NY/T 1432-2014
基本信息
标准号： NY/T 1432-2014
中文名称：玉米品种鉴定技术规程 SSR标记法
标准类别：农业行业标准(NY)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
NY/T 1432-2014 玉米品种鉴定技术规程 SSR标记法
NY/T1432-2014
标准压缩包解压密码：www.bzxz.net
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标准内容
ICS 65.020.20
中华人民共和国农业行业标准
NY/T1432--2014
代替NY/T1432--20X17
玉米品种鉴定技术规程
SSR标记法
Protocol for the identification of maize varieties-SSR marker method2014-03-24发布
2014-06-01实施
中华人民共和国农业部
规范性引用文件
术语和定义
仪器设备及试剂
溶液配制
引物信息
参照品种信息
操作程序
10数据记录与统计
11判定规则
附录A（规范性附录）)
附录T（规范性附录)
附录C(规范性附录）
附录 D(资料性附录)
附录F(资料性附录)
附录F(规范性附录）
主要仪器设备及试剂
溶液配制·…
核心引物名单及序列
核心引物相关倍息
参照品种名单及来源bZxz.net
数据统计记录表
NY/T 1432—-2014
NY/T1432—2014
本标准按照GB/T1.12009给的规则起草。请注意本文件的某些内容叫能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准为NY！T14322007玉米品种鉴定DNA指纹方法》的修订版，在品种鉴定过程中参考使用。本标准代替NY/T1432--2007。本标准与NY/T1432--2007相比.除编辑性修改外上要技术变化妖下：
增加了炭光标记毛细管电泳检测（见9.4.2）；增了特定标记的检测（见9.3.1)一：-增加了资料性附录核心引物相关信息、参照品种名单及米源以及规范性附录数据统计记录表(匹附录 1)、附录 F)。
本标准出农业部种了管理局提出。本标准出个国植物新品种测试标准化技术委员会(SAC/IC277)归II。本标准起草单位：北京市农林科学院玉米研究中心、农业部科技发展中心。本标雅正要起卢人：王风格，易红梅、赵久然刘平、张新阴、出红丽、堵苑苑，本标准历次版本发布情况为：
-NY/T14322007
1范围
星SSR标记法
玉米品种鉴定技术规程
NY/T 1432—2014
本标准规定了利用简单重复序列(Sitrplesequece:repeat，SsR）标记法进行主米（Zeama.ysL.）品种鉴定的操作程序、数据记录与统计、判定规则。本标准适门F玉米白交系和单交种的SSR指纹数据采集及品种鉴定，其他杂交种类型及群体和开放授粉品种可参考本标雄，
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应而是必不可少的。凡是注月期的引用义件，仅注口期的版木适用于本文件。凡是不注期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适于本文件。GB/T6682中国实验率用水国家标准3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
核心引物
core prirmer
品种鉴定中优先选用的一套SSR引物，具有多态性高、重复性好等综合特性。3.2
reference variety
蒸照品种
其有所用SSR位点上不同等位变异的品种。参照品种用于辅助确定待测样品的等位变异，校正仪器设备的系统误差。
4原理
由于不同玉米品种遗传组成不同，基因组DNA中简单重复列的重复次数存在差异，这种差异叫通过FCR扩增及电泳方法进行检测从而能够区分不同工来品种5仪器设备及试剂
见附录 A。
6溶液配制
见附录 B。
7引物信息
核心引物名单及序列见附录,核心引物等位变异等关信总参见附录D)。8参照品种信息
参见附录E.
9操作程序
9.1样品制备
HiiKAoNhiKAca
NY/T 1432—2014
送验样品可为种子、苗、叫片、包叶、果穗等纽织或器官。对干米白交系和.单交种.随机数取至少20个个体组成的混合样品进行分析，或百接对至少5个个体单独进行分析；对丁其他杂交种类型，随机数取至少20个个体单独进行分析。9.2DNA提取
CTAB提取法：幼肯或叶片20C1ng~300mg，置于2.0mL离心管，加液氮充分研磨，或取种广充分磨碎，移入2.0ml.离心答；每管加人70L65预热的CTAB提取液后.充分混合.65℃保温f0mim，期间多次颠倒混勾；每管加人等体积的氯甲烷/异戊醇泥合液，充分混合后，静置10tmin；1200g离心15min后.吸取上清液至新离心管.再加人等体积预冷的异内醇.颠倒离心管数次，在一20℃放置30min;1℃，12000g离心10min弃上清液；加入7C%乙醇，旋转离心管数饮，弃去乙醇；将离心管倒立于垫有滤纸的实验台上，率温干燥沉淀6h以上；加人100μ工超纯水或TE綫冲液，充分溶解后备用。SDS提取法：别圾干种子的胚：放人1.5ml.离心管中，加入100uL氯仿后研磨，加人300)μl.SDA提取液，混勾后了1000g离心2min，吸上清液加人预先装有3G0μL异两醇和30uLNaCl溶液的1. 51ml.离心管中，待 DNA 成闭后挑出,经7C%乙醇洗涤后加人200 μL TE缓冲液,待充分溶解后备用
试剂盒提取法：使用经验证适合SSR指纹技术的商业试剂盒，按照试剂盒的使用说明操作。注：以上为推荐的DNA提表方法，其他达到PCR扩增质量要求的ENA提取方法均适用。9.3PCR扩增
9.3.1引物选择
首先选择附录（中前2℃对引物进行检测，当样品问检测的差异位点数小十2时，再选用附录C中后20 对引物进行检测;必要时，进一步选择特定标记迹行检测。9. 3. 2 反应体系
各组分的终浓度如下：每种dNTP0.1mmol/L.正向,度间引物各0.24umol/L，Taa1)NA聚合酶0.04 U/μI.,1XPCR缓冲液(含Mg2.5mmo1/L).LNA溶液 2.5ng/μul：其余以超纯水补足至所需休积。如果PCR过程中不采用热前程序，则反应液上加盖15μI.矿物潮-以防止皮应过程中水分蒸发，9.3.3反应程序
94℃预变性5min,1个循环：94℃变性4Cs60℃退火35s72℃延伸45s.共35个语环：72℃延仲10min.4℃保存
9.4PCR产物检测
9.4.1普通变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)9.4.1.1清洗玻璃板
将玻璃反复擦洗于净.双蒸水擦洗2遍.95%乙醇擦洗2遍干燥，在长板上涂上0.5trL亲和硅烷T作液.带凹错的短板上涂0.5L剥离硅烷工作液：探作过程巾防正两块坡璃板片相污染，9.4.1.2组装电泳版
待玻璃板彻底下燥后组装电泳板，并用水平仪谢平9. 4.1.3灌胶
在100mI.1.5%PAGF胶中加人TEME)和25%过硫酸铵各100uL.迅速混勺后滋胶。待胶流动到下部，在上部轻轻的插人梳子，使其聚合至少1h以上，澈胶时应约速以防止出现气泡。9.4.1.4预电泳
在正被槽(下槽)巾加人1×TBE缓冲液600mI,在负极槽（上槽)加预热至 65℃的I×TBE缓冲液600mL.拨出梳子。在90W恒功率下，预电泳10min20min。9.4. 1.5变性
在20L.PR物中加人4μI.6×加样缓冲腋，混孕后在 PCR 仪上运行变性程序：9C.变性52
min-4℃冷却10min以上。
9.4.1.6电泳
NY/T 1432—2014
月移液器吹吸加样槽，清除气泡和杂质，插人样品梳子。每一个加样孔点入5I.样品，80W恒功率电泳至上部的指小带（二苯青)到达胶板的中部。电泳结束后，小心分开两块玻璃板，凝胶会紧贴在长板上，
注：预期扩增产物片段人小在1i0bp以下时电泳耐间应适当缩短，扩增产物片段大小在300bp以上时电泳时向应适当延长，
9.4.1.7银染
a）固定：固定液中轻轻晃动3min；b）漂洗：双蒸水快速漂洗1次.不超过10s：染色：染色液中染色5min；
漂洗：双燕水快速漂洗，时间不超过105；e)
显影：影液巾轻轻晃动至带纹出现：1）定影：固定液中定影5min;
#）漂洗：双蒸水漂洗lmin。
9.4.2荧光标记毛细管电泳
9. 4.2. 1样品制备
等体积混合不同荧光标记扩增产物，混勾后从混台液中吸取1L加人到DNA分析仪专用96孔板孔巾。板中各孔分别加0.l.分了量内标和8.9μ.去离子甲酰胺。将样品在PCR仪工95℃变性5min.取出，立即置于碎冰上，冷印10min以上。离心10s后胃放到DNA分析仪上，9.4.2.2电泳检测
按照仪器操作手册·编辑样品表，执行运行程序，保存数据，10数据记录与统计
10.1数据记录
对普通变性案丙烯酰胺凝胶电泳，将每个扩增位点的等位变异与参照品种的等位变异片段大小逊行比较，确定样品在该位点的等位变异；对荧光标记毛细管电泳，通过参照品种消除同型号不同批次问或不同型号DNA分析仪间可能存在的系统误差·使用片段分析软件读取样品在该位点的等位变异。纯合位点的基型数据记录为X/X.杂合位点的基因型数据记录为X/Y,其中X,Y分别为该位点上两个等位变异，小片段数据在前，大片段数据在后；缺失位点基因型数据记录为C/0，示例1：
样品在某个位点 L仅出现一个等位变异,大小为 150 bp,在该位点的基因型记录为 150/150,示例2：
样品在某个位点上有两个等位变异-大小分别为150bp,160bp:在该位点的基因型记录为150/16010.2数据统计
当对送验样品混合A逊行分析时.可直接进行品种间成对比较，如果样品某个引物位点出现川见的异质性且影响到差异位点判定时，可重新提取至少20个个体的1DNA，并用该引物重新护增，统计在该引物位点上不同个体的基因型(或等位变异)及所占比例。当对送检样品多个个休DNVA逝行分析时，应统计其在各引物位点的各种基因型（或等位变只）及所占比例。对单交种，应比较两个样品在各号物位点的基因型；对白交系·应比较两个样品在各引物位点的等位变异。成对比较的数据统计记录表见附录F，11判定规则
11.1结果判定
iiKAoNhiKAca
NY/T1432--2014
当样品间异位点数2，判定为“不同”，当样品间差异位点数=1，判定为近似”，当样品问差另位点数=U.判定为“极近似或相同”对利用附录C中10对引物仍未检测到2个差异位点数的样品，如果相关品种存在特定标记，必要时增加具其特定标记逆行检测。11.2结果表述
比较位点数：
+比较位点为：
;差异位点数：
-差异位点为：
;判定
A.1主要仪器设备
A.1.1 PCR护增仪。
附录A
(规范性附录）
主要仪器设备及试剂
NY/T 14322014
4.1.2高压电泳仪：规格为3000V.400mA，400W，具有恒电压，恒电流和恒功率功能。A1.3垂直电泳槽及配套的制胶附件。A.1.4普通电泳仪。
A1.5水平电泳槽及配您的制胶附件。A.1.6高速冷冻离心机：最大离心力不小于15(0g。A.1.7水平摇床。
A.1.8胶片观察灯。
A.1.9电子天平：应为0.01g、0.001g.A. 1. 10
微量移液器：规格分别为10μl.20μL,100μ2C0μl1000,连续可调。A.1.11磁力搅拌器。
紫外分光光度计：波长260mm.280mmml.微波炉。
高压灭菌锅。
5酸度计。
A.1.16水浴锅或金属浴：控温精度士1℃A. 1. 17
冰箱;最低温度一20℃
制冰机、
子凝胶成像系统或紫外透射仪。DNA分析仪：基于毛细管屯泳，有片段分析功能和数据分析软件，能够分辨1个核百酸大小A. 1. 20
的差异。
A.2主要试剂
A.2. 1 六烷4二乙基溴化铵(CTAB)。A.2.2一氯甲烷。
A.2.3异内醇。
A.2.4异戊醇。
A2.5乙二胺四乙酸二钠
A.2.6一羟甲基氨基甲烷。
A.2.7盐酸：37%。
A.2.8氢氧化钠。
iiiKAoNhiKAca
NY/T1432--2014
氯化钠
10XBuifer 缓冲液:含 Mg-25rrinul/L4种脱氧核H三磷酸：dATP、dT\IP、dGTP.dCTP(Iommol/I.cach)。TalNA聚合酶。
矿物油。
琼脂糖。
DNA分广量标准.
核酸染色剂。
去离子巾酰胺。
澳酚蓝。
二甲苯青。
甲义双丙烯酰胺。
丙烯酰胺。
硼酸，
尿素。
亲和硅烷。
剥离硅烷。
尤水乙醇。
四巾基乙二胺。
过硫酸饺。
冰醋酸.
艺酸铵。
硝酸银，
巾醛，
INA分析仪专用两烯酰胺胶液。
NA分析仪专用分子量内标Iiz标记：A.2.35
DNA分析仪专用电沫缓冲液
B.1DNA提取溶液的配制
B. 1. 10. 5 mol/ L EDTA 溶液附录B
(规范性附录）
溶液配制
NY/T 14322014
186.1 g NFDTA·2H:0溶T 800 ml.水中,JI固体 NaOH调pH至 8. 0,定容至 1 0G0 ml..高压灭菌。
B. 1. 21 mnl/I Tris-HCI 溶液60.55gTris碱溶丁适量水中，加IICl调pH至8.0定容至50Cml..高压灭菌，B. 1. 30. 5 mol/ L HCI 溶液
25mL浓盘盐酸.3%~-38%）,加水定穿至50ml.B.1.4CTAB提取液
81.7 g氯化钠和 20 g CTAB济F适量水中,然后加人 1 mol/ L 丁ris-HCl 1(00 nL,0. 5 nol/ 1,FDTA40nL，定容至1000mL.4℃贮存B. 1. 5 SDS 提取液
1 mol/L Tris-HCl 50 mL.0. 5 mol/L EDTA 50 ml.,5 mol/I. NaCI 50 mL,SIS 7. 5 g+定至 500ml.。
B.1.6TE缓冲液
1 mol/1 Tris-HCl 5 ml,0. 5 mol/L ETA 1 mL加 HCl 谢 nH 至 8. C.家容至 5o0 mLB. 1. 7 5 mul/ L NaCI 溶液
146 g固体 Nal溶于水中,加水定容垒 500 ml.。B.2PCR 扩增溶液的配制
B. 2. 1 dNTP
用超纯水分别配制A.G.C、T终整浓度100mmol/l的储有液。各取20μul.混合用超纯水720ul定容至终浓度2.5mmol/I.each的工作液。B. 2. 2SSR 引物
用超纯水分别配制前引物和后引物终浓度均10μumo1/1.的储存液，等体积混合成20mol/1.的T作液。
注；十粉配制前应首先快速离心。B.2.36×加样缓冲液
去离子甲酰胺49 mL,0.5mol/L的EDTA游液（pH8.0)1mL.溴酚蓝0.125g：甲苯青C.125g。B.3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制B.3.140%PAGE胶
丙烯酰胺190g和甲叉双丙烯酰胺10g，定容至500m1.。B.3.24.5% PAGE胶
iiiKAoNiKAca
NY/T 1432-—2014
尿素450g-10×TBE缓冲液100tnL.40%PAGF胶112.5ml,定穿至1000mL.B.3.3Bind缓冲液
49.75mL元水醇和250L冰醋酸.加水定容至50ml.B.3.4亲和硅烷工作液
在1 mL Bind缓冲液中加人 5uL Bind原液，混匀。B.3.5剥离硅烷工作液
2路一基一氯硅烷。
525%过硫酸铵溶液
0. 25 g过硫酸铵溶于 1 tml. 超纯水中。B.3.710×TBE缓冲液
一羟巾基氨基印烷(Tris喊)108g，硼酸55g,0.5mol/1.FDTA溶液37ml定容盒1000ml.。81×TEE缓冲液
取10×TBF缓冲液500mL,加水定容至5000mL，B.4银染溶液的配制
B.4. 1固定液
100 ml.冰醋酸·加水定容至1000) tnL。B.4.2染色液
称联2g硝酸银，加水定容至1000ml：B.4.3显影液
量取1000ml.蒸馏馅水中，加人30g氢氧化钠和5mL甲醛，混匀。注：除染辫被的配制可使用符合GI/16682规定的三级水外·试验中仅使用确认为分析纯的试剂和（3/16682规定的一级水。
核心引物名单及序列见表心1
引物名称
hnig439wl
ume1335y5
iime2007y1
bnlg1940k?
umc2105k3
phi053k2
phi072k4
bnlg2291k4
ume1705wl
hnlg2303k4
bn:gl61k8
bnlg1702k1
um1545y2
umci125y3
hnlg240ki
phi080k15
phi06skg
ume119213
uie1432y6
附录℃
【规范性附录】
核心引物名单及序列
染色体位置
核心引物名单及序列
引物序列
F:游:AGTIGACATCGCCATCTTGGTGAC下游:GAACAAGCOCTTAGCGGGTTGTCF游:OCTCGTTACGGTTAOGCTGCTG
下游:GATGAXTGCTTACTTCGTTTATG上游：TTACACAACGCAACACGAGGC
NY/T1432—2014
下游:GCTATAGGXGTAGCITGGTAGACAC上游:CTTTAAGAACGGTTGATTGGATTCCF游GCCTITATTICIUCCTTGCTTGCC
L谢:GAAGGGCAATGAATAGAGCLCATGAGF游:ATGGACTCTGTGCGACTTGTACCGL:CCCTGCCTLICAGATICAGAGATTG
下游: TAGGCTGGCTGGAAGTTTGTIGC上游:CTUGTCTCTCEAGGTCAGG
下游:CGTTGCCCATACATGATGCETC
上:GCACACCCGTAGTAGCTGAGACTTG下游:CATAAOTTGCCICECAAACC
上游:GGAGGTOGTCAGATGGAGTICG
于游:CACGTACGGCAATGCAGACAAG
:OCCTGTTCCTTAGCACCITG
下游:XTCTIGTCTCXTCCGTGTG
H游:TCICAGCTCCTGCITATTGCTTIOG下游:GATGGATGGAGCATGAGCTTGC
上游:GATCCGCATTGTCAAATGACCACF游:AGGACAXCATUXTCATCA
上游AATGXGTTATCATGXATGC
F游:GCIIGCIGCTICTTGAATTIGCGTF游;GGATGATGGCGAGGAIGATGIC
F:CCACCAACCCATACCLATACCAG
上游;GCAGGTGIUGGGGATTTTLTC
F:GGAACTGAAGAACAGAAGGCATIGATAC上游：TGAACCACUGATGCAACIIG
下游: TTGATGGGCACGATCTOXTAGTC 上游:CGCCTTCAAGAATATTCTTGTGT下游:GGALCCAGACCAGGTTCEACC
上游;GCGGAAGAGTAGTCGTAGGGCTAGTGTAGF游:AACCAAGTFCTTCAGAOGCTTCAGG上游:GAGAAATCAAGAGGTGCGAGCATC下游:GGCCATGATACAGCAAGAAATGATAAGC9
TiiKAoNiKAca
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中华人民共和国农业行业标准
NY/T1432--2014
代替NY/T1432--20X17
玉米品种鉴定技术规程
SSR标记法
Protocol for the identification of maize varieties-SSR marker method2014-03-24发布
2014-06-01实施
中华人民共和国农业部
规范性引用文件
术语和定义
仪器设备及试剂
溶液配制
引物信息
参照品种信息
操作程序
10数据记录与统计
11判定规则
附录A（规范性附录）)
附录T（规范性附录)
附录C(规范性附录）
附录 D(资料性附录)
附录F(资料性附录)
附录F(规范性附录）
主要仪器设备及试剂
溶液配制·…
核心引物名单及序列
核心引物相关倍息
参照品种名单及来源bZxz.net
数据统计记录表
NY/T 1432—-2014
NY/T1432—2014
本标准按照GB/T1.12009给的规则起草。请注意本文件的某些内容叫能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准为NY！T14322007玉米品种鉴定DNA指纹方法》的修订版，在品种鉴定过程中参考使用。本标准代替NY/T1432--2007。本标准与NY/T1432--2007相比.除编辑性修改外上要技术变化妖下：
增加了炭光标记毛细管电泳检测（见9.4.2）；增了特定标记的检测（见9.3.1)一：-增加了资料性附录核心引物相关信息、参照品种名单及米源以及规范性附录数据统计记录表(匹附录 1)、附录 F)。
本标准出农业部种了管理局提出。本标准出个国植物新品种测试标准化技术委员会(SAC/IC277)归II。本标准起草单位：北京市农林科学院玉米研究中心、农业部科技发展中心。本标雅正要起卢人：王风格，易红梅、赵久然刘平、张新阴、出红丽、堵苑苑，本标准历次版本发布情况为：
-NY/T14322007
1范围
星SSR标记法
玉米品种鉴定技术规程
NY/T 1432—2014
本标准规定了利用简单重复序列(Sitrplesequece:repeat，SsR）标记法进行主米（Zeama.ysL.）品种鉴定的操作程序、数据记录与统计、判定规则。本标准适门F玉米白交系和单交种的SSR指纹数据采集及品种鉴定，其他杂交种类型及群体和开放授粉品种可参考本标雄，
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应而是必不可少的。凡是注月期的引用义件，仅注口期的版木适用于本文件。凡是不注期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适于本文件。GB/T6682中国实验率用水国家标准3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
核心引物
core prirmer
品种鉴定中优先选用的一套SSR引物，具有多态性高、重复性好等综合特性。3.2
reference variety
蒸照品种
其有所用SSR位点上不同等位变异的品种。参照品种用于辅助确定待测样品的等位变异，校正仪器设备的系统误差。
4原理
由于不同玉米品种遗传组成不同，基因组DNA中简单重复列的重复次数存在差异，这种差异叫通过FCR扩增及电泳方法进行检测从而能够区分不同工来品种5仪器设备及试剂
见附录 A。
6溶液配制
见附录 B。
7引物信息
核心引物名单及序列见附录,核心引物等位变异等关信总参见附录D)。8参照品种信息
参见附录E.
9操作程序
9.1样品制备
HiiKAoNhiKAca
NY/T 1432—2014
送验样品可为种子、苗、叫片、包叶、果穗等纽织或器官。对干米白交系和.单交种.随机数取至少20个个体组成的混合样品进行分析，或百接对至少5个个体单独进行分析；对丁其他杂交种类型，随机数取至少20个个体单独进行分析。9.2DNA提取
CTAB提取法：幼肯或叶片20C1ng~300mg，置于2.0mL离心管，加液氮充分研磨，或取种广充分磨碎，移入2.0ml.离心答；每管加人70L65预热的CTAB提取液后.充分混合.65℃保温f0mim，期间多次颠倒混勾；每管加人等体积的氯甲烷/异戊醇泥合液，充分混合后，静置10tmin；1200g离心15min后.吸取上清液至新离心管.再加人等体积预冷的异内醇.颠倒离心管数次，在一20℃放置30min;1℃，12000g离心10min弃上清液；加入7C%乙醇，旋转离心管数饮，弃去乙醇；将离心管倒立于垫有滤纸的实验台上，率温干燥沉淀6h以上；加人100μ工超纯水或TE綫冲液，充分溶解后备用。SDS提取法：别圾干种子的胚：放人1.5ml.离心管中，加入100uL氯仿后研磨，加人300)μl.SDA提取液，混勾后了1000g离心2min，吸上清液加人预先装有3G0μL异两醇和30uLNaCl溶液的1. 51ml.离心管中，待 DNA 成闭后挑出,经7C%乙醇洗涤后加人200 μL TE缓冲液,待充分溶解后备用
试剂盒提取法：使用经验证适合SSR指纹技术的商业试剂盒，按照试剂盒的使用说明操作。注：以上为推荐的DNA提表方法，其他达到PCR扩增质量要求的ENA提取方法均适用。9.3PCR扩增
9.3.1引物选择
首先选择附录（中前2℃对引物进行检测，当样品问检测的差异位点数小十2时，再选用附录C中后20 对引物进行检测;必要时，进一步选择特定标记迹行检测。9. 3. 2 反应体系
各组分的终浓度如下：每种dNTP0.1mmol/L.正向,度间引物各0.24umol/L，Taa1)NA聚合酶0.04 U/μI.,1XPCR缓冲液(含Mg2.5mmo1/L).LNA溶液 2.5ng/μul：其余以超纯水补足至所需休积。如果PCR过程中不采用热前程序，则反应液上加盖15μI.矿物潮-以防止皮应过程中水分蒸发，9.3.3反应程序
94℃预变性5min,1个循环：94℃变性4Cs60℃退火35s72℃延伸45s.共35个语环：72℃延仲10min.4℃保存
9.4PCR产物检测
9.4.1普通变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)9.4.1.1清洗玻璃板
将玻璃反复擦洗于净.双蒸水擦洗2遍.95%乙醇擦洗2遍干燥，在长板上涂上0.5trL亲和硅烷T作液.带凹错的短板上涂0.5L剥离硅烷工作液：探作过程巾防正两块坡璃板片相污染，9.4.1.2组装电泳版
待玻璃板彻底下燥后组装电泳板，并用水平仪谢平9. 4.1.3灌胶
在100mI.1.5%PAGF胶中加人TEME)和25%过硫酸铵各100uL.迅速混勺后滋胶。待胶流动到下部，在上部轻轻的插人梳子，使其聚合至少1h以上，澈胶时应约速以防止出现气泡。9.4.1.4预电泳
在正被槽(下槽)巾加人1×TBE缓冲液600mI,在负极槽（上槽)加预热至 65℃的I×TBE缓冲液600mL.拨出梳子。在90W恒功率下，预电泳10min20min。9.4. 1.5变性
在20L.PR物中加人4μI.6×加样缓冲腋，混孕后在 PCR 仪上运行变性程序：9C.变性52
min-4℃冷却10min以上。
9.4.1.6电泳
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月移液器吹吸加样槽，清除气泡和杂质，插人样品梳子。每一个加样孔点入5I.样品，80W恒功率电泳至上部的指小带（二苯青)到达胶板的中部。电泳结束后，小心分开两块玻璃板，凝胶会紧贴在长板上，
注：预期扩增产物片段人小在1i0bp以下时电泳耐间应适当缩短，扩增产物片段大小在300bp以上时电泳时向应适当延长，
9.4.1.7银染
a）固定：固定液中轻轻晃动3min；b）漂洗：双蒸水快速漂洗1次.不超过10s：染色：染色液中染色5min；
漂洗：双燕水快速漂洗，时间不超过105；e)
显影：影液巾轻轻晃动至带纹出现：1）定影：固定液中定影5min;
#）漂洗：双蒸水漂洗lmin。
9.4.2荧光标记毛细管电泳
9. 4.2. 1样品制备
等体积混合不同荧光标记扩增产物，混勾后从混台液中吸取1L加人到DNA分析仪专用96孔板孔巾。板中各孔分别加0.l.分了量内标和8.9μ.去离子甲酰胺。将样品在PCR仪工95℃变性5min.取出，立即置于碎冰上，冷印10min以上。离心10s后胃放到DNA分析仪上，9.4.2.2电泳检测
按照仪器操作手册·编辑样品表，执行运行程序，保存数据，10数据记录与统计
10.1数据记录
对普通变性案丙烯酰胺凝胶电泳，将每个扩增位点的等位变异与参照品种的等位变异片段大小逊行比较，确定样品在该位点的等位变异；对荧光标记毛细管电泳，通过参照品种消除同型号不同批次问或不同型号DNA分析仪间可能存在的系统误差·使用片段分析软件读取样品在该位点的等位变异。纯合位点的基型数据记录为X/X.杂合位点的基因型数据记录为X/Y,其中X,Y分别为该位点上两个等位变异，小片段数据在前，大片段数据在后；缺失位点基因型数据记录为C/0，示例1：
样品在某个位点 L仅出现一个等位变异,大小为 150 bp,在该位点的基因型记录为 150/150,示例2：
样品在某个位点上有两个等位变异-大小分别为150bp,160bp:在该位点的基因型记录为150/16010.2数据统计
当对送验样品混合A逊行分析时.可直接进行品种间成对比较，如果样品某个引物位点出现川见的异质性且影响到差异位点判定时，可重新提取至少20个个体的1DNA，并用该引物重新护增，统计在该引物位点上不同个体的基因型(或等位变异)及所占比例。当对送检样品多个个休DNVA逝行分析时，应统计其在各引物位点的各种基因型（或等位变只）及所占比例。对单交种，应比较两个样品在各号物位点的基因型；对白交系·应比较两个样品在各引物位点的等位变异。成对比较的数据统计记录表见附录F，11判定规则
11.1结果判定
iiKAoNhiKAca
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当样品间异位点数2，判定为“不同”，当样品间差异位点数=1，判定为近似”，当样品问差另位点数=U.判定为“极近似或相同”对利用附录C中10对引物仍未检测到2个差异位点数的样品，如果相关品种存在特定标记，必要时增加具其特定标记逆行检测。11.2结果表述
比较位点数：
+比较位点为：
;差异位点数：
-差异位点为：
;判定
A.1主要仪器设备
A.1.1 PCR护增仪。
附录A
(规范性附录）
主要仪器设备及试剂
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4.1.2高压电泳仪：规格为3000V.400mA，400W，具有恒电压，恒电流和恒功率功能。A1.3垂直电泳槽及配套的制胶附件。A.1.4普通电泳仪。
A1.5水平电泳槽及配您的制胶附件。A.1.6高速冷冻离心机：最大离心力不小于15(0g。A.1.7水平摇床。
A.1.8胶片观察灯。
A.1.9电子天平：应为0.01g、0.001g.A. 1. 10
微量移液器：规格分别为10μl.20μL,100μ2C0μl1000,连续可调。A.1.11磁力搅拌器。
紫外分光光度计：波长260mm.280mmml.微波炉。
高压灭菌锅。
5酸度计。
A.1.16水浴锅或金属浴：控温精度士1℃A. 1. 17
冰箱;最低温度一20℃
制冰机、
子凝胶成像系统或紫外透射仪。DNA分析仪：基于毛细管屯泳，有片段分析功能和数据分析软件，能够分辨1个核百酸大小A. 1. 20
的差异。
A.2主要试剂
A.2. 1 六烷4二乙基溴化铵(CTAB)。A.2.2一氯甲烷。
A.2.3异内醇。
A.2.4异戊醇。
A2.5乙二胺四乙酸二钠
A.2.6一羟甲基氨基甲烷。
A.2.7盐酸：37%。
A.2.8氢氧化钠。
iiiKAoNhiKAca
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氯化钠
10XBuifer 缓冲液:含 Mg-25rrinul/L4种脱氧核H三磷酸：dATP、dT\IP、dGTP.dCTP(Iommol/I.cach)。TalNA聚合酶。
矿物油。
琼脂糖。
DNA分广量标准.
核酸染色剂。
去离子巾酰胺。
澳酚蓝。
二甲苯青。
甲义双丙烯酰胺。
丙烯酰胺。
硼酸，
尿素。
亲和硅烷。
剥离硅烷。
尤水乙醇。
四巾基乙二胺。
过硫酸饺。
冰醋酸.
艺酸铵。
硝酸银，
巾醛，
INA分析仪专用两烯酰胺胶液。
NA分析仪专用分子量内标Iiz标记：A.2.35
DNA分析仪专用电沫缓冲液
B.1DNA提取溶液的配制
B. 1. 10. 5 mol/ L EDTA 溶液附录B
(规范性附录）
溶液配制
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186.1 g NFDTA·2H:0溶T 800 ml.水中,JI固体 NaOH调pH至 8. 0,定容至 1 0G0 ml..高压灭菌。
B. 1. 21 mnl/I Tris-HCI 溶液60.55gTris碱溶丁适量水中，加IICl调pH至8.0定容至50Cml..高压灭菌，B. 1. 30. 5 mol/ L HCI 溶液
25mL浓盘盐酸.3%~-38%）,加水定穿至50ml.B.1.4CTAB提取液
81.7 g氯化钠和 20 g CTAB济F适量水中,然后加人 1 mol/ L 丁ris-HCl 1(00 nL,0. 5 nol/ 1,FDTA40nL，定容至1000mL.4℃贮存B. 1. 5 SDS 提取液
1 mol/L Tris-HCl 50 mL.0. 5 mol/L EDTA 50 ml.,5 mol/I. NaCI 50 mL,SIS 7. 5 g+定至 500ml.。
B.1.6TE缓冲液
1 mol/1 Tris-HCl 5 ml,0. 5 mol/L ETA 1 mL加 HCl 谢 nH 至 8. C.家容至 5o0 mLB. 1. 7 5 mul/ L NaCI 溶液
146 g固体 Nal溶于水中,加水定容垒 500 ml.。B.2PCR 扩增溶液的配制
B. 2. 1 dNTP
用超纯水分别配制A.G.C、T终整浓度100mmol/l的储有液。各取20μul.混合用超纯水720ul定容至终浓度2.5mmol/I.each的工作液。B. 2. 2SSR 引物
用超纯水分别配制前引物和后引物终浓度均10μumo1/1.的储存液，等体积混合成20mol/1.的T作液。
注；十粉配制前应首先快速离心。B.2.36×加样缓冲液
去离子甲酰胺49 mL,0.5mol/L的EDTA游液（pH8.0)1mL.溴酚蓝0.125g：甲苯青C.125g。B.3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制B.3.140%PAGE胶
丙烯酰胺190g和甲叉双丙烯酰胺10g，定容至500m1.。B.3.24.5% PAGE胶
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尿素450g-10×TBE缓冲液100tnL.40%PAGF胶112.5ml,定穿至1000mL.B.3.3Bind缓冲液
49.75mL元水醇和250L冰醋酸.加水定容至50ml.B.3.4亲和硅烷工作液
在1 mL Bind缓冲液中加人 5uL Bind原液，混匀。B.3.5剥离硅烷工作液
2路一基一氯硅烷。
525%过硫酸铵溶液
0. 25 g过硫酸铵溶于 1 tml. 超纯水中。B.3.710×TBE缓冲液
一羟巾基氨基印烷(Tris喊)108g，硼酸55g,0.5mol/1.FDTA溶液37ml定容盒1000ml.。81×TEE缓冲液
取10×TBF缓冲液500mL,加水定容至5000mL，B.4银染溶液的配制
B.4. 1固定液
100 ml.冰醋酸·加水定容至1000) tnL。B.4.2染色液
称联2g硝酸银，加水定容至1000ml：B.4.3显影液
量取1000ml.蒸馏馅水中，加人30g氢氧化钠和5mL甲醛，混匀。注：除染辫被的配制可使用符合GI/16682规定的三级水外·试验中仅使用确认为分析纯的试剂和（3/16682规定的一级水。
核心引物名单及序列见表心1
引物名称
hnig439wl
ume1335y5
iime2007y1
bnlg1940k?
umc2105k3
phi053k2
phi072k4
bnlg2291k4
ume1705wl
hnlg2303k4
bn:gl61k8
bnlg1702k1
um1545y2
umci125y3
hnlg240ki
phi080k15
phi06skg
ume119213
uie1432y6
附录℃
【规范性附录】
核心引物名单及序列
染色体位置
核心引物名单及序列
引物序列
F:游:AGTIGACATCGCCATCTTGGTGAC下游:GAACAAGCOCTTAGCGGGTTGTCF游:OCTCGTTACGGTTAOGCTGCTG
下游:GATGAXTGCTTACTTCGTTTATG上游：TTACACAACGCAACACGAGGC
NY/T1432—2014
下游:GCTATAGGXGTAGCITGGTAGACAC上游:CTTTAAGAACGGTTGATTGGATTCCF游GCCTITATTICIUCCTTGCTTGCC
L谢:GAAGGGCAATGAATAGAGCLCATGAGF游:ATGGACTCTGTGCGACTTGTACCGL:CCCTGCCTLICAGATICAGAGATTG
下游: TAGGCTGGCTGGAAGTTTGTIGC上游:CTUGTCTCTCEAGGTCAGG
下游:CGTTGCCCATACATGATGCETC
上:GCACACCCGTAGTAGCTGAGACTTG下游:CATAAOTTGCCICECAAACC
上游:GGAGGTOGTCAGATGGAGTICG
于游:CACGTACGGCAATGCAGACAAG
:OCCTGTTCCTTAGCACCITG
下游:XTCTIGTCTCXTCCGTGTG
H游:TCICAGCTCCTGCITATTGCTTIOG下游:GATGGATGGAGCATGAGCTTGC
上游:GATCCGCATTGTCAAATGACCACF游:AGGACAXCATUXTCATCA
上游AATGXGTTATCATGXATGC
F游:GCIIGCIGCTICTTGAATTIGCGTF游;GGATGATGGCGAGGAIGATGIC
F:CCACCAACCCATACCLATACCAG
上游;GCAGGTGIUGGGGATTTTLTC
F:GGAACTGAAGAACAGAAGGCATIGATAC上游：TGAACCACUGATGCAACIIG
下游: TTGATGGGCACGATCTOXTAGTC 上游:CGCCTTCAAGAATATTCTTGTGT下游:GGALCCAGACCAGGTTCEACC
上游;GCGGAAGAGTAGTCGTAGGGCTAGTGTAGF游:AACCAAGTFCTTCAGAOGCTTCAGG上游:GAGAAATCAAGAGGTGCGAGCATC下游:GGCCATGATACAGCAAGAAATGATAAGC9
TiiKAoNiKAca
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