NY/T 562-2015
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NY/T 562-2015 动物衣原体病诊断技术
NY/T562-2015
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标准内容
1CS11.220
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 562—2015
代替NY/T562—2002
动物衣原体病诊断技术
Diagnostic techniques for animal chlamydiosis2015-05-21发布
2015-08-01实施
中华人民共和国农业部
本标准按照CB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准代替NY/T562—2002《动物衣原体病诊断技术》。NY/T 562—2015
本标准与NY/T562200)2相比.病原检测部分增加了血游学诊断技术和PCR诊断技术，本标准出中华人民共和国农业部提出本标准由全国动物防疫标推化技术委员会（SAC/TC181)归I本标准起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所。本标准主要起草人：周继章、曹小安、宫晓炜、陈启伟、郑福英、李兆才、邱吕庆、殷宏。本标准的历次版本发布情况为：-NY/T562—2002.
1范围
动物衣原体病诊断技术
NY/T562—2015
本标准规定了动物衣原体鸡胚分离·与传代培养技术、血清学诊断技术及PCR诊断技术。本标准适用于实验室动物衣原体的分离、传代培养和动物衣原体病的诊断，其中，血清学百接补体结合试验（DireciCounplementFixatiunTcst.DCF)适用于哺乳动物（猪除外）和鹦鹉、（7岁以上老龄除外）衣原体病的诊断间接补体结合试验（IndirectComplementFixationTes1,ICF)）适用丁禽类（鸡、除外，但包括老龄鸽）和猪衣原体病的诊断；问接血凝试验（lndirectHemigglutinaticnTest，IIlA)适用扩动物衣原体病的产地检疫、疫情监测和流行病学调查；R诊断技术适用于牛、羊、猪和离衣原体病的诊断。
2术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
工作量抗原workload antigen
能发生完全反成的抗原量的单位，能与最高稀释度的血清呈现完全抑制济血反应的最高抗原稀释度即为1个工作量抗原的效价。
指示血清 serum direcled
与该抗原相应的哺乳动物抗血清。试验中测定的最高的标准清稀释度即为1个工作量指示血清的效价。
补体结合试验camplement lixation test,CE抗体与抗源反应形成复合物，通过激活补体而介导溶血反应，可作为反应强度的指示系统。以征多用十病毒学检测。
间接血凝试验indirect bcnagqlutination test,JHA将抗原（或抗体)包被十红细胞表面，成为致敏的载体，然后与相的抗体（或抗原）结合，从前使红细胞拉聚在起出现可见的凝集反应。3“动物衣原体的分离与培养
3.1试验材料
似或确定为衣原体感染的样本、鸡胚、孵化箱、无菌操作问、生物安全柜、冰箱、照蛋设备、鸡胚气室开孔器、注射器、6号针头、离心机、碘厂、70酒精、链霉素、卡那霉素、生理盐水等。3.2材料要求
3.2.1样本采集
采集的样本应无杂菌污染，包括肝脏、脾脏、流产胎儿胃液、胎衣、流产分泌物等.其中流产胎儿的胃腋为百选样本。样品进行涂片姬姆萨染色（见附录A），油镜下观察疑似有衣原体染色颗粒（原生小体，EB)为紫红色，大小0.2m~0.6μm:网状体(RB)为蓝黑色.直径为0.6μm～1.8um。样本在室外或NY/T562—2015
常温条件下放置时间不应超过72h，采集的样本应尽快放置于一20℃冰箱备用。如需较长时问保存，励置于一80℃超低温冰箱。
3.2.2鸡胚要求
分离培养衣原体用的鸡胚最好为SPF受精鸡蛋孵育，或者受精鸡蛋至少应水白无衣原体抗体目不便用氨下抗牛，叫环索奖抗生素请抗菌抗辆毒笑约物的康鸡群3.2.3环境要求
衣原体的分离培养成在实验室内进行·少最的接种分离培养在生物安全柜内换作即可。如果接秤鸡胚的数量较人，生物安全柜不能满足要求，应在无菌操作间内逊行。鸡肝接种前所均在孵化箱内孵育，保证相对稳定的发育温度和湿度，3.3试验方法
3.3.1样本的处理
将镜检发现疑似衣原体颗粒，或确定为衣原体无杂菌污染的液体样本用火菌生理盐水1：4稀释，果是纠织等样本，按体积大小用灭菌生理盐水1：4稀释后进行研磨被碎处理，30001/min离心20 min,在 4℃冰箱中稳定1 h左有备用。对疑似污染的样本研糜粉碎后,川含链霉素(1 mg/ml.)和卡那霉素（1mg/mL)的生理水1：4稀释，3000r/min离心20min.取具上清液以4000r/imin~-6(000r/min再离心,取上清液1C冰箱稳定1h片右备用。3.3.2鸡胚的准备
试验前7将众离而的受精鸡蛋戒人孵化箱孵膏。弃去试大过小被壳、软壳、畸形壳蛋等，地成7日龄发育的鸡胚。接种前1d,成弃去发育不良及死亡胚休,选择发育良好的鸡胚，划定气及标记发育体的位置以备而，
3.3.3鸡胚的接种
用碘配消母气室部位、开孔.孔大小以注射用针头进人为宜.接种深度为1.5cm～2.0cm。每个鸡胚无菌操作接种0.4mI上述处理好的样本丁卵黄囊内：蜡封蛋壳针孔，置于37℃~38.5℃孵化箱内孵育。
3.3.4鸡胚卵黄囊膜的收集
弃去接种后72h内死亡的鸡胚，收集接种后4d10d内死广鸡胚卵黄囊膜继续传代，直至接种鸡胚规律性死亡（即接种后4～？内死亡），初次接种分离时.接种后10内未死亡鸡压，收集第10d米死亡鸡胚卵黄囊膜，涂片姬姆萨染色。显微镜下观察疑似有衣原体染色颗粒，应将该卵黄囊膜继续传代3代～4次，直至出现规律性死亡为止。继续传代时-将收集的鸡胚卵黄囊膜研磨破碎处理，加人生理盐水稀释（1个卵黄囊膜加人4ml.牛唑盐水）后.30c0r/min离心20min在4℃冰箱中稳定1h左右后，接种？目龄发育良好的鸡胚传代。3.4结果判定
初次分离时，传代鸡胚在接种后4~7山内出现规律性死亡，可初步判定为衣原体感染，进步的确认需要迹行细菌学检测和PCR鉴定。初次接种分离时·接种后10d内末死广鸡斯、取卵黄囊膜涂片染色，显微镜观察疑似有衣原体染色颗粒，成继续使用鸡胚传代3饮~~1次，仍然不死L月显微镜格查未发现疑似衣原体颗粒者，叮判为衣原体感染阴性。4动物衣原体病的PCR诊断
4.1试验材料
4.1.1仪器
PCR反应仪、低温高速离心机、稳压稳流电仪、紫外凝胶成像仪：4.1.2试剂
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TEbulfcr、ProteiriaseK、溶菌酶、TaqDNA聚合酶、SDS、饱和酚、无水乙醇、酚：氯仿+异戈醇（25：21：1）、琼脂糖等，
4.1.3引物
登录Genbarak，下载相关的基因序列.设计合成了2对引物。第对引物：
MP1: 5'- ATGAAAAAACTTTGAAATCGG - 3';MP2:5'-TTAGAATCTGAAITGAGCATTCAT-3'。第对引物：
MP3:5'-CAGGATACTACGGAGATTATGTTT-3':MP4:5'-GATTAGATTGAGGTATTGGAA - 3 。4.2方法
4.2.1衣原体基因组INA的提取
取新鲜或冰冻组织块或鸡胚卵黄膜0.3cm0.5cm，剪痒、研磨。加入400TE缓冲液，转人到1.5mI.的Eppcndorl管中。以10oμL的TE缓冲液冲洗句浆器，冲洗液一并转人Eppcndorf管中加人100uI.20%的SDS（终浓度1%），混勺；加人Pruteinase至终浓度为200u/μI，混匀后G0作刀30min。振摇混勾后转人37℃水浴2h，期问振册数次。加人溶菌酶30L.置于65℃水溶30min取山置沸水浴中5min。加入等体积的饱和酚，倒转混句，4℃7500r/min离心10min.取层水相，重复操作次；加人等体积的酚：氛仿：异戊醇（25：24：1），颠倒摇匀2次~3次，4℃:7500r/m1in离心10min，转移上消液十另一离心答中，加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，一20℃沉淀30min，12000r/ui离心10min.充么所有液机。用1mL70%乙醇漂洗2次～3次，每次12000r/min离心2min。真空或室温干燥I3NA沉淀物用25μuI.尤菌双蒸水溶解，保存在-20℃备用。4.2.2PCR反应体系及条件
4.2.2.1推荐使用反应体系
第一次 PCR扩增：
l0×PCRbuffert含Mg\-)
MPI和MP2引物
模板（被检样本总DNA）
无菌双蒸水
Taq DNA聚合酶
第次 PCR扩增：
10XPCR huffcr(含 Mg+)
MP3 和 MP4引物
模板(--扩产物)
无菌双蒸水
TaDVA聚合酶
34. 75 μuL
0. 25 μL
36. 75 μl.
样本检测时.同附要设阴性对照和空白对照。阳性对照模板为衣原体MOMP基内阳性质粒，空白对照为双热水，其他体系成分不变。如果是采用其他更好的反应体系时.可根据具体情况调整体系。4.2.2.2反应条件
一扩：首先95充分变性5min；然后35个循坏，分别为94℃变性1min，52.5℃退火1min.72℃延伸2 min;最后72℃延仲 10 min。3
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二扩:35个循环，分别为94~变性305.51.6℃退火1min,72℃延伸2min;最片72℃延伸10min4.3电泳
4.3.1制板
取1g琼脂糖加入10CmL电泳缓冲液.摇匀，加热济化后制作1%琼脂糖凝胶板。4.3.2加样
PCR皮成结束.取二次扩增产物各5uL(包括被检样木、阳性对照、空白对照）.DL2000DNA分子质量标准5uL近行琼脂镛凝胶电深，4.3.3电泳条件
小心地移去梳子将凝胶放人电泳槽。加人电泳缓冲液，使液面高出凝胶表面］mm~2mn。如加样孔内有气泡，应尽量用吸管吸出。用微量移液器将样木与上样缓冲液按1：5混合·加人孔内使沉人孔底;80V~-100V恒压电泳.使NA向阳极方向移动。4.3.4凝胶成像仪观察
扩增产物电泳结束后，丽凝胶成像仪观察检测结果.拍照-记录试验结果。4.4结果判断举例
4.4.1判定说明
将护增产物电泳后用凝胶成像仪观察，DNA分子质最标准、阳性对照.空白对照为如下结果时试验方成立，否则应重新试验。DL2000DNA分子质量标准(Marker）电泳道从上到下依次出现2000bp1000bp、750bp、500bp、250bp.100bp6条清晰的条带。阳性对照二扩产物约为480bp大小清晰的条带。在样本检测时，大多·扩反应因扩增产物量小而难以看见电泳条带。若一扩产物出现大小约1170 bp的条带，叫直接判定为附性。空对照电泳道不出现任何条带。4.4.2样本结果判定
在同：-块凝胶板工电泳后，当I)NA分子质量标准，各组对照同时成立时：被检样本一扩产物电泳出现;大小约 1170 bp的条带,可直接判定为阳性(+）;若一反成产物电泳没有约 1170 bp条带，扩反应产物电泳出现一条480bp的条带，判为阳性（十）。被检样本一扩反成产物电泳没有约1170bp的条带，-护反应产物电泳没有出现大小为180bp的条带，判为阴性（-）。结果判定示意图见附录B。5动物衣原体病血清学诊断技术
5.1补体结合试验(CF）
5.1.1材料准备
5. 1. 1. 1 器材
12mm×37mm试管、试管架.水浴箱、U型96（8×12)孔微量滴定板、f.理盐水。5. 1. 1.2补体
商品补体，按说明书使用和保存，试验前对供试补体需经补体效价滴定，补体效价滴定方法见附录（。5.1.1.3溶血素
试验前对供试溶血索需经效价滴定，溶血素效价滴定见附录D，5.1.1.41%绵羊红细胞悬液
制备方法见附录上,嫩化红细胞制备见（.2，5.1.1.5被检血清
应无溶血、无腐败（川加入0.01%硫柳汞或0.01%叠氮钠防腐）试验前需灭能，不同畜禽血清灭能的温度和时间见附录F。
5.1.1.6标准抗原和标准阳性、阴性血清4
抗原和阳性血清效价滴定的方法见附录G。5.1.2操作方法
5.1.2.1直接补体结合试验(DCF)5. 1. 2. 1. 1 试验方法
5. 1.2. 1. 1. 1 试管法
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按表1的程序操作。试验要同时设抗补体对照、阳性血清对照、阴性血对照.抗原对照、溶血素对照和生理盐水对照。
表1直接补体结合试验【试管法】单位为升
被检血清
2工作盘抗原
2单位补体
生理盐水
1 * 64
混勾后，2℃16h~18h感作，取出后37℃水浴30min敏化红细胞
混勺，37℃水浴30min
+++++:1!
全不全不2%
5.1.2.1.1.2微量法
t:1282工作量
2工作量
溶而素
生理热
用U型96孔反应板，按表2的程序操作，试验同时设抗补体对照，阳性血清对照、阴性血清对照、抗原对照.溶血素对照和生理盐水对照。表2真接补体结合试验（微量法）单位为微升
被检血清
2工作量抗原
2单位补体
牛理盐水
试验引
1 : 32
1:6411282T件量
混后，41$h18h感作，取出后37水浴min敏化红细胞
混勺.37℃c水浴30min
各项对照
2工作品
溶血素
生埋盐
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5.1.2.1.2结果判定举例
在最后一次 37°C.水浴 30 min 后。文即逃行试验结果判定,各组对照为如下结果时试验方能成立，否则成重复试验：被检面清抗补体对照：完全溶面（一）；a)
阳性血清加抗原对照：究全抑制济血（十一十+）：阴性血清加抗原对照：完全济血（一)；抗原对照：完全溶（一）：
溶而素对照：完个溶血（--);
生埋盐水对照：完全不溶血(一十十十)。5.1.2.1.3判定标准
5. 1. 2. 1. 3. 1 兔血清
a）被检血清效价1：16（卜+)判为阳性；被检面清效价≤1：8)判为例性。被捡血清效价=1：16（十）或1：8（1十）判为可疑：重复试验仍为可疑，则判为阴性，5.1.2.1.3.2绵羊、山羊、牛、幼龄鸽、鹦鹉等血清a）被检血清效价1：8（++)判为阳性；b）被检血滑效价≤1：4+)判为阴性；）被价血消效价=1：8（十)或］：1（一十)判为可疑：再复试验仍为可疑，则判为阳性5.1.2.2间接补体结含试验(ICF)5.1.2.2.1试验方法
5. 1. 2. 2. 1. 1 试管法
按表3的程序燥作。
表 3 间接补体结合试验(试管法)单位为亲升
被检血清
1工作抗原
试验管
混勾后,4℃ 65~8h感作
1正作丘指示血清
2补体单位
生理盐水
间接补反对照
1 641:128 1工作量
混句后：4%过夜（或8h~-10h），取出后37%水浴30mitl敏化纠细跑
混勺.377水浴30min
全溶血全溶血
5. 1. 2. 2. 1. 2微量法
按表 4 的程序操作，
溶，溶而
全济血
直接补反
1工作量
杀游面
1 工作抗原
混匀后,4℃6h~8h感作
1 工作量指示血清
2补体单位
表 4间接补体结合试验(微量法)被检血清
试验管
1:161: 32
1+ 64 1: 128
生埋盐水
混句店，4℃过夜（或5h~10h)，取出后37℃水浴30min教化红细咆
5050501 50
混.37%水浴30nim
全溶血全溶血
5.1.2.2.2结果判定举例
溶血溶血
最后一次37℃水浴 30 min后,立即判定。25
对照试验为如下结果时试验方能成立，否则应重复试验：被检血清抗补体对照：完全溶血（一）：a）
阳性血清加抗原加指示血清：完全溶血（一）;间接补反对照
！工作室
全溶血
阴性血清加抗原加指示血清完全抑制溶血（十++）；c
d）抗原对照：完全溶血（一）
5.1.2.2.3判定标准
5. 1. 2. 2. 3. 1 鸭血清
被检血清效价1：16（+一)判为阳性；被检血清效价18（+)判断为阴性；b
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单位为微升
直接补反
后示剂
1 T.作量
被检血清效价一116（十)或1：8(十十)判为凝：重检仍为可疑判为阳性5. 1.2. 2.3. 2猪、鸡、鹑等血清a）被检血清效价1：8（一十）判为附件；h）被检血清效价≤1：4(+)判断为即性；c）被检而清效价一：8.十)或14<十十)判为可疑；重捡仍为疑判为阳性。5.2间接血凝试验(IHA)
5.2.1材料
5.2.1.1器材
96孔（8×12)V型（110°）聚苯乙烯滴定板，25L、50μ1.微量移液器或稀释，微量振荡器，水浴等，
5.2.1.2敏化红细胞
为衣原体纯化灭活抗原致敏的雄性绵羊红细胞。5.2.1.3对照血清
标准阳性血清的血凝效价为1：2048~-1；1096.标准阴性血清的血凝效价≤1147
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5.2.1.4被检血清
成溶血、无腐败。必要时,可加人硫柳汞或叠氮钠以防，其含量分别为0.01%和0.2%，试验前灭能。
5.2.1.5稀释液
为含1%灭能健康免血清的0.75 mol/L pH 7.2磷酸盐缓冲液(PRS)+制备方法见附录H,5.2.2操作方法
5.2.2.1稀释被检血清
每份被检而清川8孔，每孔滴加稀释液50)uL，用微量移液器或稀释棒吸（蘸)取被检血清50μL加人第」孔，充分混匀后再吸（蘸)取50uL加人第2孔依次做倍比连续稀释个8孔（1：2,1：41：8.,1：256+混勾后从第8孔弃50μL，5.2.2.2加抗原
将抗原摇剑后，每孔滴加1※抗原敏化红细胞悬液25u。5.2.2.3设对照
在每块 V型滴定板上做试验,要同时设立对照,即敏化红细胞空白对照1 孔：阳性血清(1：61)加敏化红细胞对照1孔；阴性血清(14)加敏化红细胞对照1孔。所有对照样的稀释与被检血清机同。5.2.2.4振荡
加致敏红细胞后将V型滴定板放在微量振药器上振荡1min,置丁室温（冬季置于35温箱)2h。判定结果，操作程序见表5。
表5间接红细胞凝集试验程序及判定结果举例单位为微升
被检血清稀释度
稀粉度
敏化红
1 * 64
放在微量振落器「震落1 mir!,置于室温(冬季放于33℃温箱)2 h判定
注：表中所示被拾血清的血效价为：1355.2.3结果判定举例
凝集程度的标雄如下：
+「「红细胞100%凝集，呈一均匀的膜布满整个孔底：1:256
各项对照
敏化红妇性血清 团性血清
十十十：红细胞75为凝集，形成的膜均分地分布在孔底-但在孔底中心有红细胞形成的一个针尖大小点，
十十：红细胞5C%凝集，在孔底形成的薄膜边缘呈齿状，孔底为红细胞圆点：十：红细胞25%凝集·孔底红细胞形成的圆点较大；十红细胞沉丁孔底，但周围不光滑或圆点中心有空斑；一：红细胞完全抗丁孔底，是光滑的大圆点。加抗原后所设各项对照均成立、否则应重做·止确对照的结果足：S
抗原嫩化红细胞成无白凝（一）；a)
阳性血清对照应100%凝集（十一十十）阴性血清对照应无凝集（一）
5.2.4结果判定
5. 2. 4. 1
5. 2. 4. 2
哺乳动物
血避效价1：64（++)判为阳性；血凝效价1：16(+一)判为阴性；血凝效价介丁两者之间判为可疑。禽类
血凝效价≥1：16+)判为阳性；
血凝效价：1（十→)判为阴性：血凝效价介于两者之问判为可疑：可疑者复检，仍为疑判为阳性，或用CF试验复检NY/T 562—2015bzxZ.net
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附录A
（规范性附录）
姬姆萨染色方法
A.1以1的姬姆色索染料加人66 mlH油.混勺.60℃保温游解2h,再加人66ml.巾醇混勾邸配戒姬姆色素源液。此原液用前用PBS(6.8)稀释10倍左右就可以使川。A.2接常规方法制备血涂片,待血膜十后,用甲醇固定2 min~-3 min。A.3将血涂片或骨髓涂片放胃染色架L滴加稀释好的染色液.使覆盖全部血膜，空温染色15 inin~30min
A.4用白来水缀慢从玻片-端冲洗（注意：勿先倒去染液或肯接对血膜冲洗)，晾十后镜检10
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本标准按照CB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准代替NY/T562—2002《动物衣原体病诊断技术》。NY/T 562—2015
本标准与NY/T562200)2相比.病原检测部分增加了血游学诊断技术和PCR诊断技术，本标准出中华人民共和国农业部提出本标准由全国动物防疫标推化技术委员会（SAC/TC181)归I本标准起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所。本标准主要起草人：周继章、曹小安、宫晓炜、陈启伟、郑福英、李兆才、邱吕庆、殷宏。本标准的历次版本发布情况为：-NY/T562—2002.
1范围
动物衣原体病诊断技术
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本标准规定了动物衣原体鸡胚分离·与传代培养技术、血清学诊断技术及PCR诊断技术。本标准适用于实验室动物衣原体的分离、传代培养和动物衣原体病的诊断，其中，血清学百接补体结合试验（DireciCounplementFixatiunTcst.DCF)适用于哺乳动物（猪除外）和鹦鹉、（7岁以上老龄除外）衣原体病的诊断间接补体结合试验（IndirectComplementFixationTes1,ICF)）适用丁禽类（鸡、除外，但包括老龄鸽）和猪衣原体病的诊断；问接血凝试验（lndirectHemigglutinaticnTest，IIlA)适用扩动物衣原体病的产地检疫、疫情监测和流行病学调查；R诊断技术适用于牛、羊、猪和离衣原体病的诊断。
2术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
工作量抗原workload antigen
能发生完全反成的抗原量的单位，能与最高稀释度的血清呈现完全抑制济血反应的最高抗原稀释度即为1个工作量抗原的效价。
指示血清 serum direcled
与该抗原相应的哺乳动物抗血清。试验中测定的最高的标准清稀释度即为1个工作量指示血清的效价。
补体结合试验camplement lixation test,CE抗体与抗源反应形成复合物，通过激活补体而介导溶血反应，可作为反应强度的指示系统。以征多用十病毒学检测。
间接血凝试验indirect bcnagqlutination test,JHA将抗原（或抗体)包被十红细胞表面，成为致敏的载体，然后与相的抗体（或抗原）结合，从前使红细胞拉聚在起出现可见的凝集反应。3“动物衣原体的分离与培养
3.1试验材料
似或确定为衣原体感染的样本、鸡胚、孵化箱、无菌操作问、生物安全柜、冰箱、照蛋设备、鸡胚气室开孔器、注射器、6号针头、离心机、碘厂、70酒精、链霉素、卡那霉素、生理盐水等。3.2材料要求
3.2.1样本采集
采集的样本应无杂菌污染，包括肝脏、脾脏、流产胎儿胃液、胎衣、流产分泌物等.其中流产胎儿的胃腋为百选样本。样品进行涂片姬姆萨染色（见附录A），油镜下观察疑似有衣原体染色颗粒（原生小体，EB)为紫红色，大小0.2m~0.6μm:网状体(RB)为蓝黑色.直径为0.6μm～1.8um。样本在室外或NY/T562—2015
常温条件下放置时间不应超过72h，采集的样本应尽快放置于一20℃冰箱备用。如需较长时问保存，励置于一80℃超低温冰箱。
3.2.2鸡胚要求
分离培养衣原体用的鸡胚最好为SPF受精鸡蛋孵育，或者受精鸡蛋至少应水白无衣原体抗体目不便用氨下抗牛，叫环索奖抗生素请抗菌抗辆毒笑约物的康鸡群3.2.3环境要求
衣原体的分离培养成在实验室内进行·少最的接种分离培养在生物安全柜内换作即可。如果接秤鸡胚的数量较人，生物安全柜不能满足要求，应在无菌操作间内逊行。鸡肝接种前所均在孵化箱内孵育，保证相对稳定的发育温度和湿度，3.3试验方法
3.3.1样本的处理
将镜检发现疑似衣原体颗粒，或确定为衣原体无杂菌污染的液体样本用火菌生理盐水1：4稀释，果是纠织等样本，按体积大小用灭菌生理盐水1：4稀释后进行研磨被碎处理，30001/min离心20 min,在 4℃冰箱中稳定1 h左有备用。对疑似污染的样本研糜粉碎后,川含链霉素(1 mg/ml.)和卡那霉素（1mg/mL)的生理水1：4稀释，3000r/min离心20min.取具上清液以4000r/imin~-6(000r/min再离心,取上清液1C冰箱稳定1h片右备用。3.3.2鸡胚的准备
试验前7将众离而的受精鸡蛋戒人孵化箱孵膏。弃去试大过小被壳、软壳、畸形壳蛋等，地成7日龄发育的鸡胚。接种前1d,成弃去发育不良及死亡胚休,选择发育良好的鸡胚，划定气及标记发育体的位置以备而，
3.3.3鸡胚的接种
用碘配消母气室部位、开孔.孔大小以注射用针头进人为宜.接种深度为1.5cm～2.0cm。每个鸡胚无菌操作接种0.4mI上述处理好的样本丁卵黄囊内：蜡封蛋壳针孔，置于37℃~38.5℃孵化箱内孵育。
3.3.4鸡胚卵黄囊膜的收集
弃去接种后72h内死亡的鸡胚，收集接种后4d10d内死广鸡胚卵黄囊膜继续传代，直至接种鸡胚规律性死亡（即接种后4～？内死亡），初次接种分离时.接种后10内未死亡鸡压，收集第10d米死亡鸡胚卵黄囊膜，涂片姬姆萨染色。显微镜下观察疑似有衣原体染色颗粒，应将该卵黄囊膜继续传代3代～4次，直至出现规律性死亡为止。继续传代时-将收集的鸡胚卵黄囊膜研磨破碎处理，加人生理盐水稀释（1个卵黄囊膜加人4ml.牛唑盐水）后.30c0r/min离心20min在4℃冰箱中稳定1h左右后，接种？目龄发育良好的鸡胚传代。3.4结果判定
初次分离时，传代鸡胚在接种后4~7山内出现规律性死亡，可初步判定为衣原体感染，进步的确认需要迹行细菌学检测和PCR鉴定。初次接种分离时·接种后10d内末死广鸡斯、取卵黄囊膜涂片染色，显微镜观察疑似有衣原体染色颗粒，成继续使用鸡胚传代3饮~~1次，仍然不死L月显微镜格查未发现疑似衣原体颗粒者，叮判为衣原体感染阴性。4动物衣原体病的PCR诊断
4.1试验材料
4.1.1仪器
PCR反应仪、低温高速离心机、稳压稳流电仪、紫外凝胶成像仪：4.1.2试剂
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TEbulfcr、ProteiriaseK、溶菌酶、TaqDNA聚合酶、SDS、饱和酚、无水乙醇、酚：氯仿+异戈醇（25：21：1）、琼脂糖等，
4.1.3引物
登录Genbarak，下载相关的基因序列.设计合成了2对引物。第对引物：
MP1: 5'- ATGAAAAAACTTTGAAATCGG - 3';MP2:5'-TTAGAATCTGAAITGAGCATTCAT-3'。第对引物：
MP3:5'-CAGGATACTACGGAGATTATGTTT-3':MP4:5'-GATTAGATTGAGGTATTGGAA - 3 。4.2方法
4.2.1衣原体基因组INA的提取
取新鲜或冰冻组织块或鸡胚卵黄膜0.3cm0.5cm，剪痒、研磨。加入400TE缓冲液，转人到1.5mI.的Eppcndorl管中。以10oμL的TE缓冲液冲洗句浆器，冲洗液一并转人Eppcndorf管中加人100uI.20%的SDS（终浓度1%），混勺；加人Pruteinase至终浓度为200u/μI，混匀后G0作刀30min。振摇混勾后转人37℃水浴2h，期问振册数次。加人溶菌酶30L.置于65℃水溶30min取山置沸水浴中5min。加入等体积的饱和酚，倒转混句，4℃7500r/min离心10min.取层水相，重复操作次；加人等体积的酚：氛仿：异戊醇（25：24：1），颠倒摇匀2次~3次，4℃:7500r/m1in离心10min，转移上消液十另一离心答中，加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，一20℃沉淀30min，12000r/ui离心10min.充么所有液机。用1mL70%乙醇漂洗2次～3次，每次12000r/min离心2min。真空或室温干燥I3NA沉淀物用25μuI.尤菌双蒸水溶解，保存在-20℃备用。4.2.2PCR反应体系及条件
4.2.2.1推荐使用反应体系
第一次 PCR扩增：
l0×PCRbuffert含Mg\-)
MPI和MP2引物
模板（被检样本总DNA）
无菌双蒸水
Taq DNA聚合酶
第次 PCR扩增：
10XPCR huffcr(含 Mg+)
MP3 和 MP4引物
模板(--扩产物)
无菌双蒸水
TaDVA聚合酶
34. 75 μuL
0. 25 μL
36. 75 μl.
样本检测时.同附要设阴性对照和空白对照。阳性对照模板为衣原体MOMP基内阳性质粒，空白对照为双热水，其他体系成分不变。如果是采用其他更好的反应体系时.可根据具体情况调整体系。4.2.2.2反应条件
一扩：首先95充分变性5min；然后35个循坏，分别为94℃变性1min，52.5℃退火1min.72℃延伸2 min;最后72℃延仲 10 min。3
NY/T 562-—2015
二扩:35个循环，分别为94~变性305.51.6℃退火1min,72℃延伸2min;最片72℃延伸10min4.3电泳
4.3.1制板
取1g琼脂糖加入10CmL电泳缓冲液.摇匀，加热济化后制作1%琼脂糖凝胶板。4.3.2加样
PCR皮成结束.取二次扩增产物各5uL(包括被检样木、阳性对照、空白对照）.DL2000DNA分子质量标准5uL近行琼脂镛凝胶电深，4.3.3电泳条件
小心地移去梳子将凝胶放人电泳槽。加人电泳缓冲液，使液面高出凝胶表面］mm~2mn。如加样孔内有气泡，应尽量用吸管吸出。用微量移液器将样木与上样缓冲液按1：5混合·加人孔内使沉人孔底;80V~-100V恒压电泳.使NA向阳极方向移动。4.3.4凝胶成像仪观察
扩增产物电泳结束后，丽凝胶成像仪观察检测结果.拍照-记录试验结果。4.4结果判断举例
4.4.1判定说明
将护增产物电泳后用凝胶成像仪观察，DNA分子质最标准、阳性对照.空白对照为如下结果时试验方成立，否则应重新试验。DL2000DNA分子质量标准(Marker）电泳道从上到下依次出现2000bp1000bp、750bp、500bp、250bp.100bp6条清晰的条带。阳性对照二扩产物约为480bp大小清晰的条带。在样本检测时，大多·扩反应因扩增产物量小而难以看见电泳条带。若一扩产物出现大小约1170 bp的条带，叫直接判定为附性。空对照电泳道不出现任何条带。4.4.2样本结果判定
在同：-块凝胶板工电泳后，当I)NA分子质量标准，各组对照同时成立时：被检样本一扩产物电泳出现;大小约 1170 bp的条带,可直接判定为阳性(+）;若一反成产物电泳没有约 1170 bp条带，扩反应产物电泳出现一条480bp的条带，判为阳性（十）。被检样本一扩反成产物电泳没有约1170bp的条带，-护反应产物电泳没有出现大小为180bp的条带，判为阴性（-）。结果判定示意图见附录B。5动物衣原体病血清学诊断技术
5.1补体结合试验(CF）
5.1.1材料准备
5. 1. 1. 1 器材
12mm×37mm试管、试管架.水浴箱、U型96（8×12)孔微量滴定板、f.理盐水。5. 1. 1.2补体
商品补体，按说明书使用和保存，试验前对供试补体需经补体效价滴定，补体效价滴定方法见附录（。5.1.1.3溶血素
试验前对供试溶血索需经效价滴定，溶血素效价滴定见附录D，5.1.1.41%绵羊红细胞悬液
制备方法见附录上,嫩化红细胞制备见（.2，5.1.1.5被检血清
应无溶血、无腐败（川加入0.01%硫柳汞或0.01%叠氮钠防腐）试验前需灭能，不同畜禽血清灭能的温度和时间见附录F。
5.1.1.6标准抗原和标准阳性、阴性血清4
抗原和阳性血清效价滴定的方法见附录G。5.1.2操作方法
5.1.2.1直接补体结合试验(DCF)5. 1. 2. 1. 1 试验方法
5. 1.2. 1. 1. 1 试管法
NY/T 5622015
按表1的程序操作。试验要同时设抗补体对照、阳性血清对照、阴性血对照.抗原对照、溶血素对照和生理盐水对照。
表1直接补体结合试验【试管法】单位为升
被检血清
2工作盘抗原
2单位补体
生理盐水
1 * 64
混勾后，2℃16h~18h感作，取出后37℃水浴30min敏化红细胞
混勺，37℃水浴30min
+++++:1!
全不全不2%
5.1.2.1.1.2微量法
t:1282工作量
2工作量
溶而素
生理热
用U型96孔反应板，按表2的程序操作，试验同时设抗补体对照，阳性血清对照、阴性血清对照、抗原对照.溶血素对照和生理盐水对照。表2真接补体结合试验（微量法）单位为微升
被检血清
2工作量抗原
2单位补体
牛理盐水
试验引
1 : 32
1:6411282T件量
混后，41$h18h感作，取出后37水浴min敏化红细胞
混勺.37℃c水浴30min
各项对照
2工作品
溶血素
生埋盐
NY/T562—2015
5.1.2.1.2结果判定举例
在最后一次 37°C.水浴 30 min 后。文即逃行试验结果判定,各组对照为如下结果时试验方能成立，否则成重复试验：被检面清抗补体对照：完全溶面（一）；a)
阳性血清加抗原对照：究全抑制济血（十一十+）：阴性血清加抗原对照：完全济血（一)；抗原对照：完全溶（一）：
溶而素对照：完个溶血（--);
生埋盐水对照：完全不溶血(一十十十)。5.1.2.1.3判定标准
5. 1. 2. 1. 3. 1 兔血清
a）被检血清效价1：16（卜+)判为阳性；被检面清效价≤1：8)判为例性。被捡血清效价=1：16（十）或1：8（1十）判为可疑：重复试验仍为可疑，则判为阴性，5.1.2.1.3.2绵羊、山羊、牛、幼龄鸽、鹦鹉等血清a）被检血清效价1：8（++)判为阳性；b）被检血滑效价≤1：4+)判为阴性；）被价血消效价=1：8（十)或］：1（一十)判为可疑：再复试验仍为可疑，则判为阳性5.1.2.2间接补体结含试验(ICF)5.1.2.2.1试验方法
5. 1. 2. 2. 1. 1 试管法
按表3的程序燥作。
表 3 间接补体结合试验(试管法)单位为亲升
被检血清
1工作抗原
试验管
混勾后,4℃ 65~8h感作
1正作丘指示血清
2补体单位
生理盐水
间接补反对照
1 641:128 1工作量
混句后：4%过夜（或8h~-10h），取出后37%水浴30mitl敏化纠细跑
混勺.377水浴30min
全溶血全溶血
5. 1. 2. 2. 1. 2微量法
按表 4 的程序操作，
溶，溶而
全济血
直接补反
1工作量
杀游面
1 工作抗原
混匀后,4℃6h~8h感作
1 工作量指示血清
2补体单位
表 4间接补体结合试验(微量法)被检血清
试验管
1:161: 32
1+ 64 1: 128
生埋盐水
混句店，4℃过夜（或5h~10h)，取出后37℃水浴30min教化红细咆
5050501 50
混.37%水浴30nim
全溶血全溶血
5.1.2.2.2结果判定举例
溶血溶血
最后一次37℃水浴 30 min后,立即判定。25
对照试验为如下结果时试验方能成立，否则应重复试验：被检血清抗补体对照：完全溶血（一）：a）
阳性血清加抗原加指示血清：完全溶血（一）;间接补反对照
！工作室
全溶血
阴性血清加抗原加指示血清完全抑制溶血（十++）；c
d）抗原对照：完全溶血（一）
5.1.2.2.3判定标准
5. 1. 2. 2. 3. 1 鸭血清
被检血清效价1：16（+一)判为阳性；被检血清效价18（+)判断为阴性；b
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单位为微升
直接补反
后示剂
1 T.作量
被检血清效价一116（十)或1：8(十十)判为凝：重检仍为可疑判为阳性5. 1.2. 2.3. 2猪、鸡、鹑等血清a）被检血清效价1：8（一十）判为附件；h）被检血清效价≤1：4(+)判断为即性；c）被检而清效价一：8.十)或14<十十)判为可疑；重捡仍为疑判为阳性。5.2间接血凝试验(IHA)
5.2.1材料
5.2.1.1器材
96孔（8×12)V型（110°）聚苯乙烯滴定板，25L、50μ1.微量移液器或稀释，微量振荡器，水浴等，
5.2.1.2敏化红细胞
为衣原体纯化灭活抗原致敏的雄性绵羊红细胞。5.2.1.3对照血清
标准阳性血清的血凝效价为1：2048~-1；1096.标准阴性血清的血凝效价≤1147
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5.2.1.4被检血清
成溶血、无腐败。必要时,可加人硫柳汞或叠氮钠以防，其含量分别为0.01%和0.2%，试验前灭能。
5.2.1.5稀释液
为含1%灭能健康免血清的0.75 mol/L pH 7.2磷酸盐缓冲液(PRS)+制备方法见附录H,5.2.2操作方法
5.2.2.1稀释被检血清
每份被检而清川8孔，每孔滴加稀释液50)uL，用微量移液器或稀释棒吸（蘸)取被检血清50μL加人第」孔，充分混匀后再吸（蘸)取50uL加人第2孔依次做倍比连续稀释个8孔（1：2,1：41：8.,1：256+混勾后从第8孔弃50μL，5.2.2.2加抗原
将抗原摇剑后，每孔滴加1※抗原敏化红细胞悬液25u。5.2.2.3设对照
在每块 V型滴定板上做试验,要同时设立对照,即敏化红细胞空白对照1 孔：阳性血清(1：61)加敏化红细胞对照1孔；阴性血清(14)加敏化红细胞对照1孔。所有对照样的稀释与被检血清机同。5.2.2.4振荡
加致敏红细胞后将V型滴定板放在微量振药器上振荡1min,置丁室温（冬季置于35温箱)2h。判定结果，操作程序见表5。
表5间接红细胞凝集试验程序及判定结果举例单位为微升
被检血清稀释度
稀粉度
敏化红
1 * 64
放在微量振落器「震落1 mir!,置于室温(冬季放于33℃温箱)2 h判定
注：表中所示被拾血清的血效价为：1355.2.3结果判定举例
凝集程度的标雄如下：
+「「红细胞100%凝集，呈一均匀的膜布满整个孔底：1:256
各项对照
敏化红妇性血清 团性血清
十十十：红细胞75为凝集，形成的膜均分地分布在孔底-但在孔底中心有红细胞形成的一个针尖大小点，
十十：红细胞5C%凝集，在孔底形成的薄膜边缘呈齿状，孔底为红细胞圆点：十：红细胞25%凝集·孔底红细胞形成的圆点较大；十红细胞沉丁孔底，但周围不光滑或圆点中心有空斑；一：红细胞完全抗丁孔底，是光滑的大圆点。加抗原后所设各项对照均成立、否则应重做·止确对照的结果足：S
抗原嫩化红细胞成无白凝（一）；a)
阳性血清对照应100%凝集（十一十十）阴性血清对照应无凝集（一）
5.2.4结果判定
5. 2. 4. 1
5. 2. 4. 2
哺乳动物
血避效价1：64（++)判为阳性；血凝效价1：16(+一)判为阴性；血凝效价介丁两者之间判为可疑。禽类
血凝效价≥1：16+)判为阳性；
血凝效价：1（十→)判为阴性：血凝效价介于两者之问判为可疑：可疑者复检，仍为疑判为阳性，或用CF试验复检NY/T 562—2015bzxZ.net
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附录A
（规范性附录）
姬姆萨染色方法
A.1以1的姬姆色索染料加人66 mlH油.混勺.60℃保温游解2h,再加人66ml.巾醇混勾邸配戒姬姆色素源液。此原液用前用PBS(6.8)稀释10倍左右就可以使川。A.2接常规方法制备血涂片,待血膜十后,用甲醇固定2 min~-3 min。A.3将血涂片或骨髓涂片放胃染色架L滴加稀释好的染色液.使覆盖全部血膜，空温染色15 inin~30min
A.4用白来水缀慢从玻片-端冲洗（注意：勿先倒去染液或肯接对血膜冲洗)，晾十后镜检10
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