NY/T 2468-2013 甘蓝型油菜品种鉴定技术规程 SSR分子标记法 NY/T2468-2013 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

ICS 67.080.20
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 246B—2013
甘蓝型油菜品种鉴定技术规程
SSR分子标记法
Identification of rapeseed varietics-SsR markcr method2013-12-13发布
2014-04-01实施
中华人民共和国农业部发布
规范性引用文件
原理·
仪器设备及试剂
溶液配制
引物…
参照品种及其使用
操作程序
等位变异数据采集
10判定方法.
仪器设备及试剂
附录A(规范性附录）
附录B(规范性附录）
溶液配制
附录C(规范性附录）
核心引物
NY/T 2468--2013
NY/T2468—2013
本标准按搬B/T1.1—2009给山的规则起草。请注意本文件的束些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承扭识别这些专利的资任本标准出农业部种子管理局提出。本标摊由全国植物新品种测试标准化技术委员会(SAC/TC277)归FI。本标准起草单位：四川省农业科学院、农业部科技发展中心。木标准主要起草人：余毅、巅运半、黄维藻、张浙峰、堵苑苑、何巧林、工丽容。1范围
NY/T2468—2013
甘蓝型油莱品种鉴定技术规程
SSR分子标记法
本标准规定了利用简单重复序列(Sirrplesequcnccrcpcat.s，SsR)分了标记进行甘蓝型油莱（BrassicunapusL.>品种鉴定的试验方法、数据记录格式和判定标准。本标准适用于甘蓝型油菜DNA分子数据采集和品种鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注口期的引用文件，仅注几期的版本适用十本文件。儿是不注口期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适加木文件。GB/T3543.2农竹物种子检验规程扦样3原理
SSR广泛分布于日蓝型油菜基因组中，不同品种间每个SSR位点重复单位的数量町能不同。由于每个SSR位点两侧的序刻是高度保守和单拷贝的，因而可根据其两侧的序列设计一对特异引物，利用PCR技术对两条物间的DNA序列进行扩增。在电泳过程，主要出于SSR位点重复单位的数量不同引起的不同长度的PCR扩增片段在电场作用下得到分离，经硝酸银染色或者荧光染料标记加以区分。因此，根据SSR位点的多态性，利川PCR扩增和电泳技术可以鉴定甘蓝型油菜品种。4收器设备及试剂
仪器设备及试剂见附录A。
5溶液配制
溶液配制方法见附录B。
6引物
引物相关信息见附录C。
7参照品种及其使用
参照品种的名称见附录（。在进行等位变异检测时，应同时包括相应参照品种的PCR扩增产物：注1：多个品种在某一SSR位点上可能都具有相同的等位变异。在确认这些品种该位点等位变异大小与参照品利相同后·这些品种也可以代替附录（中的参照品种使用。注2:同一名称不同来源的参照品种的某一位点上的等位变异可能不相同，在使用其他来源的参照品种时，应与原参照品种核对，确认无误后使用。注3:对于附录（中未包括的等位变异，应接木标准方法,确定其大小和对应参照品种。8操作程序
8.1样品准备
8.1.1待测样品为种子时,样品的打样、分样和保存，按照GB/T3543.2的规定执行，8.1.2待测样品为杂交油菜时，应提供F,代种了或幼苗。-riiKAoNhiKAca
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8.1.3每份检测样品取50个个体，混合制样。8.2DNA提取
将混合样品在液氮中研磨至粉末，迅速取约100mg粉木置于1.5mL离心管中，然后加人500mL预热的（65℃）2×（AB提取缓冲液（用前加2-统基乙醇），颠倒混勾；将离心管置于65℃慎温水溶1h，期间颠倒泥句3次～4次，取L离心管，冷却至室温，转移上清液至新的1.5mI-离心管中，加入500μl氯仿一异戊（V：V=24：1），颠倒滤匀，室温静置5min~10min.12000g离心10min;转移上清液至新的1.5ml.离心管中，加入150ul.异内醇颠倒混勾后，置于，20%℃的冰箱中2h；12000g离心10min，弃工清液，加500L70%乙谭洗涤沉淀2次：室温风干，加1×TE缓冲液60μ1.溶解沉淀；检测INA浓度于一20℃保存备用。
注：其他所获DNA质量能够满足FCJR扩增需要的1NA提取方法都适用于本标滩：8. 3PCR 扩增
8.3. 1 反应体系
含每种dNTP各0.15mmol/1.正向引物0.25μtnol/L，反向引物0.25mol/L,TagLNA紧合酶0.5C/uL，1×IPCR缓冲液（不含Mg+）,Mg(l,15mol/L，样品DVA20ng40ng，用超纯水补足所露体积，
利用毛细管中冰荧光检测时使用炭光标记引物，引物的荧光染料种类见附录（。8. 3.2反应程序
推荐使用以下两种反应程序：
程序1：94℃预变性2min94℃变性40s.65℃退火30s，72℃延伸45名，每循环降1℃，共10个循坏94℃变性40s，55℃退火30s.72℃延伸45s，共28个循坏；72℃延伸5min，4℃保存。程序2:94%预变性2min91℃变性40s，60%退火309，72℃延仲45s，每循环降1℃，10个循环，94℃变性40s50%退火30s，72℃延伸45s，共28个循环；72℃延伸5min，4℃保存。每对引物的具体反应程序见附录C.8.4PCR产物检测
8.4.1普通变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测8.4.1.1玻璃板处理
将长、短玻璃板清洗干净，用去离了水冲洗后晾干，用无水乙醇擦洗2遍，自然晾干。在长板上涂工0.5mL亲和硅烷工作液，费叫押的短板上涂0.5mL剥离硅烷工作液。8.4.1.2玻璃板组装
待玻璃板彻底干燥后进行组装，并用水平仪调平。8.4.1.3变性PAGE胶的制备
按B3.2配置6.0%的变性PAGE胶液退速浪勾后灌胶。待胶液充满玻璃板夹层，在凹槽处将鲨鱼齿朝外轻轻插人样品梳胶液聚合后，轻轻技出样品梳，清洗胶板表面、样品梳和凝胶顶端。8.4.1.4预电泳
将胶板安装于电泳槽上，在止极樽（下槽）中加灿人1×TBE缓冲液约800ml，在负极槽（上槽）加入预热至65℃的1×TI3T缓冲液约800mL，在85W功率下，预电泳10tin~-20min。8.4.1.5样品制备
在PCR产物中加入2uL6×加样缓冲液，混勾店，在PCR仪1:95℃变性5min，取出，迅速置于碎冰工,冷却 10 min。
8.4.1.6电泳
清除凝胶顶端气泡。将鲨鱼肉梳齿播人凝胶1tmI1～2mm。每一个加样孔点入2μl~1μL扩增产物，在胶板两侧点入DNAMarker，除待测样品外，还应同时加人参照品种的扩增产物。在60W~2
80W恒功率下电泳，使凝胶温度保持在约50℃。电泳1.5h~-2.5h。8.4.1.7银染
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电泳结束后，小心分开两块玻璃板，将附着凝胶的玻璃板浸人固定液中，在摇床.上30rpm固定20min;取出胶板，放入水洗框中，用蒸馏水漂洗2次：每次漂洗305;从水洗框中取i胶板，放人染色液中，在播床上30rpm染色20min；取胶板，放人水洗框中，用蒸馅水漂洗1次，时间不超过10a将胶板放入显影液中，在摇床上30rfm鼠.待条骨清晰后，将胶板放人固定液中定影5min;用蒸馏水漂胶板10$
8.4.2毛细管电泳荧光检测
8.4.2.1样品准备
将6-FAM和HEX荧光标记的PCR扩增产物用超纯水稀释30倍，TAMRA和ROX荧光标记的PCR产物稀释10倍；分别取等体积的上述4种稀释店溶液混合。从合液中吸取1μL加入到DNA分析仪专用深孔板孔中，各孔分别加人0.1μL1Z500分子量内标和8.9去离子甲酰胺，加盖瞬时离心后在PCR仪上95℃变性5min,取山深孔板置于碎冰上，冷却10min。瞬时离心10 s除待测样品外，每个SSR位点还应闭时包括2个～3个参照品种的护增产物。注：不同荧光标记的扩增产物的最适稀释倍数最好通过毛细管心泳荧光检测预试验确定。8.4.2.2电泳
按DNA分析仪操作说明.打开仪器，检查仪器工作状态，更换缓冲液，打开数据收集软件，编辑电泳板，将装有样品的深孔板么盖，置十样品架基座1：开始电泳，9等位变异数据采集
9.1数据表示
样品每个SSR位点的等位变异采扩增片段人小的形式表示。9.2普通变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染检测将某一位点待测样品和相应的参照鼠种扩增片段的带型和移动位置进行比较，据参照品种的移动莅置和扩增片段大小，确定待测样品该位点的等位变异大小。9.3毛细管电泳荧光检测
使用DNA分析仪的片段分析软件：读出每个位点每个样品的等位变异大小数据。比较参照品种的等位变异大小数据与附录C中参照品种相应的数据，两者之间的差值为系统误差。从待测样品的等位变异数据中去除该系统误，得到的数据即为待测样品该位点的等位变异人小。9.4结果记录
纯合位点的等位变异数据记录为X/X，其中X为该位点等位变异人小;杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，其中X、Y分别为该位点.I.两个不同的等位变异，小片段数据在前·大片段数据在后；无效等位变异记录为 0/0。
示例1：个品种的某个SSR位点为纯合位点，等位变异大小为120bp，则该品种在该位点上的等位变导数据记录120/120.
示例2:一个品种的某个SSR位点为杂合位点,2个等位变异大小分别为120 hP,126bp,则该品种在该位点上的等位变异数据记录为120/126。
10判定方法
用附录C中引物进行检测，将狱得的得测样品等位变异数据进行品种间比较或与数据库中品种比较。判定方法如下：
a）品种间相似度≤90%，判定为不周品种；b）品种间相似度为90%S100%时，判定为近似品种3
-iiiKAoNiKAca
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品种间相似度=100%，判定为疑刷品种。品种相似度(S)按式()计算，
式中：
一相似度;
N一材料i和；之间共同的等位变异数!;N，材料iH现的等位变异数口；
N,——材料;中山现的等位变异数目。X100
对」10b)和10>悄况，按照GB/T19557.1的规定进行田间鉴定。(
A.1主要仪器设备
高压灭菌锅。
CR扩增仪
A. 1.3 电冰及配套的制胶附件。附录A
【规范性附录】
仪器设备及试剂
高压电泳仪（最高电压不低于2000V)。A. 1. 4
DNA分析仪。
台式高速离心机(最人离心力不小于20000g)。凝胶成像系统或紫外透射仪。
A.1.8 水浴锅。
A.1.9冰箱。
制冰机。
紫外分光光度计。
A. 1. 11 E
A.1.12微量移液器。
A.1.13水平摇床。
A.1.14胶片观察灯。
A.1.15电子天平（精确到0.01g）。A.1.16酸度计。
A.2试剂
除非刃有说明，在分析中均使用分析纯试剂。A.2.1乙.二胺四乙酸二钠。
A.2.2三羟甲基氨基甲烷。
A.2.3十六烷基三甲基漠化铵。
A.2.4聚乙烯吡咯烷酮。
A.2.5三氯甲烷。
A.2.6异醇。
A.2.7异丙醇。
A.2.8 盐酸(37%)。
A.2.9氢氧化钠。
A.2.1010XPCR缓冲液。
A.2.114 种脱氧核苷酸(dCTP、dITP,dATP.dGTP)。2Tay DNA聚合酶。
iiKAoNiiKAca
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NY/T2468—2013
矿物油。
应离子甲酰胺。
溴酚蓝，
二甲某青。
甲义双丙烯酰胺。
丙烯酰胺。
硼酸。
尿素。
亲和佳烷。
离独烷。
无水乙醇。
N.N,N,N'μ甲基乙二胺.
过硫酸铵。
冰醋酸(99.5%)
硝酸银。
甲醛液（37%）。
DNA分析仪专用分子量内标，
DNA分析仪专用胶，
DNA分析仪专用电泳缓冲液。
B. 1DNA 提取溶液的配制
DNA提取溶液的配置使用超纯水，B.1.11mol/L氢氧化钠溶液
【规范性附录】
溶液配制
称取40.0g氢氙化钠，溶于800mL水，冷却至室温：定容至1030mL。B. 1. 2 0. 5 mnl/ L 乙二胺四乙酸二钠溶液pH 8. 0)NY/T2468—2013
称取186.1g乙二胺四乙酸二钠盐，加入800mL水，再加人20g氢氧化钠，搅拌。待乙二胺四乙酸二钠盐完全案解后，冷却至室温。再用氢氧化钠溶液(1mol/I)推确调pH至8.0,定容至1000mL在103.4kPar121℃）条件下灭菌20minB. 1. 30. 5 mol/ L 盐酸(UICI)溶液量取251nL浓盐酸（36%~38%）置丁容量瓶中，加水定容至500mL。B.1.41mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液(pH8.0)称取60.55gTris碱溶丁约400ml.中，加盐酸溶液（0.5mol/L)调pH至8.0,加水定容至500ml，在103.2kPa(121℃)条件下灭菌20minB.1.52%(w/v)十六烷基三甲基溴化铵(2×CTAB)溶液分别称取20g十六烷堡三甲基溴化铵、81.816g氯化钠和20g聚乙烯吡喀烷酮溶十约700mL水中,加人100mL-=羟甲基氨基甲烷盐酸溶波（1mol/L，>II8.0)和40ml.乙一胺四乙酸钠溶液(0.5mol/1,pH 8. 0),加水定容至 1 000 mnl。B.1.61×TE缓冲液
分别量取 5ml.=羟甲基氨基甲烷盐酸溶液(1 mol/L)和 1 mL乙二胺四乙酸二钠溶液(0. 5 mol/L)，加盐酸溶液（0.5mol/L）调pH至8.0，加水定容至5U0taL，在103.4kPa（121℃）条件下火菌20min
B.2PCR扩增溶液的配制
PCR扩增相关溶液的配制使用超纯水。B.2.1SSR引物稀释
开盖前瞬时离心105，按说明-分别配制前引物和后引物终浓度均100ut101/L的储行液，各取10u混合，加80水定容至终浓度各10μmol/的作液。B.3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳相关溶液的配制变性聚丙烯酰胺凝胶电泳相关溶液的配制使用超纯水。B.3.140%(w/)丙烯酰胺溶液
分别称取190丙烯酰胺和10g中叉双丙烯酰胺济于约400L水中.加水定容至500mL.置于棕色瓶中4℃储存。
B.3.26.0%变性PAGE胶
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称取42g尿素溶丁约60ml水中，分别加人10mL10×TBE缓冲液、15mL40%丙烯酰胺溶液，150L10%过硫酸铵（新鲜配制）和50LN,V.N，N*-四基乙胶，加水定容至100mLB.3. 3亲和硅烷工作液
吸取1ml.无水乙醇，加人10uL亲和伟烷和10μL冰醋酸，混勾，B.3.4剥离硅烷工作液
量取2mL的二甲基二氯硅烷，加&mL的二氯甲烷，混匀。B.3.510%过硫酸铵溶液
称取0.1g过硫酸铵溶于1mL水中。B. 3. 610 × TBE 缓冲液
分别称取1u8三羟甲基氮基烷和55g硼酸济于约800ml，水中，加人37mL乙二胺四乙酸二钠溶液（0.5mol/L），加水定容充1000mL。B.3.71×TBE缓冲液
量取500mlL.的10×TBE级冲液-加水定容至5000ml，B.3.86×加样缓冲液
分别称取0.125乌溪酚蓝和0.125g二苯青，置于烧杯中，加人45mL去离了酰胺和1mL乙二胺四乙酸一钠溶液（0.5mol1/1.pH8.0），搅拌混勾。B.4银染溶液的配制
银染济液的配置使用蒸馏水。
B.4.1固定液
量取100mL冰醋酸，加水定容至1000mLB.4.2染色液
称取1硝酸银,萍于1000mL水巾。B.4.3显影液
称取10g氢氧化钠溶于1000mI水中，用前加2mL甲醛。8
核心引物(17对)见表C. 上。
HRAS084
Ra2E04
CR10597
CB10355
CB10172
CR10036
FRAS029
CB10347
引物序列(5'→3')
附录C
（规范性附录
核心引物
表 C. 1 核心引物(47 对)
荧光架料
F:ATTGGGTTCTGACCTTTTCTC
R:TTTTCCTTCATCGCTACCAC
F:ACACACAACAAACAGTCGC
R: AACATCAAACTGTXAYGG
F:AAGCGCGCATAACTACAC
R: AACACTGCTCTTTC'TT
F:GACGGATTGAGTGATA
R:(XTGCTAGGAAACAGGGT
F:ATTGGTCTCTTAACCCGC
R: TTTCGAAIYIKTUGAA
F:TUGUGACGTTGTITTGTIY
R:ACCATCTTCCRXAXXTG
F: ATTCATCTCLTGCTCGCTTAG
R: AAACTCAAACCAAAGTAAGAA
F:GTTEAACCTCLLTOGTCICTbzxZ.net
R:AGGTGCCAACTCATTICICAA
F: AICTGAACACTTTOGGCA
R:GGAAGCACCATGTCAGC
5'TAMRA
5'6-FAM
5'TAMRA
5'TAMRA
5'6FAM
5'TAMRA
反应程序
TiiKAoNiKAca
NY/T2468—2013
架色体等位变异bp
塞照品种
宁油20号
车农1号
湘油15
豫油2号
湘汕15
LINAGOLD
湘油:5
宁14号
花叶991018
赣油杂3号
走马洋泄菜
92 -98 系
莽油3号
花叶991018
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