPFS溶于100mL无离子水中，用1mol/L氢氧化钠(NaOH)调整pH垒7.0~7.2，过滤后置于4℃备用
4.50.1%伊文斯蓝原液的配制
称取伊文斯蓝0.1g溶于100ml.,0.02mo1/L.pH7.2PBS中,4℃保存。使用时，稀释成0.02%浓度。
A.6磷酸盐缓冲甘油的配制
量取丙三醇90ml.,0.02mol/LpH7.2PBS1CmL，振荡混合均匀邸或、1℃保存A.7洗液的配制
量取5)l.温一2，人1G0ml.C.02mal/LH7.2磷酸盐缓冲液（见A.1)中。A.8包被稀释液的配制
A.8.10.1mol/1.碳酸钠液：称取碳酸钠10.6g-加光离子水至10c0ml，A.8.20.111ol/碳酸氯钠液：称取碳酸氢钠8.1，加无离子水室1000mL.8
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A.8.3量取0.1.11o1/1.碳酸钠液200tmL.0.1mol/L碳酸氢钠液700ml.,混合即成。A.9样品稀释液的配制
加0.05%叫温一20及1%明胶的.02mo1/LpH7.2磷酸盐缓冲液、A.10酶标抗体稀释液的配制
加0.05%叫温一20，1%明胶及5%灭活牛血消的0.02ml/1.pH7.2磷酸盐级冲液。A11底物溶液的配制
A,11.1pH5.0磷酸盘一柠檬酸缓冲液：称取柠檬酸21.01H-加元离子水至1000ml.,量取243mI.与0.2IIol/I.磷酸氢二钠液（见A.1)257mL混合，十4℃冰箱中保存不超过1周。A.11.2称取40mg邻苯二胺，溶十100ml.pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液（而前.从4℃冰箱中取山l在室温下放置20min-~30min），待溶解后-加人150μl过氧化氢，根据试验需要量可按比例增减。A.12终止液的配制
2mol/I硫酸-量取浓硫酸4ml.人32ml.无离子水中混NY/T548—2015
50XTAE电泳缓冲储存液：
二胫甲基氨基烷(1ri碱）
（规范性附录
TAE电泳缓冲液(pII约8.5)的配制242号
Z二胺四乙酸二(Na EDTA)
双蒸水
待上述混合物完全济解后，加人57.1mL的醋酸充分搅拌溶解，加双蒸水至1L.后，置于室温下保存。
应用前,用双蒸水将50XTAE电泳缓冲液50倍释。10
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