NY/T 2467-2013
基本信息
标准号： NY/T 2467-2013
中文名称：高粱品种鉴定技术规程 SSR分子标记法
标准类别：农业行业标准(NY)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
下载格式：.rar .pdf
下载大小：539KB
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
NY/T 2467-2013 高粱品种鉴定技术规程 SSR分子标记法
NY/T2467-2013
标准压缩包解压密码：www.bzxz.net
标准图片预览
标准内容
1CS 65.020.20
中华人民共和国农业行业标准
NY/T2467—2013
高梁品种鉴定技术规程
SSR分子标记法
Protocol for identification of sorghum varieties--SsR marker method2013-12-13发布
2014-04-01实施
中华人民共和国农业部
2规范性引用文件
3术语和定义
仪器设备及试剂
溶液配制
引物信息
参照品种信息
操作程序
等位变异数据记录与统计…
11判定然
附录A（规范性附录）主要仪器设备及试剂附录B(规范性附录）溶液配制·附录(（规范性附录）
核心引物·
附录D(资料性附录)
核心引物相关信息
NY/T 2467—2013
NY/T2467-2013
本标准按照GB/T1.1—2009给的规则起草，谐注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标由农业部种子管理局提出。本标准由全国植物新品种测试标准化技术委员会（SAC/TC277)归。本标准起草单位：古林省农业科学院、农业部科技发展中心本标雄主要起草人，李晓辉、王风华、张春宵、张学军、周海涛、郝彩环、李淑势、刘艳芝、陶蕊、李力军、徐。
1范围
高粱品种鉴定技术规程SSR分子标记法NY/T 2467—2013
本标准规定了利用简单重复序列（simplescrjucnccrcxals，SsR）标记法进行高梁[Sorghumtbirotor(L.)Moench品种鉴定的操作程序、等位变异数据记录与统计、判定方法。本标准适用于高粱品种的SSR指纹数据采集和品种鉴定规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注口期的版本适用十本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本标准。CB 4404.1粮食作物种子禾荐类
GB/T3543.2农竹物种子检验规程扦样GH/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19557.1植物新品种特异性、--致性和稳定性测试指南总则3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件，3.1
品种vamiety
己知最低·级植物分类单位中的一个类群.不论是否充分满足植物新品种权的投权条件，该类群应该是：
通过某一特定的基因或基因型组合所表达的特征来界定；通过至少，种上述特征的表达，与任何其他植物类群存所区别：“--经过繁殖后其适应性未变的一个单位、[GB/T19557.1--2(004.定义3.]
核心引物corepriuner
品种鉴定中优先选用的套SSR引物，其检测位点多态性高，检测结果复性好，3.3
参照品种referencevariety
具有所用SSR位点上不同等位变异的品种。川于辅助确定待测样品的等位变异，校正仪器设备的系统误差
4原理
由于不同高粱品种遗传组成不同，基内红DNA存在简单重复序列的重复次数差异。这种差可通过PCR扩增及电泳方法进行检测，从而能够区分不间高粱品种。5仪器设备及试剂
见附录A。
iiKAoNiKAca
NY/T2467--2013
6溶液配制
见附录B。
7引物信息
核心引物名单及序列见附录C,核心引物等位变异等相关信息参见附录D8参照品种信息
参见附录 D，
9操作程序
9.1样品准备
样品材料可为种子、幼嫩叶片等组织或器官。试验样品为种子时，其质量应符合GB1101.1中对高粱种子纯度的要求。
种子样品的分样和保存，应符合GB/T3543.2的规定。应分析20个以.土个体的混合样品，或至少；个个体（种子、叶片或其他等效物)的单个样品。9.2DNA提取
9.2.1称取适量样品，液氮下迅逑磨成粉术。9.2.2将粉末转人2.0mLEppcndorf管中.加人700μl.65C预热的CTAB缓冲液,并使其混勺。9.2.365℃水浴加热45min,不断地轻轻倒转摇动。水浴后，取出离心管,冷却分室漏。9.2.4通风橱下加人700μl.的氯仿一异戊醇（24：1)轻轻转摇动5tmin～10)min。9.2.512000g（室温）离心10rrin，用去头枪尖将上清液转至1个新的2.0ml.EppendorF管ft。9.2.6加入10μLRNA酶溶液（10mg/mL).37C下温浴30min9.2.7重复9.2.4~9.2.5步骤
9.2.8加人一20℃预冷的异丙醇(1倍体积)或无水乙醇(2倍休积)于2.0 mLEppendorf 管,轻轻混句。一20℃冰箱静置一段吋间后，至DNA凝集室温下钩山DNA。9.2.976%乙醇洗涤2次（其中次可过夜）。洗涤完毕后，将DNA惊T。9.2.10加入适量的1×TF(pII 8. 0)溶解丁试管中,4℃ 下保存各用9.2.11 将 DNA原液十 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测质量(DI,2000 为Markcr)。20%下保存备用。注1:利用种了幼芦，值株幼嫩叶片等组织或器官提取DNA均可，组鉴于高凝的种产籽粒较小，本标准推荐使用幼萌；
注2：上述DKA提取方法为标准抵荐使用的,其他能够达到PCR扩增质量要求的INA提取方法均可来用。9.3PCR扩增
9.3.1引物选择
百先选择附录C中前20对;物进行扩增，当样品问检测出的差异位点数小于2时.再选用附录（中后20对引物进行检测。
9. 3. 2 反应体系
10μL的反应体积，含每种dNTP0.i0tnol/L，正向、反向引物各0.24μmol/1.,TagDNA聚合酶0.4U,1X×PCR缓冲液（含Mg-2.5rnmo1/L），样品DNA20ng~20g，其余以超纯水补足至所需休积，如果PCR过程中不采用热盖程序，则反应液上加盖15L矿物油，以防止反应过程十水分蒸发。9. 3. 3反应程序
94℃预变性5ni11,1个循环：94℃变性45s,55℃退火45$.72℃延伸60s.共36个循环：72℃延伸2
10min，4℃保存。
9.4电泳检测
9.4.1普通变性聚丙烯酰胺凝胶电泳9.4.1.1灌胶板制作
NY/T2467—2013
肯先严格地将玻璃板洗净，再刃蒸馏水冲洗并擦十，然后用95%酒精擦拭，最后在母板上均勾涂2ml～3ml亲和硅烷工作液，槽板上涂2mI.~3ml.剥离硅烷。放置10min以.上，让其充分晾干，操作过程中防止两块玻璃板相片污染。9.4.1.2组装玻璃板
待玻璃板御底干燥后组装电泳板，并闲水平仪调平。9.4.1.3灌胶
在50mL.6%PAGE胶中加人TEMED65L和25%的过硫酸铵250uL.迅速混句后灌胶。待胶液流动到下部，在工部轻轻插人梳子，使其凝聚至少1h以上。灌胶过程中防止出现气泡。9.4.1.4预电泳
在正极槽（下槽）加人1×TBE缓冲液600nL.在负极槽（.上槽)中加人0.5×TBE缓冲液600ml.拨出梳F。80W恒功率预电泳30min~40min。9.4.1.5样品制备
10LPCR扩增样品加人3μ.6×加样缓冲液，混勾后，在94℃变性10min，迅速川冰水浴冷却：并于一20℃冰箱中冷却10min以上
9.4.1.6电泳
用移器吹吸加样槽，清除残胶和气泡，插入样品梳子，每：个加样孔点入4μL样品。70W恒功率电泳至上部的指示带（..甲苯青）达到胶板的中部（151nin~50min）。电泳结束后，小心分开两块坡璃板，胶会紧贴在涂亲和硅烷的坡璃板上。9.4.1.7银染
9.4.1.7.1固定
将凝胶板置于装有固定液的塑料盒内，轻轻摇荡10 min。9.4.1.7.2漂洗
双蒸水漂洗 3 min，
9. 4. 1.7.3 染色
在新配染色液中，轻轻摇荡20min9.4.1.7.4漂洗
双蒸水漂洗，时间不超过10s。
9.4.1.7.5显影
在显影液中,轻轻摇荡，直至旧现带纹。9.4.1.7.6定影
在周定液中定影2inin。
9.4.1.7.7漂洗
用1. 5L双燕水漂洗2min。
9. 4. 1.7. 8干胶
室温下白然晾下，
9.4.2毛细管荧光电泳
9.4.2.1样品准备
iiKAoNhiKAca
NY/T2467—2013
取稀释后的不同荧光标记扩增产物溶液等体积混合。吸取1μL.混合液加入到DNA分析仪专用PCR扩增板孔中。板中各孔分别加入0.1L分子量内标和8.9uL去离子甲酰胺，将样品在PCR仪上95℃变性5min，取出并立即置于碎冰上，冷却10min以上。瞬时离心10s后置放到DNA分析仪上，
9.4.2.2荧光检测
按照仪器操作手厨，编辑样品表，执行运行程，保存数据。10等位变异数据记录与统计
10.1数据记录
对普通变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将待测样品扩增片段的带型和迁移位与对应的参照品种进行比较，与待测样品机同的参照品种的片段大小即为待测样品该引物位点的等位变异大小。对毛细管荧光电泳，通过参照品种消除不同批次间或不同型号DNA分析仪间可能存在的系统误差，使用片段分析软件，读取样品在该位点的等位变异。纯合位点的等位变异数据记录为X/X，其中X为该位点等位变异的大小；杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，其中X、Y为该位点.上两个不同的等位变异。小片段在前，大片段在后。缺失位点基因型数据记录为0/0。
示例1:以附录1D)中的引物Txp182为例，参照品种\TX430\在该位点上仅扩增出条231bp的片段，则该品种在该张物位点上的等位变异数据记录为231/231示例2:以附录D中的引[物Txp121为例.品种\TX1.3(\在该位点上扩增出两条分别为233bp,237hp的片段.则该品种在该引物位点上的等位变异数据记录为233/237。11判定方法
11.1结果判定
当样品间差异位点数≥2，则判定为\不向品种”，当样品间差异位点数-：1，判定为\近似品种”；当样品间差异位点数一0.判定为“极近似品种或机同品种\。对利附录C中40对引物仍未检测到≥2个差异位点数的样品，可按照GB/T19557.1的规定进衍行田间种植鉴定。
11.2结果表述
比较位点数：．．比较位点为：差异拉点数：----差异位点为：：判定为：
A.1主要仪器设备
A.1.1ICR扩增仪wwW.bzxz.Net
附录A
【规范性附录]
主要仪器设备及试剂
NY/T2467—2013
高床电泳仪：规格为3000V.400mA，400W，具有恒电压，恒电流和恒功率功能A. 1. 2
飛直中泳槽及配套的制胶附件。A.1.4
普通电泳仪。
水平电泳槽及配套的制胶附件。A. 1. 6
高速冷冻离心机桃：最大离心力不小卡15(000 r/min，水平摇床。
胶片观察灯。
A.1.9 电子天平撼应为0.01g、0.001gA. 1. 10
微量移液器：规格分别为10ul、20l，100μl、200l、1.000μl连续可调。磁力搅拌器。
A.1.12紫外分光光度计：波长260nm及280nml。A.1.13微波炉。
A.1.14 高压灭菌钢。
A.1.15酸度计。
A.1.16水溶锅或金属浴：控温精度土1℃。A.1.17冰箱：最低温度20℃。
A.1.18制冰机。
A.1.19凝胶成像系统或紫外透射仪。A.1.20DVA分析仪：基于毛细管电泳，有片段分析功能和数据分析软件，能够分辨1个核苷酸大小的差异。
A.2主要试剂
上六烷基乙基溪化铵(CTAB)。
A.2.2三氯甲烷。
A.2.3异丙醇。
A.2.4异戊醇。
A.2.5 乙二胺四Z酸二钠(FDTA - Naz ·2II,0)。A.2. 6 三羟甲基氨基甲烷(Tris-base)。A.2.7盐酸：37%。
氢氧化钠(NaO)II)。
iiKAoNiiKAca
NY/T 2467--2013
A.2.9氯化钠。
A.2.1010XBuffer缓冲液：含Mg/25mmol/ L。A 2. 11、4种脱氧核苷磷酸;dATP、dTTP、dGTP、dCTP(10 mmol/L cach)。A 2. 12Tagj DNA 聚含酶:2 U/μIuA.2.13矿物油。
A.2.14 琼脂糖。
A.2.15DNA分量标准:DL2000，
A.2. 16核酸染色剂。
A. 2. 17 去离了甲酰胺(Formamide)。A.2.18溴酚蓝(Brph Blue)。
A. 2. 19 二 甲苯青 FF。
A.2.201叉双丙烯酰胺（bisacrylamide）。A.2.21丙烯酰腰（acrylamide）A.2.22硼酸(Borit:Acid)。
尿素。
A.2.24亲和硅烷(Birnding Silane):97%。剥离硅烷(Rcpel silane):2%二甲基二氯硅烷,A. 2.25
无水乙醇。
四甲基乙二胺（TFMED)
过硫酸铵(APS)。
冰醋酸。
乙酸铵。
A.2.31硝酸银。
甲溶液：37%。
A.2.33DNA分析仪专川两烯酰胺胶液。A,2.34IDNA分析仪专用分子量内标 Liz标记。A.2.35DNA分析仪专JJ光谱校推基质，6-FAM荧光标记的DNA片段。A.2. 36
DNA分析仪专用电泳缓冲液。
附录B
（规范性附录）
溶液配制
NY/T 2467---2013
除另有说明外，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和GB/T6682规定的一级水。B.1DNA提取试剂的配制
B. 1. 10. 5 mWl/L ELYTA 溶液186.1FDIA-Na·2Hz0溶于800mL水中,用1mol/INa0H调pH至8.0.定穿垒1 000 inL,在 103. 4 kPa灭菌。B. 1. 21 mol/L Tris -HCL 溶液60.55gTrisbase溶于适量水中,加1mol/LHCl调pl至8.0,定容至500ml.,103.4kPa灭谢。B. 1. 30. 5 mol/L HCI 溶液
25ml浓盐酸（36%~~38%），加水定容至500mLB.1.4DNA提取CTAB缓冲液
1mol/LTrisHCl83.5mI.,5mol/LNaCL235mL,0.5mol/LEDTA33.4mJ.,CTAB固体20g定容至1000mL，其中,292.5gNaCl(MW-=58.44)十ddIIC)至终休积10001nil,103.4kPa灭菌，即为5tuo1/LNaCl溶液。
B. 1.5氯仿——异戊醇(24 :1)
按24：1的比例（体积比）配制混合液，B. 1. 6 76% 艺醇
无水乙醇380ml.,定容至500mL
B.1.7TE缓冲液
1mol/LTris-HCl5L.0.5mol/LEDIA1mL，加HCI调pH至8.0,定容至50mLB,2PCR扩增试剂的配制
B. 2. 1 dNTT
用超纯水分别配制A、G、C.T终浓度100mmol/L的储存液。各取20μl混合，用超纯水120μL定容至每种核苷三磷酸终浓度为10mmol/L的工作液。103.4kPa灭菌，一20°保存。B. 2. 2 SSK 引物
川超纯水分别配制前引物和后引物终浓度均为20uImol/L，等体积混合成1CuInol/L的工竹液。B.3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂的配制B. 3. 1 40%PAGE胶
190g内烯酰胺和10甲叉双丙烯酰胺，定容至500mL，混勾，4℃贮存备用，B. 3. 2 6% PAGE胶
尿素450g，10×BTE缓冲液100ml，40%PAGE胶150ml定容垒1000mlB.3.3亲和硅烷工作液
250冰醋酸，250ul.亲和硅烷，加无水乙醇50mL，匀，分装于1.5ml.Eppendoxf管中，iiKAoNiKAca
NY/T2467-2013
4℃贮存备用
B.3.4剥离硅烷工作液
2%二甲垫二氯烷，
B.3.525%过硫酸铵溶液
0. 25 g过硫酸铵溶于 1 mL 超纯水中。B.3.610 ×TRE缓冲液
Tris-base 108 g,硼酸55 g,EDTA-Nag2H.O 7.44g,定容年1J.。B.3.71×TBE缓冲液
10×TBF缓冲液500mL，加水定容至5L。B.3.86×加样缓冲液
去离子中酰胺（用于DNA变性)49ml：0.5mmol/LEDTA1ml，溴酚蔬0.125g，甲苯0.125g.
B.4银染试剂的配制
B.4.1固定液
200mL冰醋酸，加水定睿件2 000ml.B.4.2染色液
3g硝酸银，加水定容至2000ml。B.4.3显影液
2.000ml蒸馅水4加人25g氢氧化钠和7ml醛。注：银染溶液的配制可使用符合（/T6682规定的三级水。核心引物见表C、,
引物名称
Txn230
Txp159
SB4273
Guxho8g
SB3683
Txp436
SBKAFGKI
Txp126
Txp321
SR54CY
SR3727
SB5011
TxpC21
Txp343
Txp289
Txp494
SB3811
Gnab67
Txp182
Txp123
Txp130
Tx20l0
Txp430
Txp015
染色体位置
S13107
SE3104
【规范性附录】
核心引物
表 C 1 核心引物
正向引物
CAXTCTCACXAACAA
GCTACCGETGCTGCTCT
ACAGGGGTTTAGGGAAATCG
ACTGAAAGKCCAAATLAG
GCUGCATACAAGAACAAAGTTA
ATCAGGTACAGCAGGTAGG
GYAAAAGGATITTCAACTATIXHG
GCTGCACTGTCCTCCCACAA
GGGTGACTGGTCUGTFCTC
CTAGAGGATTGCTGGAAK
AGCATCTTALAACAALCAAT
AGTCAAAACOGCCACAT
GXITATGAATTICGITTTATTCA
CTCATCAGGCTAAAATGATCAX
TAACC:AAGCCTGAGCATAAGA
GAGTCTGXCTTATTGTGXTTTT
ACATGTACTATTICACC
CAAATACAAACGAAAGTGTACAGTGG
ATTCEACXXCACAGAATTIGTCTI
GAGCIGUCATAGATTTGICG
CXGATTGGAGATAAGTGTC:
CCAGGAGATLCAGAAGTGT
AAGTHGGGTGAAGAGATA
CGTUTCGTUTOCTTOGTC
TGCTATGACT:TGTTIGGKICACA
TAGTCATACACCTTTCA
ATGTGTCCAGCATGCATAA
TGGCGAGCATCTTACA
TGGGAAGCAGCTCAGG
CAAOCCAAGAGAGKXGATTGTGACT
ATACTATCAAGAGGGGAGC
AATCAACAAGAGCGGGAAAG
CACAAAGGCACCGAACAAAAC
CGGACCAACGACGATTATC
ATGAGYTIXTIGCATATCTUAGC
AGTATTTGCCGCTGGTGAAG
GAGAAACAGTAGTGCGTTATC
ACAGGGCFTTAGGGAAATCG
GCATGTGTAAGTTGCCACCA
NY/T2467—2013
反向引物
GTTAAACGAAAGGGAAATGGC
AGGKGCAFCAAGAAAT
CCATCACGTCGGCATCT
GGGGGAGAAACGGTGAG
TTAAGCTGTCTCACTGCCGAGTTG
ATGCATCATGR TGGT
TTTTCTTGCAGTTTCTGAXAG
CAGCAGHGLGATATGATGAGC
TTCAGTOCTTGGTGAUCTC
GTGKUTGGITGIUITIGAG
CTATGUACTGAGTGATGAC
GAGAAGKGGGAGAGGAGAA
CCATCATTTTGATGAAATGCAG
ATGAKACIGAAACATGAAACA
XXATTCACAEATGAGACGAG
TGECTTTTTGCCAGATCTTTCTTC
ACACATUGAGACCAGTTG
TTTTITGTCACTCAACAACXXAA
AAGAACCGTICATTCIGCTGACC:
ACTXTUCCACTTTGTTG
TATAAAGAICAGAAGAGGTG:
GCATAAAACATTTGGAAACTCAAA
CTGCCTTTCXAGATC
GCATGTTCAGGAGAGCATCA
CIGAGTTIXAGCAAGTACAGKAGC
TCTCTCACACACATTCTTC
CTCATGTAGGGGOGAGTGTC
TALGTAGGUGGTIGGATT
AGGGTGGTGATGTAGGGA
CCTGCITTTCAAXTCTTGAAT
AGTACFAGCACACGTCAC
TRGAGATIGORAGTLC
CAGAGGCCGAGGACGAG
ACTCGTCTCACTGCAATACTG
CTTTUGACGFAUCTGTCCTOGTCT
TCTCGATTTCACAGGCTTT
CATAGACACCTAGGCCATC
CCATCACCGTCGGCATCT
AGAGYIGCACTLLAGGATTT
AAATGGCGTAGAGICETTG
ITGHGOCATGACTTATCAC
注：表（1中规定的叫物在DNA分析仪上使用时：须在正问引物=端加荧光修饰基闭。9
iiKAoNiKAca
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。
中华人民共和国农业行业标准
NY/T2467—2013
高梁品种鉴定技术规程
SSR分子标记法
Protocol for identification of sorghum varieties--SsR marker method2013-12-13发布
2014-04-01实施
中华人民共和国农业部
2规范性引用文件
3术语和定义
仪器设备及试剂
溶液配制
引物信息
参照品种信息
操作程序
等位变异数据记录与统计…
11判定然
附录A（规范性附录）主要仪器设备及试剂附录B(规范性附录）溶液配制·附录(（规范性附录）
核心引物·
附录D(资料性附录)
核心引物相关信息
NY/T 2467—2013
NY/T2467-2013
本标准按照GB/T1.1—2009给的规则起草，谐注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标由农业部种子管理局提出。本标准由全国植物新品种测试标准化技术委员会（SAC/TC277)归。本标准起草单位：古林省农业科学院、农业部科技发展中心本标雄主要起草人，李晓辉、王风华、张春宵、张学军、周海涛、郝彩环、李淑势、刘艳芝、陶蕊、李力军、徐。
1范围
高粱品种鉴定技术规程SSR分子标记法NY/T 2467—2013
本标准规定了利用简单重复序列（simplescrjucnccrcxals，SsR）标记法进行高梁[Sorghumtbirotor(L.)Moench品种鉴定的操作程序、等位变异数据记录与统计、判定方法。本标准适用于高粱品种的SSR指纹数据采集和品种鉴定规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注口期的版本适用十本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本标准。CB 4404.1粮食作物种子禾荐类
GB/T3543.2农竹物种子检验规程扦样GH/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19557.1植物新品种特异性、--致性和稳定性测试指南总则3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件，3.1
品种vamiety
己知最低·级植物分类单位中的一个类群.不论是否充分满足植物新品种权的投权条件，该类群应该是：
通过某一特定的基因或基因型组合所表达的特征来界定；通过至少，种上述特征的表达，与任何其他植物类群存所区别：“--经过繁殖后其适应性未变的一个单位、[GB/T19557.1--2(004.定义3.]
核心引物corepriuner
品种鉴定中优先选用的套SSR引物，其检测位点多态性高，检测结果复性好，3.3
参照品种referencevariety
具有所用SSR位点上不同等位变异的品种。川于辅助确定待测样品的等位变异，校正仪器设备的系统误差
4原理
由于不同高粱品种遗传组成不同，基内红DNA存在简单重复序列的重复次数差异。这种差可通过PCR扩增及电泳方法进行检测，从而能够区分不间高粱品种。5仪器设备及试剂
见附录A。
iiKAoNiKAca
NY/T2467--2013
6溶液配制
见附录B。
7引物信息
核心引物名单及序列见附录C,核心引物等位变异等相关信息参见附录D8参照品种信息
参见附录 D，
9操作程序
9.1样品准备
样品材料可为种子、幼嫩叶片等组织或器官。试验样品为种子时，其质量应符合GB1101.1中对高粱种子纯度的要求。
种子样品的分样和保存，应符合GB/T3543.2的规定。应分析20个以.土个体的混合样品，或至少；个个体（种子、叶片或其他等效物)的单个样品。9.2DNA提取
9.2.1称取适量样品，液氮下迅逑磨成粉术。9.2.2将粉末转人2.0mLEppcndorf管中.加人700μl.65C预热的CTAB缓冲液,并使其混勺。9.2.365℃水浴加热45min,不断地轻轻倒转摇动。水浴后，取出离心管,冷却分室漏。9.2.4通风橱下加人700μl.的氯仿一异戊醇（24：1)轻轻转摇动5tmin～10)min。9.2.512000g（室温）离心10rrin，用去头枪尖将上清液转至1个新的2.0ml.EppendorF管ft。9.2.6加入10μLRNA酶溶液（10mg/mL).37C下温浴30min9.2.7重复9.2.4~9.2.5步骤
9.2.8加人一20℃预冷的异丙醇(1倍体积)或无水乙醇(2倍休积)于2.0 mLEppendorf 管,轻轻混句。一20℃冰箱静置一段吋间后，至DNA凝集室温下钩山DNA。9.2.976%乙醇洗涤2次（其中次可过夜）。洗涤完毕后，将DNA惊T。9.2.10加入适量的1×TF(pII 8. 0)溶解丁试管中,4℃ 下保存各用9.2.11 将 DNA原液十 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测质量(DI,2000 为Markcr)。20%下保存备用。注1:利用种了幼芦，值株幼嫩叶片等组织或器官提取DNA均可，组鉴于高凝的种产籽粒较小，本标准推荐使用幼萌；
注2：上述DKA提取方法为标准抵荐使用的,其他能够达到PCR扩增质量要求的INA提取方法均可来用。9.3PCR扩增
9.3.1引物选择
百先选择附录C中前20对;物进行扩增，当样品问检测出的差异位点数小于2时.再选用附录（中后20对引物进行检测。
9. 3. 2 反应体系
10μL的反应体积，含每种dNTP0.i0tnol/L，正向、反向引物各0.24μmol/1.,TagDNA聚合酶0.4U,1X×PCR缓冲液（含Mg-2.5rnmo1/L），样品DNA20ng~20g，其余以超纯水补足至所需休积，如果PCR过程中不采用热盖程序，则反应液上加盖15L矿物油，以防止反应过程十水分蒸发。9. 3. 3反应程序
94℃预变性5ni11,1个循环：94℃变性45s,55℃退火45$.72℃延伸60s.共36个循环：72℃延伸2
10min，4℃保存。
9.4电泳检测
9.4.1普通变性聚丙烯酰胺凝胶电泳9.4.1.1灌胶板制作
NY/T2467—2013
肯先严格地将玻璃板洗净，再刃蒸馏水冲洗并擦十，然后用95%酒精擦拭，最后在母板上均勾涂2ml～3ml亲和硅烷工作液，槽板上涂2mI.~3ml.剥离硅烷。放置10min以.上，让其充分晾干，操作过程中防止两块玻璃板相片污染。9.4.1.2组装玻璃板
待玻璃板御底干燥后组装电泳板，并闲水平仪调平。9.4.1.3灌胶
在50mL.6%PAGE胶中加人TEMED65L和25%的过硫酸铵250uL.迅速混句后灌胶。待胶液流动到下部，在工部轻轻插人梳子，使其凝聚至少1h以上。灌胶过程中防止出现气泡。9.4.1.4预电泳
在正极槽（下槽）加人1×TBE缓冲液600nL.在负极槽（.上槽)中加人0.5×TBE缓冲液600ml.拨出梳F。80W恒功率预电泳30min~40min。9.4.1.5样品制备
10LPCR扩增样品加人3μ.6×加样缓冲液，混勾后，在94℃变性10min，迅速川冰水浴冷却：并于一20℃冰箱中冷却10min以上
9.4.1.6电泳
用移器吹吸加样槽，清除残胶和气泡，插入样品梳子，每：个加样孔点入4μL样品。70W恒功率电泳至上部的指示带（..甲苯青）达到胶板的中部（151nin~50min）。电泳结束后，小心分开两块坡璃板，胶会紧贴在涂亲和硅烷的坡璃板上。9.4.1.7银染
9.4.1.7.1固定
将凝胶板置于装有固定液的塑料盒内，轻轻摇荡10 min。9.4.1.7.2漂洗
双蒸水漂洗 3 min，
9. 4. 1.7.3 染色
在新配染色液中，轻轻摇荡20min9.4.1.7.4漂洗
双蒸水漂洗，时间不超过10s。
9.4.1.7.5显影
在显影液中,轻轻摇荡，直至旧现带纹。9.4.1.7.6定影
在周定液中定影2inin。
9.4.1.7.7漂洗
用1. 5L双燕水漂洗2min。
9. 4. 1.7. 8干胶
室温下白然晾下，
9.4.2毛细管荧光电泳
9.4.2.1样品准备
iiKAoNhiKAca
NY/T2467—2013
取稀释后的不同荧光标记扩增产物溶液等体积混合。吸取1μL.混合液加入到DNA分析仪专用PCR扩增板孔中。板中各孔分别加入0.1L分子量内标和8.9uL去离子甲酰胺，将样品在PCR仪上95℃变性5min，取出并立即置于碎冰上，冷却10min以上。瞬时离心10s后置放到DNA分析仪上，
9.4.2.2荧光检测
按照仪器操作手厨，编辑样品表，执行运行程，保存数据。10等位变异数据记录与统计
10.1数据记录
对普通变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将待测样品扩增片段的带型和迁移位与对应的参照品种进行比较，与待测样品机同的参照品种的片段大小即为待测样品该引物位点的等位变异大小。对毛细管荧光电泳，通过参照品种消除不同批次间或不同型号DNA分析仪间可能存在的系统误差，使用片段分析软件，读取样品在该位点的等位变异。纯合位点的等位变异数据记录为X/X，其中X为该位点等位变异的大小；杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，其中X、Y为该位点.上两个不同的等位变异。小片段在前，大片段在后。缺失位点基因型数据记录为0/0。
示例1:以附录1D)中的引物Txp182为例，参照品种\TX430\在该位点上仅扩增出条231bp的片段，则该品种在该张物位点上的等位变异数据记录为231/231示例2:以附录D中的引[物Txp121为例.品种\TX1.3(\在该位点上扩增出两条分别为233bp,237hp的片段.则该品种在该引物位点上的等位变异数据记录为233/237。11判定方法
11.1结果判定
当样品间差异位点数≥2，则判定为\不向品种”，当样品间差异位点数-：1，判定为\近似品种”；当样品间差异位点数一0.判定为“极近似品种或机同品种\。对利附录C中40对引物仍未检测到≥2个差异位点数的样品，可按照GB/T19557.1的规定进衍行田间种植鉴定。
11.2结果表述
比较位点数：．．比较位点为：差异拉点数：----差异位点为：：判定为：
A.1主要仪器设备
A.1.1ICR扩增仪wwW.bzxz.Net
附录A
【规范性附录]
主要仪器设备及试剂
NY/T2467—2013
高床电泳仪：规格为3000V.400mA，400W，具有恒电压，恒电流和恒功率功能A. 1. 2
飛直中泳槽及配套的制胶附件。A.1.4
普通电泳仪。
水平电泳槽及配套的制胶附件。A. 1. 6
高速冷冻离心机桃：最大离心力不小卡15(000 r/min，水平摇床。
胶片观察灯。
A.1.9 电子天平撼应为0.01g、0.001gA. 1. 10
微量移液器：规格分别为10ul、20l，100μl、200l、1.000μl连续可调。磁力搅拌器。
A.1.12紫外分光光度计：波长260nm及280nml。A.1.13微波炉。
A.1.14 高压灭菌钢。
A.1.15酸度计。
A.1.16水溶锅或金属浴：控温精度土1℃。A.1.17冰箱：最低温度20℃。
A.1.18制冰机。
A.1.19凝胶成像系统或紫外透射仪。A.1.20DVA分析仪：基于毛细管电泳，有片段分析功能和数据分析软件，能够分辨1个核苷酸大小的差异。
A.2主要试剂
上六烷基乙基溪化铵(CTAB)。
A.2.2三氯甲烷。
A.2.3异丙醇。
A.2.4异戊醇。
A.2.5 乙二胺四Z酸二钠(FDTA - Naz ·2II,0)。A.2. 6 三羟甲基氨基甲烷(Tris-base)。A.2.7盐酸：37%。
氢氧化钠(NaO)II)。
iiKAoNiiKAca
NY/T 2467--2013
A.2.9氯化钠。
A.2.1010XBuffer缓冲液：含Mg/25mmol/ L。A 2. 11、4种脱氧核苷磷酸;dATP、dTTP、dGTP、dCTP(10 mmol/L cach)。A 2. 12Tagj DNA 聚含酶:2 U/μIuA.2.13矿物油。
A.2.14 琼脂糖。
A.2.15DNA分量标准:DL2000，
A.2. 16核酸染色剂。
A. 2. 17 去离了甲酰胺(Formamide)。A.2.18溴酚蓝(Brph Blue)。
A. 2. 19 二 甲苯青 FF。
A.2.201叉双丙烯酰胺（bisacrylamide）。A.2.21丙烯酰腰（acrylamide）A.2.22硼酸(Borit:Acid)。
尿素。
A.2.24亲和硅烷(Birnding Silane):97%。剥离硅烷(Rcpel silane):2%二甲基二氯硅烷,A. 2.25
无水乙醇。
四甲基乙二胺（TFMED)
过硫酸铵(APS)。
冰醋酸。
乙酸铵。
A.2.31硝酸银。
甲溶液：37%。
A.2.33DNA分析仪专川两烯酰胺胶液。A,2.34IDNA分析仪专用分子量内标 Liz标记。A.2.35DNA分析仪专JJ光谱校推基质，6-FAM荧光标记的DNA片段。A.2. 36
DNA分析仪专用电泳缓冲液。
附录B
（规范性附录）
溶液配制
NY/T 2467---2013
除另有说明外，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和GB/T6682规定的一级水。B.1DNA提取试剂的配制
B. 1. 10. 5 mWl/L ELYTA 溶液186.1FDIA-Na·2Hz0溶于800mL水中,用1mol/INa0H调pH至8.0.定穿垒1 000 inL,在 103. 4 kPa灭菌。B. 1. 21 mol/L Tris -HCL 溶液60.55gTrisbase溶于适量水中,加1mol/LHCl调pl至8.0,定容至500ml.,103.4kPa灭谢。B. 1. 30. 5 mol/L HCI 溶液
25ml浓盐酸（36%~~38%），加水定容至500mLB.1.4DNA提取CTAB缓冲液
1mol/LTrisHCl83.5mI.,5mol/LNaCL235mL,0.5mol/LEDTA33.4mJ.,CTAB固体20g定容至1000mL，其中,292.5gNaCl(MW-=58.44)十ddIIC)至终休积10001nil,103.4kPa灭菌，即为5tuo1/LNaCl溶液。
B. 1.5氯仿——异戊醇(24 :1)
按24：1的比例（体积比）配制混合液，B. 1. 6 76% 艺醇
无水乙醇380ml.,定容至500mL
B.1.7TE缓冲液
1mol/LTris-HCl5L.0.5mol/LEDIA1mL，加HCI调pH至8.0,定容至50mLB,2PCR扩增试剂的配制
B. 2. 1 dNTT
用超纯水分别配制A、G、C.T终浓度100mmol/L的储存液。各取20μl混合，用超纯水120μL定容至每种核苷三磷酸终浓度为10mmol/L的工作液。103.4kPa灭菌，一20°保存。B. 2. 2 SSK 引物
川超纯水分别配制前引物和后引物终浓度均为20uImol/L，等体积混合成1CuInol/L的工竹液。B.3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂的配制B. 3. 1 40%PAGE胶
190g内烯酰胺和10甲叉双丙烯酰胺，定容至500mL，混勾，4℃贮存备用，B. 3. 2 6% PAGE胶
尿素450g，10×BTE缓冲液100ml，40%PAGE胶150ml定容垒1000mlB.3.3亲和硅烷工作液
250冰醋酸，250ul.亲和硅烷，加无水乙醇50mL，匀，分装于1.5ml.Eppendoxf管中，iiKAoNiKAca
NY/T2467-2013
4℃贮存备用
B.3.4剥离硅烷工作液
2%二甲垫二氯烷，
B.3.525%过硫酸铵溶液
0. 25 g过硫酸铵溶于 1 mL 超纯水中。B.3.610 ×TRE缓冲液
Tris-base 108 g,硼酸55 g,EDTA-Nag2H.O 7.44g,定容年1J.。B.3.71×TBE缓冲液
10×TBF缓冲液500mL，加水定容至5L。B.3.86×加样缓冲液
去离子中酰胺（用于DNA变性)49ml：0.5mmol/LEDTA1ml，溴酚蔬0.125g，甲苯0.125g.
B.4银染试剂的配制
B.4.1固定液
200mL冰醋酸，加水定睿件2 000ml.B.4.2染色液
3g硝酸银，加水定容至2000ml。B.4.3显影液
2.000ml蒸馅水4加人25g氢氧化钠和7ml醛。注：银染溶液的配制可使用符合（/T6682规定的三级水。核心引物见表C、,
引物名称
Txn230
Txp159
SB4273
Guxho8g
SB3683
Txp436
SBKAFGKI
Txp126
Txp321
SR54CY
SR3727
SB5011
TxpC21
Txp343
Txp289
Txp494
SB3811
Gnab67
Txp182
Txp123
Txp130
Tx20l0
Txp430
Txp015
染色体位置
S13107
SE3104
【规范性附录】
核心引物
表 C 1 核心引物
正向引物
CAXTCTCACXAACAA
GCTACCGETGCTGCTCT
ACAGGGGTTTAGGGAAATCG
ACTGAAAGKCCAAATLAG
GCUGCATACAAGAACAAAGTTA
ATCAGGTACAGCAGGTAGG
GYAAAAGGATITTCAACTATIXHG
GCTGCACTGTCCTCCCACAA
GGGTGACTGGTCUGTFCTC
CTAGAGGATTGCTGGAAK
AGCATCTTALAACAALCAAT
AGTCAAAACOGCCACAT
GXITATGAATTICGITTTATTCA
CTCATCAGGCTAAAATGATCAX
TAACC:AAGCCTGAGCATAAGA
GAGTCTGXCTTATTGTGXTTTT
ACATGTACTATTICACC
CAAATACAAACGAAAGTGTACAGTGG
ATTCEACXXCACAGAATTIGTCTI
GAGCIGUCATAGATTTGICG
CXGATTGGAGATAAGTGTC:
CCAGGAGATLCAGAAGTGT
AAGTHGGGTGAAGAGATA
CGTUTCGTUTOCTTOGTC
TGCTATGACT:TGTTIGGKICACA
TAGTCATACACCTTTCA
ATGTGTCCAGCATGCATAA
TGGCGAGCATCTTACA
TGGGAAGCAGCTCAGG
CAAOCCAAGAGAGKXGATTGTGACT
ATACTATCAAGAGGGGAGC
AATCAACAAGAGCGGGAAAG
CACAAAGGCACCGAACAAAAC
CGGACCAACGACGATTATC
ATGAGYTIXTIGCATATCTUAGC
AGTATTTGCCGCTGGTGAAG
GAGAAACAGTAGTGCGTTATC
ACAGGGCFTTAGGGAAATCG
GCATGTGTAAGTTGCCACCA
NY/T2467—2013
反向引物
GTTAAACGAAAGGGAAATGGC
AGGKGCAFCAAGAAAT
CCATCACGTCGGCATCT
GGGGGAGAAACGGTGAG
TTAAGCTGTCTCACTGCCGAGTTG
ATGCATCATGR TGGT
TTTTCTTGCAGTTTCTGAXAG
CAGCAGHGLGATATGATGAGC
TTCAGTOCTTGGTGAUCTC
GTGKUTGGITGIUITIGAG
CTATGUACTGAGTGATGAC
GAGAAGKGGGAGAGGAGAA
CCATCATTTTGATGAAATGCAG
ATGAKACIGAAACATGAAACA
XXATTCACAEATGAGACGAG
TGECTTTTTGCCAGATCTTTCTTC
ACACATUGAGACCAGTTG
TTTTITGTCACTCAACAACXXAA
AAGAACCGTICATTCIGCTGACC:
ACTXTUCCACTTTGTTG
TATAAAGAICAGAAGAGGTG:
GCATAAAACATTTGGAAACTCAAA
CTGCCTTTCXAGATC
GCATGTTCAGGAGAGCATCA
CIGAGTTIXAGCAAGTACAGKAGC
TCTCTCACACACATTCTTC
CTCATGTAGGGGOGAGTGTC
TALGTAGGUGGTIGGATT
AGGGTGGTGATGTAGGGA
CCTGCITTTCAAXTCTTGAAT
AGTACFAGCACACGTCAC
TRGAGATIGORAGTLC
CAGAGGCCGAGGACGAG
ACTCGTCTCACTGCAATACTG
CTTTUGACGFAUCTGTCCTOGTCT
TCTCGATTTCACAGGCTTT
CATAGACACCTAGGCCATC
CCATCACCGTCGGCATCT
AGAGYIGCACTLLAGGATTT
AAATGGCGTAGAGICETTG
ITGHGOCATGACTTATCAC
注：表（1中规定的叫物在DNA分析仪上使用时：须在正问引物=端加荧光修饰基闭。9
iiKAoNiKAca
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。