NY/T 576-2015
基本信息
标准号： NY/T 576-2015
中文名称：绵羊痘和山羊痘诊断技术
标准类别：农业行业标准(NY)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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出版信息
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标准简介
NY/T 576-2015 绵羊痘和山羊痘诊断技术
NY/T576-2015
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标准内容
ICS 11.220
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 5762015
代替NY/T576-2002
绵羊痘和山羊痘诊断技术
Clinical diagnostic technology for sheep pox and goat pox2015-05-21发布
2015-08-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准按照GB/T1.1
2009给出的规则起草
本标准代替NY/T576·-2002&缩羊痘和山羊痘诊断技术》本标准与NY/T76—2002相比，病原检测部分增加了PCR检测方法，本标准州中华人民共和国农业部提出，本标准中全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。本标准起草单位：中国兽医药品监察所，本标准主要起草人：支海兵、薛青红、印券生、李宁、十乐元、江焕贤。本标准的历次版本发布情况为：NY/T 576—2002。
NY/T 576—2015
1范围
绵羊痘和山羊痘诊断技术
本标谁规定了绵羊痘和山羊痘(以下简称羊痘)的诊断方法。NY/T 576—2015
本标准所规定的临床检查和PCR试验适用于羊痘的诊断以及产地、市场、1岸的现场检疫；中和试验和PCR试验适用丁羊痘的诊断、检疫和流行病学调查；电镜检查，包涵体检查适用于羊痘病原的格测，
2缩略语
下列缩略语适川于本文件，
CE：cytopathiceffect效细胞病变作而。H.E：hematoxylin-cusinstaining苏木精伊红染色，MEM:minimun essential medium 低限基础培养基。PCR：polymerasechainTeaction聚合酶链反应。TrisEDTA：tris ethylenediaminetetraacetic acid三羟基氨基甲烷一乙二胺四叫乙酸。3临床检查
3.1临床症状
羊痘的潜伏期一般为5d14d，感染初期表现为发热体温超过40℃，精神、食欲渐差。经2d~5d后开始出现斑点先在体表无毛或少毛皮肤、可视黏膜上出现明显的小充血斑，随片在全身或腹股沟、腋下、会阴部出现散在或密集的痘疹，进而形成痘肿，分典型痘肿和作典型痘肿。a）典型脆肿：初期时，痘肿呈圆形，皮肤隆起，徽红色，边缘整齐；进而发展为皮下湿润、水肿、水泡、化脓、结狮等反应。同时，痘肿的质地由软变硬，皮肤颜色由微红逐渐变为深红、紫红，严查的可成为“血痘”。恋羊般为全身发痘.并伴有全身性反应。h）非典型肿：在痘肿的发生、发展和消退过程中，皮肤无明显红色，无严重水肿，未出现水泡、化脓、结痴等反应，痘肿较小质地较硬，有的成为“石痘”。患羊无严重的全身性反成。随着病程的发展，有的病羊尚可见桌炎、结膜炎、失明、体表淋巴结特别是肩肿前淋巴结肿大。病喜卧不起废食、呼吸困难，严重的体温急剧下降，随后死亡。存活病羊，可在症肿结痴后1个月~2个月，痴皮白然脱落，在皮肤上留下痘痕（疤）。3.2病理变化
病关痘肿皮缺的定要病理变化表现为一系列的炎性反应，包括呼吸器官和消化器官上有大小数量不等的痘斑.结节或溃疡；在肝脏、肾脏表面偶可见白斑：全身淋巴结肿大：细胞漫润、水肿、坏死和形成毛细血管血栓，厂体剖检.通带可见不同程度的黏膜坏死。4实验室诊断技术
4.1样品采集
取活体或剖检羊的皮肤丘疹、肺部病变组织、淋凹结用于病毒分离和抗原检测；病料采集时间为临床症状出现后1周之内。采集病毒血症期间的组织进行病埋组织学检查·病料为病变及病变周围组织，采集后迅速胃于10倍体积的10%福尔林溶液中。经领静脉无菌采集血液.分离血清·置于一20%.保存,用于血清学检测。
NY/T 576—2015
4.2样品运输
福尔马林浸润的组织在运输时无特殊要求，川于病每分离和抗原检测的样品成置于4℃或一20℃保存。如果样品在无冷戴条件下需要运送到较远的地方，应将样品置于含10%廿油的Hanks液中，用于血清学检测的样品，应置十冰的冷藏内运输。4.3病原鉴定
4.3.1病毒分离
4.3.1.1材料
MEM培养液（配制方法见附录A）、待检组织绵羊盖率丸细胞（制备方法见附录13）、胎牛血消细胞培养瓶（25in）。
4.3.1.2方法
4.3.1.2.1样品制备
取待检组织，无菌前碎.川组织句浆器研磨：按1：1的比例加人MEM培养液制备红乡悬液，1℃过夜：1500r/min心10min，取上清备用：4. 3. 1. 2. 2接种
取25cm细胞培养瓶，待绵羊羔萃丸细胞形成90%单层后，接种1ml.病料上清液：置37℃吸附11，弃去瓶内液体，补足细胞维持液：置37℃、5%C条件下培养。同时，设立正常细胞对照1瓶，4.3.1.2.3培养及观察
每日观察细胞培养物是否出现CFE，持续培养14d-在培养期凹可适时更换MFM培养液。如果14d仍未见CPE，将细胞培养物反复冻融3次.取上清液继续接种绵羊羔率丸细胞，一且出现CPE，可进行包涵体染色检查，
4.3.1.3判定
羊痘病毒感染绵羊睾丸细胞的特征性CPE为细胞收缩变圆，界限明显：问源变觉，形成拉网状，细胞脱落，并形成嗒酸性包涵体。包涵体大小不等，最大的约为细胞核的一半。4.3.2电镜负染检查法
4. 3.2. 1 材料
待检组织载玻片、400H电镜市网膜Tri5EDTA(pHI7.8)缓冲液、1.0%磷钨酸(pH7.2)。4.3.2.2方法
4.3.2.2.1样品制备wwW.bzxz.Net
取待检组织，尤菌剪碎.用继织匀浆器研磨，按1：5的比例加人MEM培养液制备组织悬液。4.3.2.2.2制片
取滴纠织悬液置丁载玻片上，将碳网膜漂浮于液滴：1min;将Tris-FT)TAH7.8)缓冲液滴加到炭网膜上浸泡20s：用滤纸收十膜上液体，滴加1.0%磷鸽酸（pH7.2）染色10s用滤纸吸十膜上液体,待其白然丁燥后月透射电镜观察。4.3.2.3病毒形态判定
在电镜下观察,病毒粒子呈卵圆形,大小为15℃ nm-~180 nm，4.3.3包涵体检查
4.3.3.1材料
纽织病料（置于福尔马林溶液中或4C保存备川）、裁玻片、苏木精一伊红I.F)染色液。4.3.3.2方法
取组织病料，用切片机切成薄片置F载玻片上-或百接将病料在载玻片上制成压片（触片）。经II-F染色·置于光学品微镜下观察。2
4.3.3.3判定
羊痘病母感染细胞的细胞质内应有不定形的哨酸性包涵体，细胞核内应有空泡，4.3.4中和试验
4.3.4.1材料
NY/T 576—2015
MFM培养液配制方法见附录A）绵羊羔睾丸细胞（制备方法见附录B)、羊痘抗原及阳性血清、待检羊组织，
4.3.4.2方法
4.3.4.2.1样品制备
按4.3.1的方法将待检样品接种细跑，并培养至出现CPE时收获冻融后的细胞慧液，备。4.3.4.2.2抗原及阳性血清
性血清,恢复至窄温备用。标定羊痘抗原滴度，并将抗原液用 Hanks 液逃行系列稀释至 10TCID/0.1 ml..
4. 3. 4.2. 3加样
取 96孔细胞培养板：待检样品的细胞悬液，羊痘抗原(1.00 TCL)n/C.1mL)各加 2孔，每孔 0.1mL.问其中一孔加人等量阳性血,向另一孔内加入等量 Hank液;阳性血清加1孔,每孔 0. 1 mL,再向孔内加人等量 Hanks液，作为阳性血清对照;Hanks液加1孔，每孔 0.2 ml,作为空白对照。4. 3. 4. 2. 4感作
将 96 孔纲胞培养板摇勾后置于 37℃水浴中和 1 h,期问每 15 min振摇 1次。4.3.4.2.5培养
敢生长良好的绵羊亲罩丸细胞单层1瓶，按常规方泌消化：调擎细胞浓度至1C个/m，每孔接种细胞悬液0.1mL。接种后，置于37℃、5%C0条作下培养。4.3.4.2.6观察
培养 4 d~-7 l,每观察 CPE情况，4.3.4.3结果判定
平正常细胞对照孔、羊痘抗原巾和对照孔、阳性血清对照孔的细胞均无CPE,而羊痘抗原对照孔细跑有特征性CPE.试验成论。待检样品中和试验孔细胞无CPF而待检样品未巾和试验孔的细胞有特征性PE,判定该待检抗原为羊痘抗原注:如果羊痘抗原中和对照细跑出现 CPF.表明性血清不能完全中和 i00 TC:IFc/0. 1 tnL.的羊症抗原,可对待检样品和痘抗原进适当稀释或更换更高效价的即性血清再进行中和试验，4.3.5PCR试验
4.3.5.1材料
待检样品、羊痘病毒对照、DNA提取试剂盒、2义TalMasterMix（商品化试剂)、1.5%琼脂糖凝胶（见附录A）.1XTAE缓冲液（商品化试剂）、DNAMarke-I（商品化试剂）、上样缓冲液（商品化试剂）高压火菌的去离子水PCR仪、台式尚速冷冻离心机、电泳仪、电泳槽、冰箱、凝胶成像系统、微显移液器.水济、旋仪等
4.3.5.2方法
4.3.5.2.1样品处理
取待检纠[织（皮肤或其他纽织)，无菌剪释、用组织匀浆器研磨；按1：10的比例加入MEM培养液制备红织悬液.1℃过夜：1500r/min离心10min，取上清备用：冻融的抗凝而精液或培养上清液等液体样品取0.2ml.备历。
4.3.5.2.2DNA提取
在0.2ml.血液样品中加入2/rL蛋白酶K溶液(20mg/mL)或0.8mL组织样品中加入 10 μl.蛋NY/T 576-—2015
H酶K溶液。按LNA提取试剂盒说明I或以下方法提取DNA。将上述样品56C群育2h或过夜.再100℃加热10h按样品体积1：1的比例加入等体积的装酚，氯伤和异及醇溶液<体积比为25：24：1）：振荡均句室温孵育10min，将样品4℃，1000g离心15min。小心收集上水相约200l),并转移到2.0mI.小管4.并加人等体积的冷乙醇和1/体积的酸钠(3mo1/I,pH5.3)，将样品置于一20℃静置1h。将样品℃16000%离心151ni1.去掉上清液。刑70%冷乙醇（100uL)洗涤沉症：并4℃，16C00g离心］min，充去上清液,并彻底干燥，用30ul，无RNA酶水悬浮溶解沉淀，置予20℃保存，备爪，
4.3.5.2.3引物合成
按下列引物序列合成引物：
正间明物5'TCC-GAG CFCTTT-CCT-GAT-TT-TCT-TAC-TAT-3'反间物5\IAT-GGT ATAA-ATT-ATA-TAC-GTA-AAT-AAC-34.3.5.2.4PCR扩增体系
按下列方法配制.PR扩增反成体系：10×PCR缓冲液
5onmol/1. MgCl2
10mmol/L dNTT
上游引物
下游引物
DNA模板（约1Cng）
Tag 酶
无核酸酶水
4.3.5.2.5PCR扩增条件
1. 5 μt.
0. 5 μl.
按下列程进行PCR扩增：先95℃变性2min.然后按95℃变性45s、50℃退火50s、72℃延伸60 $的顺循环，其循环31次，最后在72℃温度下延仲2min，4℃保存，备用。4.3.5.2.6PCR产物电泳
每个样品取10L与上样缓冲液充分混匀，再衔管取5μL加人琼脂糖凝胶板的加样孔.在位丁凝胶中央的孔加人DNA分子量标准。加样后,按照8V/crmn~-l0V/cm电压，电泳 40 min~60 min(每次电泳时，每隔10min观察1次。当加样缓冲液中漠酚蓝电泳过半至凝液下2/5处时.可停止电泳）电泳后,置十紫外凝胶或像仪下观察.用分子量标准判断PCR扩增产物大小，4.3.5.2.7结果判定
单痘病毒阳性对照出现192bp的扩增条带，且阴性对照无此扩增带时,判定检测有效；否卿判定检测结果心效不能进行判断，被检样品出现9品扩增带对单痘病阳性，否则为阴性4.4血清学试验一中和试验法
4.4.1材料
MEM培养液（配制方法见附录A）、缔羊蒸宰丸细胞（制备方法见附录B)、羊痘抗原及阳性而清、待检羊血清，
4.4.2方法
4.4.2.1样品处理
经颈脉无菌采集待检羊血-按常规方泌分离血清，56℃灭能30rmin后备用，4.4.2.2抗原及阳性血清
阳性血清-恢复至室温备用。标定平症抗原满度·并将抗原液用H=iks液进行系列稀释至100T'CHDan/0. 1 ml..
4.4.2.3加样
NY/T 576—20 15
取95孔细胞培养板待检血清、阳性血消各加2孔.每孔c.1mI.，向其中一孔加人等量羊痘抗原（100TCID/0.1mIL.），向另-孔内加入等量Hanks液：羊痘抗原（100TCID/0.1ml）加1孔，每孔0.1ml.再向孔内加人等量Hanks液，作为抗原对照；Hanks液加1孔，每孔0.2ml.作为空自对照：4.4.2.4感作
将96孔细胞培养极摇勾后置于37℃中和1h,期间每15min振播1次。4.4.2.5培养
取生长良好的绵羊羔睾丸细胞跑单层1瓶，按常规方法消化，调整细胞浓度至10个/ml.，每孔接种细胞悬液0.1ml。接种后，置于37℃，5%CO条件下培养。4.4.2.6观察
培养4d~7 d.每天观察CPE情况
4.4.3结果判定
当正常细胞和血清毒性对照孔细胞无CPE.而接种抗原对照孔细胞有明显CPE时，试验成立。待检血清中和后，试验孔细胞出现特征性CPF.判定该血清为羊病毒抗体阴性；待检血消中和后,试验孔细胞未山现 CPE,判定该血消为羊痘病母抗体阳性。注：如果羊痘性i清中和细胞出现CPE，表明阳作血清不能完全中和100TCI>50/0.1ml.的.羊痘抗原、可对关痘抗原浓度进行适当调整再进行中和试验。5
NY/T576—2015
A 1 Hanks 液(10 ×浓缩液)
A.1.1 成分
A.1.1.1成分甲
氯化钠
氯化钾
氯化钙
硫酸镁(MgS(,·7H0)
A.1.1.2成分乙
磷酸氢二钠(Na:HPO,·12H,O)
磷酸氢钾
葡萄糖
1.0%酚红
A.1.2配制方法
附录A
（规范性附录）
营养液及溶液的配制
按顺序将上述成分分别溶于450ml.注射用水中，即配成甲液和乙液；然后，将乙液级级加人甲液，边加边搅拌。补足注射用水至1000mL，用滤纸过滤后，加人一氯烧2mL，置于2℃～8℃保存A.1.3使用
使用时.用注射用水稀释10倍.107.6kPa火菌15mil.置2℃～8℃保存备用，使而前，月用7.5%碳酸氢钠溶液调H至7.27.4。
A.27.5%碳酸氢钠溶液
A.2.1成分
碳酸氢钠
注射用水
A.2.2配制方法
将上述成分溶解，0.2um滤器滤过除菌.分装十小瓶中，置一20%保存。4.31.0%酚红溶液
A.3.1成分
1mol/1.氢氧化钠溶液不超过
注射用水补足至
A.3.2配制方法
1 coo ml.
1mul/1.氢氧化钠溶液的制备：取澄清的氢氧化钠饱和液56.0ml,如注射用水至1000ml.即可称酚红.10.0g，加1mol/L氢氧化钠溶液20ml..搅拌溶解。静置后.将已溶解的酚红溶液倒人6
VY/T 576—2015
10C0mL容器内，未溶解的酚红继续加人1mol/I.氢氧化钠溶液20 m!.,搅拌使其溶解。如仍未完全溶解，可继续加少量11mol/L氢氧化钠溶液搅拌。如此反复，百至酚红完个溶解，们所加1Iol/L氧氧化钠溶液总量不得超过 60 mL。补足注射用水至1000 m，分装小瓶，107.6kPa灭菊 15 Inin后.置2℃-~8℃保存。
A.40.25%胰蛋白酶溶液
A.4.1成分
氧化钠
氯化钾
柠檬酸钠(Na:CH,(,·5H,O)
磷酸氢钠(NaH,PO,·2H,O)
碳酸氢钠
葡菊糖
胰蛋白酶（I：250）
注射用水加至
A.4.2配制方法
1 000 mL
待胰酶充分溶解后，0.2μm滤器滤过除菌.分装于小瓶中.置于一20%保存。使时，用7.5%碳酸氢钠济液调 pH至 7. 4~7. 6
A.5EDTA-胰蛋白酶分液10×浓缩液）A.5.1成分
氯化钠
氮化钾
葡葡糖
碳酸氢钠
胰蛋白酶（1：250）
乙_胺四乙酸二
按顺序溶于9ComL注射用水中.然后加人下列各液：1.0%酚红溶液
青霉素（10万TU/ml)
链霉素(10万μg/ml)
补足注射用水至
A.5.2配制方法
10. C mL.
100c mL
将上述成分按顺序溶解，0.2um滤器滤过除菌，分装小瓶，\20℃:保存。临用前,瓜注射用水稀释10倍，作为分散T作：适量分装，置于一20°℃冻存备用。分散细胞时，将上作液取出，置丁37℃水浴副化.并用7.5不碳酸氧钠溶液调pH至7.G~8.0.A. 6抗生素溶液(1 万 IU/mL)
A.6.110×浓缩液
青霉素
链霉素
注射用水
400万IU
400万ug
NY/T576—2015
充分溶解后.0.2pm滤器滤过除菌，分装小瓶·置丁一20℃保存A.6.2工作溶液
取上述10×浓缩液适量，历注射水稀释10倍，分装后置于一20℃保存。A. 7 H-F染色液
A7.1Harris苏木精染液
苏木精
无水乙醇
硫酸铝钾
燕馏水
氨化汞
冰醋酸
10. 0 ml.
先用无水乙醇溶解苏木精，用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，将这两种液休混合后煮沸（约1min），离火后，向该混台液中迅速加人氧化汞，并用坡璃捧搅拌染液直至变为紫红色，爪冷水冷却至牵温。然后，加人冰醋酸片混合均勾，过滤后使用。A.7.2伊红染液
伊红染液有水性和醇游性2种，常用0.5※水溶性伊红染液，配方如下：伊红Y
蒸馏水
冰醋酸
先用少许蒸馏水溶解伊红Y，然后加入个部蒸馏水，玻璃棒搅拌均勾。而冰醋酸将染液调至pH4.5左右:过滤后使用。
A.7.3盐酸一乙醇分化液
浓盐酸
75%艺醇
A.8MEM培养液
A.8.1成分
MEM·I粉培养基按说晰书要求
注射用水
A.8.2配制方法
称取适景十粉培养基，加人注射用水500mL，磁力搅拌使之完全溶解，根据说明书要求补加碳酸氢钠，谷氮酰胺和其他特殊物质，加水定容到终体积-调节pH7.1~7.6.0.22m滤膜过滤除菌，无菌分装.2℃-~8℃保存备用
配制好的培养液用前加人胎牛血清.细胞培养液胎牛血清含为5%-10%，细胞维持液胎牛血消含量为1%~~2%。
A.910%福尔马林溶液
B.1原代细胞制备
附录B
【规范性附录】
绵羊羔睾丸细胞的制备
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选取4月龄以内健康雄性绵羊，以无菌于术摘取率丸，剥充翰膜及白膜，剪成1mm~2mm小块.用Hanks液（见A.1)清洗3次~4次。按辜丸纠织量的G倍~-8倍加入0.25头读酶溶液（见A.4).置十37℃水浴消化。待墨丸组织工膨松状，弃去胰酶溶液，用玻璃珠振烯法分散细胞，并爪MFM培养液稀释成每毫升含100万左右细胞数.分装细胞瓶.37℃静置培养，2d～1d即川长成单层。B.2次代细胞制备
取生长良好的原代细胞，弃去生长液.加入原培养液量1/10的EDTA胰酶分散液（见A.5），消化2min~5min。待细胞层呈雪花状时弃去胰酶分散液。加少许MEM培养液吹散细胞，然后按1：？的分种率、补是MFM培养液。混匀、分装细胞瓶，置丁37℃静置培养，细胞传代应不超过5代
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绵羊痘和山羊痘诊断技术
Clinical diagnostic technology for sheep pox and goat pox2015-05-21发布
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本标准按照GB/T1.1
2009给出的规则起草
本标准代替NY/T576·-2002&缩羊痘和山羊痘诊断技术》本标准与NY/T76—2002相比，病原检测部分增加了PCR检测方法，本标准州中华人民共和国农业部提出，本标准中全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。本标准起草单位：中国兽医药品监察所，本标准主要起草人：支海兵、薛青红、印券生、李宁、十乐元、江焕贤。本标准的历次版本发布情况为：NY/T 576—2002。
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1范围
绵羊痘和山羊痘诊断技术
本标谁规定了绵羊痘和山羊痘(以下简称羊痘)的诊断方法。NY/T 576—2015
本标准所规定的临床检查和PCR试验适用于羊痘的诊断以及产地、市场、1岸的现场检疫；中和试验和PCR试验适用丁羊痘的诊断、检疫和流行病学调查；电镜检查，包涵体检查适用于羊痘病原的格测，
2缩略语
下列缩略语适川于本文件，
CE：cytopathiceffect效细胞病变作而。H.E：hematoxylin-cusinstaining苏木精伊红染色，MEM:minimun essential medium 低限基础培养基。PCR：polymerasechainTeaction聚合酶链反应。TrisEDTA：tris ethylenediaminetetraacetic acid三羟基氨基甲烷一乙二胺四叫乙酸。3临床检查
3.1临床症状
羊痘的潜伏期一般为5d14d，感染初期表现为发热体温超过40℃，精神、食欲渐差。经2d~5d后开始出现斑点先在体表无毛或少毛皮肤、可视黏膜上出现明显的小充血斑，随片在全身或腹股沟、腋下、会阴部出现散在或密集的痘疹，进而形成痘肿，分典型痘肿和作典型痘肿。a）典型脆肿：初期时，痘肿呈圆形，皮肤隆起，徽红色，边缘整齐；进而发展为皮下湿润、水肿、水泡、化脓、结狮等反应。同时，痘肿的质地由软变硬，皮肤颜色由微红逐渐变为深红、紫红，严查的可成为“血痘”。恋羊般为全身发痘.并伴有全身性反应。h）非典型肿：在痘肿的发生、发展和消退过程中，皮肤无明显红色，无严重水肿，未出现水泡、化脓、结痴等反应，痘肿较小质地较硬，有的成为“石痘”。患羊无严重的全身性反成。随着病程的发展，有的病羊尚可见桌炎、结膜炎、失明、体表淋巴结特别是肩肿前淋巴结肿大。病喜卧不起废食、呼吸困难，严重的体温急剧下降，随后死亡。存活病羊，可在症肿结痴后1个月~2个月，痴皮白然脱落，在皮肤上留下痘痕（疤）。3.2病理变化
病关痘肿皮缺的定要病理变化表现为一系列的炎性反应，包括呼吸器官和消化器官上有大小数量不等的痘斑.结节或溃疡；在肝脏、肾脏表面偶可见白斑：全身淋巴结肿大：细胞漫润、水肿、坏死和形成毛细血管血栓，厂体剖检.通带可见不同程度的黏膜坏死。4实验室诊断技术
4.1样品采集
取活体或剖检羊的皮肤丘疹、肺部病变组织、淋凹结用于病毒分离和抗原检测；病料采集时间为临床症状出现后1周之内。采集病毒血症期间的组织进行病埋组织学检查·病料为病变及病变周围组织，采集后迅速胃于10倍体积的10%福尔林溶液中。经领静脉无菌采集血液.分离血清·置于一20%.保存,用于血清学检测。
NY/T 576—2015
4.2样品运输
福尔马林浸润的组织在运输时无特殊要求，川于病每分离和抗原检测的样品成置于4℃或一20℃保存。如果样品在无冷戴条件下需要运送到较远的地方，应将样品置于含10%廿油的Hanks液中，用于血清学检测的样品，应置十冰的冷藏内运输。4.3病原鉴定
4.3.1病毒分离
4.3.1.1材料
MEM培养液（配制方法见附录A）、待检组织绵羊盖率丸细胞（制备方法见附录13）、胎牛血消细胞培养瓶（25in）。
4.3.1.2方法
4.3.1.2.1样品制备
取待检组织，无菌前碎.川组织句浆器研磨：按1：1的比例加人MEM培养液制备红乡悬液，1℃过夜：1500r/min心10min，取上清备用：4. 3. 1. 2. 2接种
取25cm细胞培养瓶，待绵羊羔萃丸细胞形成90%单层后，接种1ml.病料上清液：置37℃吸附11，弃去瓶内液体，补足细胞维持液：置37℃、5%C条件下培养。同时，设立正常细胞对照1瓶，4.3.1.2.3培养及观察
每日观察细胞培养物是否出现CFE，持续培养14d-在培养期凹可适时更换MFM培养液。如果14d仍未见CPE，将细胞培养物反复冻融3次.取上清液继续接种绵羊羔率丸细胞，一且出现CPE，可进行包涵体染色检查，
4.3.1.3判定
羊痘病毒感染绵羊睾丸细胞的特征性CPE为细胞收缩变圆，界限明显：问源变觉，形成拉网状，细胞脱落，并形成嗒酸性包涵体。包涵体大小不等，最大的约为细胞核的一半。4.3.2电镜负染检查法
4. 3.2. 1 材料
待检组织载玻片、400H电镜市网膜Tri5EDTA(pHI7.8)缓冲液、1.0%磷钨酸(pH7.2)。4.3.2.2方法
4.3.2.2.1样品制备wwW.bzxz.Net
取待检组织，尤菌剪碎.用继织匀浆器研磨，按1：5的比例加人MEM培养液制备组织悬液。4.3.2.2.2制片
取滴纠织悬液置丁载玻片上，将碳网膜漂浮于液滴：1min;将Tris-FT)TAH7.8)缓冲液滴加到炭网膜上浸泡20s：用滤纸收十膜上液体，滴加1.0%磷鸽酸（pH7.2）染色10s用滤纸吸十膜上液体,待其白然丁燥后月透射电镜观察。4.3.2.3病毒形态判定
在电镜下观察,病毒粒子呈卵圆形,大小为15℃ nm-~180 nm，4.3.3包涵体检查
4.3.3.1材料
纽织病料（置于福尔马林溶液中或4C保存备川）、裁玻片、苏木精一伊红I.F)染色液。4.3.3.2方法
取组织病料，用切片机切成薄片置F载玻片上-或百接将病料在载玻片上制成压片（触片）。经II-F染色·置于光学品微镜下观察。2
4.3.3.3判定
羊痘病母感染细胞的细胞质内应有不定形的哨酸性包涵体，细胞核内应有空泡，4.3.4中和试验
4.3.4.1材料
NY/T 576—2015
MFM培养液配制方法见附录A）绵羊羔睾丸细胞（制备方法见附录B)、羊痘抗原及阳性血清、待检羊组织，
4.3.4.2方法
4.3.4.2.1样品制备
按4.3.1的方法将待检样品接种细跑，并培养至出现CPE时收获冻融后的细胞慧液，备。4.3.4.2.2抗原及阳性血清
性血清,恢复至窄温备用。标定羊痘抗原滴度，并将抗原液用 Hanks 液逃行系列稀释至 10TCID/0.1 ml..
4. 3. 4.2. 3加样
取 96孔细胞培养板：待检样品的细胞悬液，羊痘抗原(1.00 TCL)n/C.1mL)各加 2孔，每孔 0.1mL.问其中一孔加人等量阳性血,向另一孔内加入等量 Hank液;阳性血清加1孔,每孔 0. 1 mL,再向孔内加人等量 Hanks液，作为阳性血清对照;Hanks液加1孔，每孔 0.2 ml,作为空白对照。4. 3. 4. 2. 4感作
将 96 孔纲胞培养板摇勾后置于 37℃水浴中和 1 h,期问每 15 min振摇 1次。4.3.4.2.5培养
敢生长良好的绵羊亲罩丸细胞单层1瓶，按常规方泌消化：调擎细胞浓度至1C个/m，每孔接种细胞悬液0.1mL。接种后，置于37℃、5%C0条作下培养。4.3.4.2.6观察
培养 4 d~-7 l,每观察 CPE情况，4.3.4.3结果判定
平正常细胞对照孔、羊痘抗原巾和对照孔、阳性血清对照孔的细胞均无CPE,而羊痘抗原对照孔细跑有特征性CPE.试验成论。待检样品中和试验孔细胞无CPF而待检样品未巾和试验孔的细胞有特征性PE,判定该待检抗原为羊痘抗原注:如果羊痘抗原中和对照细跑出现 CPF.表明性血清不能完全中和 i00 TC:IFc/0. 1 tnL.的羊症抗原,可对待检样品和痘抗原进适当稀释或更换更高效价的即性血清再进行中和试验，4.3.5PCR试验
4.3.5.1材料
待检样品、羊痘病毒对照、DNA提取试剂盒、2义TalMasterMix（商品化试剂)、1.5%琼脂糖凝胶（见附录A）.1XTAE缓冲液（商品化试剂）、DNAMarke-I（商品化试剂）、上样缓冲液（商品化试剂）高压火菌的去离子水PCR仪、台式尚速冷冻离心机、电泳仪、电泳槽、冰箱、凝胶成像系统、微显移液器.水济、旋仪等
4.3.5.2方法
4.3.5.2.1样品处理
取待检纠[织（皮肤或其他纽织)，无菌剪释、用组织匀浆器研磨；按1：10的比例加入MEM培养液制备红织悬液.1℃过夜：1500r/min离心10min，取上清备用：冻融的抗凝而精液或培养上清液等液体样品取0.2ml.备历。
4.3.5.2.2DNA提取
在0.2ml.血液样品中加入2/rL蛋白酶K溶液(20mg/mL)或0.8mL组织样品中加入 10 μl.蛋NY/T 576-—2015
H酶K溶液。按LNA提取试剂盒说明I或以下方法提取DNA。将上述样品56C群育2h或过夜.再100℃加热10h按样品体积1：1的比例加入等体积的装酚，氯伤和异及醇溶液<体积比为25：24：1）：振荡均句室温孵育10min，将样品4℃，1000g离心15min。小心收集上水相约200l),并转移到2.0mI.小管4.并加人等体积的冷乙醇和1/体积的酸钠(3mo1/I,pH5.3)，将样品置于一20℃静置1h。将样品℃16000%离心151ni1.去掉上清液。刑70%冷乙醇（100uL)洗涤沉症：并4℃，16C00g离心］min，充去上清液,并彻底干燥，用30ul，无RNA酶水悬浮溶解沉淀，置予20℃保存，备爪，
4.3.5.2.3引物合成
按下列引物序列合成引物：
正间明物5'TCC-GAG CFCTTT-CCT-GAT-TT-TCT-TAC-TAT-3'反间物5\IAT-GGT ATAA-ATT-ATA-TAC-GTA-AAT-AAC-34.3.5.2.4PCR扩增体系
按下列方法配制.PR扩增反成体系：10×PCR缓冲液
5onmol/1. MgCl2
10mmol/L dNTT
上游引物
下游引物
DNA模板（约1Cng）
Tag 酶
无核酸酶水
4.3.5.2.5PCR扩增条件
1. 5 μt.
0. 5 μl.
按下列程进行PCR扩增：先95℃变性2min.然后按95℃变性45s、50℃退火50s、72℃延伸60 $的顺循环，其循环31次，最后在72℃温度下延仲2min，4℃保存，备用。4.3.5.2.6PCR产物电泳
每个样品取10L与上样缓冲液充分混匀，再衔管取5μL加人琼脂糖凝胶板的加样孔.在位丁凝胶中央的孔加人DNA分子量标准。加样后,按照8V/crmn~-l0V/cm电压，电泳 40 min~60 min(每次电泳时，每隔10min观察1次。当加样缓冲液中漠酚蓝电泳过半至凝液下2/5处时.可停止电泳）电泳后,置十紫外凝胶或像仪下观察.用分子量标准判断PCR扩增产物大小，4.3.5.2.7结果判定
单痘病毒阳性对照出现192bp的扩增条带，且阴性对照无此扩增带时,判定检测有效；否卿判定检测结果心效不能进行判断，被检样品出现9品扩增带对单痘病阳性，否则为阴性4.4血清学试验一中和试验法
4.4.1材料
MEM培养液（配制方法见附录A）、缔羊蒸宰丸细胞（制备方法见附录B)、羊痘抗原及阳性而清、待检羊血清，
4.4.2方法
4.4.2.1样品处理
经颈脉无菌采集待检羊血-按常规方泌分离血清，56℃灭能30rmin后备用，4.4.2.2抗原及阳性血清
阳性血清-恢复至室温备用。标定平症抗原满度·并将抗原液用H=iks液进行系列稀释至100T'CHDan/0. 1 ml..
4.4.2.3加样
NY/T 576—20 15
取95孔细胞培养板待检血清、阳性血消各加2孔.每孔c.1mI.，向其中一孔加人等量羊痘抗原（100TCID/0.1mIL.），向另-孔内加入等量Hanks液：羊痘抗原（100TCID/0.1ml）加1孔，每孔0.1ml.再向孔内加人等量Hanks液，作为抗原对照；Hanks液加1孔，每孔0.2ml.作为空自对照：4.4.2.4感作
将96孔细胞培养极摇勾后置于37℃中和1h,期间每15min振播1次。4.4.2.5培养
取生长良好的绵羊羔睾丸细胞跑单层1瓶，按常规方法消化，调整细胞浓度至10个/ml.，每孔接种细胞悬液0.1ml。接种后，置于37℃，5%CO条件下培养。4.4.2.6观察
培养4d~7 d.每天观察CPE情况
4.4.3结果判定
当正常细胞和血清毒性对照孔细胞无CPE.而接种抗原对照孔细胞有明显CPE时，试验成立。待检血清中和后，试验孔细胞出现特征性CPF.判定该血清为羊病毒抗体阴性；待检血消中和后,试验孔细胞未山现 CPE,判定该血消为羊痘病母抗体阳性。注：如果羊痘性i清中和细胞出现CPE，表明阳作血清不能完全中和100TCI>50/0.1ml.的.羊痘抗原、可对关痘抗原浓度进行适当调整再进行中和试验。5
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A 1 Hanks 液(10 ×浓缩液)
A.1.1 成分
A.1.1.1成分甲
氯化钠
氯化钾
氯化钙
硫酸镁(MgS(,·7H0)
A.1.1.2成分乙
磷酸氢二钠(Na:HPO,·12H,O)
磷酸氢钾
葡萄糖
1.0%酚红
A.1.2配制方法
附录A
（规范性附录）
营养液及溶液的配制
按顺序将上述成分分别溶于450ml.注射用水中，即配成甲液和乙液；然后，将乙液级级加人甲液，边加边搅拌。补足注射用水至1000mL，用滤纸过滤后，加人一氯烧2mL，置于2℃～8℃保存A.1.3使用
使用时.用注射用水稀释10倍.107.6kPa火菌15mil.置2℃～8℃保存备用，使而前，月用7.5%碳酸氢钠溶液调H至7.27.4。
A.27.5%碳酸氢钠溶液
A.2.1成分
碳酸氢钠
注射用水
A.2.2配制方法
将上述成分溶解，0.2um滤器滤过除菌.分装十小瓶中，置一20%保存。4.31.0%酚红溶液
A.3.1成分
1mol/1.氢氧化钠溶液不超过
注射用水补足至
A.3.2配制方法
1 coo ml.
1mul/1.氢氧化钠溶液的制备：取澄清的氢氧化钠饱和液56.0ml,如注射用水至1000ml.即可称酚红.10.0g，加1mol/L氢氧化钠溶液20ml..搅拌溶解。静置后.将已溶解的酚红溶液倒人6
VY/T 576—2015
10C0mL容器内，未溶解的酚红继续加人1mol/I.氢氧化钠溶液20 m!.,搅拌使其溶解。如仍未完全溶解，可继续加少量11mol/L氢氧化钠溶液搅拌。如此反复，百至酚红完个溶解，们所加1Iol/L氧氧化钠溶液总量不得超过 60 mL。补足注射用水至1000 m，分装小瓶，107.6kPa灭菊 15 Inin后.置2℃-~8℃保存。
A.40.25%胰蛋白酶溶液
A.4.1成分
氧化钠
氯化钾
柠檬酸钠(Na:CH,(,·5H,O)
磷酸氢钠(NaH,PO,·2H,O)
碳酸氢钠
葡菊糖
胰蛋白酶（I：250）
注射用水加至
A.4.2配制方法
1 000 mL
待胰酶充分溶解后，0.2μm滤器滤过除菌.分装于小瓶中.置于一20%保存。使时，用7.5%碳酸氢钠济液调 pH至 7. 4~7. 6
A.5EDTA-胰蛋白酶分液10×浓缩液）A.5.1成分
氯化钠
氮化钾
葡葡糖
碳酸氢钠
胰蛋白酶（1：250）
乙_胺四乙酸二
按顺序溶于9ComL注射用水中.然后加人下列各液：1.0%酚红溶液
青霉素（10万TU/ml)
链霉素(10万μg/ml)
补足注射用水至
A.5.2配制方法
10. C mL.
100c mL
将上述成分按顺序溶解，0.2um滤器滤过除菌，分装小瓶，\20℃:保存。临用前,瓜注射用水稀释10倍，作为分散T作：适量分装，置于一20°℃冻存备用。分散细胞时，将上作液取出，置丁37℃水浴副化.并用7.5不碳酸氧钠溶液调pH至7.G~8.0.A. 6抗生素溶液(1 万 IU/mL)
A.6.110×浓缩液
青霉素
链霉素
注射用水
400万IU
400万ug
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充分溶解后.0.2pm滤器滤过除菌，分装小瓶·置丁一20℃保存A.6.2工作溶液
取上述10×浓缩液适量，历注射水稀释10倍，分装后置于一20℃保存。A. 7 H-F染色液
A7.1Harris苏木精染液
苏木精
无水乙醇
硫酸铝钾
燕馏水
氨化汞
冰醋酸
10. 0 ml.
先用无水乙醇溶解苏木精，用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，将这两种液休混合后煮沸（约1min），离火后，向该混台液中迅速加人氧化汞，并用坡璃捧搅拌染液直至变为紫红色，爪冷水冷却至牵温。然后，加人冰醋酸片混合均勾，过滤后使用。A.7.2伊红染液
伊红染液有水性和醇游性2种，常用0.5※水溶性伊红染液，配方如下：伊红Y
蒸馏水
冰醋酸
先用少许蒸馏水溶解伊红Y，然后加入个部蒸馏水，玻璃棒搅拌均勾。而冰醋酸将染液调至pH4.5左右:过滤后使用。
A.7.3盐酸一乙醇分化液
浓盐酸
75%艺醇
A.8MEM培养液
A.8.1成分
MEM·I粉培养基按说晰书要求
注射用水
A.8.2配制方法
称取适景十粉培养基，加人注射用水500mL，磁力搅拌使之完全溶解，根据说明书要求补加碳酸氢钠，谷氮酰胺和其他特殊物质，加水定容到终体积-调节pH7.1~7.6.0.22m滤膜过滤除菌，无菌分装.2℃-~8℃保存备用
配制好的培养液用前加人胎牛血清.细胞培养液胎牛血清含为5%-10%，细胞维持液胎牛血消含量为1%~~2%。
A.910%福尔马林溶液
B.1原代细胞制备
附录B
【规范性附录】
绵羊羔睾丸细胞的制备
NY/T 5762015
选取4月龄以内健康雄性绵羊，以无菌于术摘取率丸，剥充翰膜及白膜，剪成1mm~2mm小块.用Hanks液（见A.1)清洗3次~4次。按辜丸纠织量的G倍~-8倍加入0.25头读酶溶液（见A.4).置十37℃水浴消化。待墨丸组织工膨松状，弃去胰酶溶液，用玻璃珠振烯法分散细胞，并爪MFM培养液稀释成每毫升含100万左右细胞数.分装细胞瓶.37℃静置培养，2d～1d即川长成单层。B.2次代细胞制备
取生长良好的原代细胞，弃去生长液.加入原培养液量1/10的EDTA胰酶分散液（见A.5），消化2min~5min。待细胞层呈雪花状时弃去胰酶分散液。加少许MEM培养液吹散细胞，然后按1：？的分种率、补是MFM培养液。混匀、分装细胞瓶，置丁37℃静置培养，细胞传代应不超过5代
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