NY/T 2469-2013
基本信息
标准号： NY/T 2469-2013
中文名称：陆地棉品种鉴定技术规程 SSR分子标记法
标准类别：农业行业标准(NY)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
NY/T 2469-2013 陆地棉品种鉴定技术规程 SSR分子标记法
NY/T2469-2013
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标准内容
ICS65.020.01
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 2469—2013
陆地棉品种鉴定技术规程
SSR分子标记法
Protocol for identification of cotton variety--SSR marker method2013-12-13发布
2014-04-01实施
中华人民共和国农业部发布
范围·
规范性引用文件
3术语和定义
仪器设备及试剂，
溶液配制
参照品种及其使用
操作程序
10等位变异数据采集
11判定方法
附录A（规范性附录）
仪器设备及试剂
附录B(规范性附录）
附录C（规范性附录）
溶液配制
核心引物·
参照品种名单
附录 D(资料性附录)
NY/T 2469--2013
NY/T2469—2013
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容川能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的资任。本标准由农业部科技教有司提山本标准出全国桩物新品种测域标化技术委员会（SAC/T：277)归Ⅱ本标准起草单位：江苏省农业科学院、农业部科技发展中心本标准主要起草人：戴剑、王显牛、丁奎敏、王艳平、徐鹏、冯继宏、陈二龙1范围
NY/T2469—2013
陆地棉品种鉴定技术规程SSR分子标记法本标准规定厂利用简单重复序列（sitplesequencerepcats.SsR)分了标记进行陆拖棉（GossybiulirsuturL.)品种鉴定的试验方法、数据记录和判定标本标准适用丁基丁SSR分F标记法的陆地棉DNA分子数据采集和品种鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于木文件的应用是必不可少的，凡是注且期的引而文件，仅注口期的版本适用十本文件。儿是术注目期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T19557.1植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
核心引物corcprimer
指品种DNA指纹鉴定优先选用的一套SSR引物，具有多态性高，重复性好等综合特性.可用于品种DNA指纹数据采集和品种鉴定。3.2
参照品种referelce variety
是对应于特定位点不同等位变异的一组品种，历于辅助确定待测样品在某个位点上等位变异扩增片段的大小,校正仪器设备的系统误差.以保证不向实验室数据具有可比性。4原理
SSR广泛分布于基因组中，不同品种间每个SSR位点重复单位的数量可能不同。针对两侧序列高度保守的简单重复序列，根据其两侧的序列设计一对特异引物.利用聚合酶链反应（polymcrasc?chainreaction，PCR)技术对重复序列进行扩增。在电泳过程中，由于SSR位点重复单位的数量不同引起不同长度的PCR打增片段在电场作用下分离.经硝酸银染色或者荧光架料标记加以区分。因此，根据SSR位点的多态性，利用PCR扩增和电泳技术可以鉴定陆地棉品种。5仪器设备及试剂
仪器设备及试剂见附录A，
6溶液配制
溶液配制方法见附录B
7引物
引物相关信息附录（
8参照品种及其使用
参照品种的名称见附录C，参照品种来源参见附录D。iiKAoNiKAca
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在逊行等位变异检测.应同时包括相成参照品种的PCR扩增产物。注1同一名称不同来源的参照品种的某位点上的等位变异可能不相同，在使用其他来源的参照品种时，成与原参照品种核对确认无误后再使用。注2：对于附录（中未包括的等位变异-应按本标证方法，确定其大小和对应的参照品种。9操作程序
9.1样品准备
每份样品检测8个单株，进行个体分析。9.2DNA提取
9.2.1将种子发芽.取两片真叶期的真叶0.2g.放人1.5imL离心管中。9.2.2置冷冻干燥仪中一50℃冷冻干燥2d.取山，每个试管中放人1个3mm直径的小钢珠，置研磨仪上设定每秒钟30次，研磨约5min.9.2.3加人预冷的新鲜配制的提取缓冲液600uI，冰浴10min。10000g，℃:-离心10rrin.弃上清液。
9.2.4于沉淀中加人600ml65℃预热的裂解缓冲液，搅拌均勾.65℃水浴40min，期间翻转混匀3次：9.2.5加入800μl.氯伤一异戊醇（V：V=24：1)混合液，翻转50次以上，10000g离心20min，将上清液转入新的1.5ml.离心管中
9.2.6加0.6倍体积预冷的异丙醇（20℃），缓慢翻转30次，混匀.静置10min-1200\离心15 min,弃上清液
9.2.7丁沉淀中加人1mL70%的乙醇洗涤，12000g离心2min。9.2. 8弃土清液,通风干燥沉淀
9.2.9加人200μLTE缓冲液，落解DNA,检测DNA浓度，-20℃保存备用：注：其他所获DNA质量能够满足PCR扩增雷要的DNA提取方法都适用丁本标准。9.3PCR扩增
9. 3. 1 反应体系
20μI的反应体积:DNA5μL(1 ng/μL),1C×Bufer2μl.,dNTPC.4μL（10 mmal/L).正向引物0.8 μL, (10 μmol/L). 反向引物 0. 8 μl (10 μmol/ L)- MgCI 1. 2 μI(25 mmol/ L), Taq 酶 0. 1 μI（5U/L），双蒸水9.4uL.在PCR扩增仪上进行扩增。利月毛细管电泳荧光检测时使用炭光标记的引物。引物的荧光染料种类见附录C。注：反应体系的体积可以报据具体情况进行调整。9.3.2反应程序
95℃预变性5min95℃变性30s.根据表C.1推荐的退火溢度退火3Cs.72℃延伸1min，共35个循环;72℃下延仲1℃mi-4保存。9.4PCR产物检测
9.4.1变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染检测9.4.1.1清洗玻璃板
将玻璃板清洗干净.用去离子水冲洗后晾干。用光水乙醇擦洗2遍：吸水纸擦于。在长板上涂C.5mL的亲和硅烷T作液：带凹槽的短板上涂0.5mL离硅烷作液，操作过程中防.两块璃板互相污染。
9.4.1.2组装玻璃板
玻璃极彻底卡燥后，将其组装成电泳胶板.用水-平仪调平，垫片厚度为C.4mm9. 4. 1. 3制胶
NX/T2469—2013
在60mI.6.0%PACE胶中分别加人TEMED50μI新配制的10%过硫酸铵溶液500L.迅速混勾后灌胶。待胶液充满玻璃板夹层.将0.4mm厚粪鱼齿梳子平齐端向里轻轻插入胶液约0.4cm灌胶过程中防止出现气泡。使胶液聚合垒少1i以上，胶聚合后，清班胶板表而溢出的胶液.轻轻拔出梳了.用水清洗于净备用，
9.4.1.4预电泳
将胶板安装丁电泳槽上，向上槽中加入约8001rL预热充6.5%.的1×IBE级冲液.使共超过凝胶例部约3cm-南下中加入800mI.1×THE级冲液。在60W恒功率下，预电泳3C:1min9. 4. 1. 5 变性
在20LPCR样品中加人8L6×加样缓冲液，混匀，在水浴锅或PCR仪上95℃变性bmin，取出，迅速置}碎冰上：冷部10min以上。9.4.1.6电泳
清除气泡和聚丙烯酰胺碎片。将鲨齿梳齿端括人凝胶1mm~2tmm。每一个加样孔点入2L~3u样品。除待测样品外，还应同时加人参照品种扩增产物。在5心W~-80W恒功率下电泳，使凝胶温度保持在约50℃。电泳1.5h~2.5h(电泳时间取决丁扩增片段的大小范围）。电泳结束后小心分开两决玻璃板，取下凝胶附荐的长玻璃板准备固定。注：具体功率大小根据也泳槽的规格型号和实验室空温设定，9.4.1.7银染
a）固定：将凝胶附者的长玻离板置于塑料盒中，加入约1000m固定液，使固定液没过胶，在摇床上轻轻晃动约15min
b）漂洗：取山玻璃板，用去离子水漂洗30sct）染色：将玻离板置放人1500ml.染色液中.使染色液没过凝胶，在播床上轻轻光动3℃min。）漂洗：而去离水快遮漂洗，时间不超过30 s,e）显影：将玻璃板在1500ml.显影液中轻轻显动至出现清晰带纹。定影将凝胶在固定中定影5in：
g）漂洗：在去离子水中漂洗1min。9.4.2毛细管电泳荧光检测
9.4.2.1PCR产物样品准备
将6-FAM和HEX荧光标记的PCR产物瓜超纯水稀释30倍，1AMRA和ROX炭光标记的PCR产物稀释10倍。分别取等体积的上述4种稀释后溶液混合，从混合液中吸取1uI.加人到DVA分析仪专而深孔板孔巾，板中各孔分别加人0.1.1.17500分子量内标剂8.9去离子甲酰胺：混勾离心后PCR仪上95℃C变性5min，取出，立即置于痒冰上冷却约10min，离心待上机电泳除待测样品外，每个SSR位点还应同时包括2个-~3个参照品种的扩增产物。注：不图炭光标记的扩增产物的最适稀释倍数最好通过细管电泳荧光检调预试验碰定：9.4.2.2开机准备
打开DNA分析仪·检查仪器工作状态。更换缓冲液，灌胶。将製有样品的深孔板置放丁样品架基座上.打开数据收集软件。
9.4.2.3编辑电泳板
按照仪器操作程序，创建电泳板-输入电泳板名称，选择适合的程序和电泳板类型输人栏品编号或名称。
9.4.2.4运行程序
启动运行程序，DKA分析仪白动将毛细管电泳数据、运行参数等存放于仪器中。iiiKAoNiiKAca
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10等位变异数据采集
10.1数据表示
样品每个SSR位点的等位变异采爪扩增片段人小的形式表尔。10.2变性聚丙烯凝胶电泳与银染检测将某一位点待测样品和和应的照品种扩增片段的带型和移动危置进行比较，根据参照种的动位置和扩增片段大小，确定待测样品该位点的等位变异大小。10.3毛细管电泳荧光检测
使用DNA分析仪的片段分析软件,读出待测品种与对应参照品种的等位变异数据，比较参照品种的等位变异大小数据与表C.1中参照品种相应的数据，两者之间的差值为系统误差。从待测样品的等位变异数据中去除该系统误差.得到的数据即为待测样品该位点的等位变异大小。10.4结果记录
纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X，其中X为该位点等位变异的大小；杂合位点的等位变另数据记录为X/Y,其中X,Y为该位点上两个不同的等位变异，小片段在前，大片段在后。无效等位变异的大小记录为0/0。
示例1：
一个品种在BNL3140位点上有一个等位变异，大小103bp.则该品种在该位点上的等位变异数据记录为103/103.
示例2：
一二个品种在NAUI1S位点上有两个等位变异-人小分别为2I0bP23bp-则该品种在该位点上的等位变异数据记录为210/231，
11判定方法
用表C.1中引物进行检测，将获得的待测样品等位变异数锯进行品种问比较，或与数据库中品科比较，判定方法如下：
a）品种问相似度≤90%.判定为不同品种；b）品利间相似度为90%S<100%时.判定为近似品种；）品种间相似度一100%，判定为疑同品种。品种相似度(S)按式(1)计算：
S=N+N,
式中：
S一—品种相似度,单位为百分率(%)N，—品种i和j之间共同的等位变异数目；N品种i中出现的等位变异数国;
N一品种，；中山现的等位变异数目，X100
对丁b)和c)的两种情况，按照GB/T19557.1的规定进行出间鉴定·或增加多态性引物进步对群体鉴定。
A.1主要仪器设备
A.1.1PCR扩增仪。
A.1.2高压电泳仪。
A.1.3电泳糟及配套的制胶附件。A.1.4水平电泳槽及配套的制胶附件。附录A
(规范性附录）
仪器设备及试剂
NY/T2469—2013
A.1.5DNA分析仪。基于毛细管电泳，有片段分析功能和数据分析软件，能够分辨最少1个核节酸的差异。
A.1.6高速离心机。
A.1.7水平摇床，
A.1.8胶片观察灯。
电了天平。
微量移液器，规格分别为10μ、20u、100μ、200ml、1000l.连续可调。A. 1. 11
紫外分光光度计。
高玉火菌锅。
酸度讨。
水浴锅或金属浴。
制冰机。
凝胶成像系统或紫外透射仪。
冷冻下燥仪，
冰箱。
其他相关仪和设备。
A.2试剂
除非另有说明,在分析中均使用分析纯的试剂，A.2.1 B-蔬基乙醇。
A.2.2十六烷基三甲基溴化铵（CTAB)A.2.3 乙Z二胺μZ酸(EDTA)。
A.2.4聚乙烯吡喀烷酶A.2.5三羟甲基氨基甲烷(Tris)。A.2.6异戊醇。
A.2.7氯仿。
A.2.8浓盐酸。
iiKAoNiiKAca
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A.2.9氢氧化钠，
A.2.10氯化钠。
A.2.11 葡萄糖。
2TaqDNA聚台酶。
10XPCR缓冲液。
A.2.14氯化镁。
测种脱氧核糖核苷酸(dNTI)
无水乙醇。
SSR 引物。
3琼脂糖。
溴酚蓝。
二巾苯青 FF。
照糖。
核酸染色剂：
去离子甲酰胺。
硼酸。
甲叉双丙烯酰胺。
内烯酰胺。
A.2.27尿素。
四甲基乙胺（TEMED)。
亲和硅烷，
A.2.30剥离硅烷。
A.2.31过硫酸铵
A.2.32冰醋酸。
3硝酸银，
A.2. 34甲醛、
A.2.35DNA分析仪用聚丙烯酰胺胶液。A.2.36DNVA分析仪用分子量内标：最大分子量500 bp，ILiz标记。A.2.37DNA分析仪用光谱校准基质。包括6-FAM、TAMRA、HEX利ROX4种荧光染料标记的DNA 片段LFAM.即 6 -羧基荧光素,6-carboxy-Iuorescein;TAMRA,即 5(S)-羧基四甲基罗丹明-tetramethyl-6carboxyrhodamine;HEX.即6-HEX亚磷酰胺单体,5-hexachloro-(luorescein:ROX.郎 6-基-X-罗丹明(单一化合物）,6-carhoxy-xrhodamine]。A.2.38DNA分析仪用电泳缓冲液，6
B.1DNA提取溶液的配制
B. 1. 11 mnl/ L氢氧化钠溶液
附录B
（规范性附录）
溶液配制
称取40.0g氢氧化钠.先溶于800ml，去离了水中，加水定容至1000ml.。B.1.20.5mol/L盐酸溶液
量取25ml.37%浓盐酸，加去离子水定容垒500ml。B. 1. 30.5mol/L乙二胺四乙酸二钠盐(FDTA(pH8. 0)溶液NY/T2469—2013
称取186.1乙二胺四乙酸二钠盐，加人8001nL去离子水，再加人20g氢氟化钠，加热搅拌。待乙二胺四乙酸二钠盐完全溶解后,冷却至室温。再用氢氧化钠溶液(B.1.1)准确调 pH至 8.0,定容至1 000 ml.,在 103. 4kPa(121℃)条件下灭菌 20 min.B. 1. 41 mol/ L 三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HC1)(pH8. 0)溶液称取 121.14g 三羟甲基氨基甲烷(Tris).加双蒸水 800 ml..加 HC1约 30 mL调节 pH至 8. 0.定容至 1 000 mL,在 103. 4 kPa(121℃)条件下灭菌20 min。B.1.5氯仿—异戊醇混合液
氯仿和异戎醇按無24：1休积配制。B.1.610%十六烷基三甲基漠化铵(CIAB)称取100g十六烷基三甲基溴化铵加双蒸水定容至1000ml.B.1.7DNA提取缓冲液
分别称取葡萄糖和PVP69.36g和20g.分别加人100tmL1.0mol/LTris-HCipH8.0).10ml0.5 mol/L Na·EDrA(pH 8.0).10 mlβ -巯基Z醇，加双蒸水定容至 1 000 ml- 在 103. kPa(121°)条件下灭菌20 min.于4℃保存。B.1.8裂解缓冲液
分别称取 NaCI 和 PVP 81. 816 g 和 20 g,分别加入 100 mI. 1. 0 mol/1. 1'ris -HCl(pH8. 0).4C mL0. 5 mgl/I Nz·FDTA(pH8. 0).200 ml. 19% CTAB.10 mL3 巯基Z醇,加双蒸水定容至 1 000 mI. 休积，在103.4kPa（121℃)条件下灭菌20 min.于4℃保存，B.1.9TE缓冲液
分别量取5mL三羟巾基氨基烷盐酸溶液(pII8.0)和1 m 乙二胺四乙酸.钠盐溶液(pII8. 0).定容至500 mL,在 103.4kPa(121℃)条件下灭菌20 mir，于4℃下保存，B.2PCR扩增溶液的配制
B.2.1dNTP溶液
用超纯水分别配制dAIP,dTTP,dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸终浓度为100 mmol/L的储存液，分别量取1种储存液20μL.混合-1.20L超纯水定容.配制成每种核苷酸终浓度为10mmm:/1的L作液。在103.4kPa(121℃)条件下灭菌20 min.于20%℃保存，注：也可使用满足试验要求的商品dNTF辫液，7
-riiKAoNhiKAca
NY/T2469—2013
B.2.2SSR 引物溶液
用超纯水分别配制正向引物和反向引物浓度为10加ol/的工作液。B.2.3氯化镁溶液
称政1.190g氯化镁，用去离了水溶解，定容至5001mL，配制成25mmo1/L的工作液。在103.4kPa(127℃）条件下灭菌20min，：20℃保存注：也可使用满足试验婴求的商品氯化镁溶液B.3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制B.3. 110×TBE缓冲液
分别称取108.0g三羟册基氨基甲烷和55.0硼酸，溶F800ml.去离子水中，加人40ml0.5mul/L乙二胺四乙二钠盐溶液（pH8.0),定容至1000tnLB.3.240%丙烯酰胺溶液
分别称取380.0g丙烯酰胺和20.Cg甲叉双丙烯酰胺，溶于800mL去离子水中，楚窄至1000ml.。B. 3.36%变性聚丙烯酰胺胶溶液称取120.0g尿素，用去离子水溶解，分别加人100ml.10×TBE缓冲液利150ml40%丙烯胺溶液.定容至 1 000 ml.。
B.3.4亲和硅烷缓冲液
分别量取49.75ml.无水乙醇和250L冰醋酸.用去离子水定容至50ml.。B.3.5亲和硅烷工作液
分别最取5止亲和硅烷和1mI亲和硅烷缓冲液，混勾。B.3. 6剥离硅烷工作液
分别量取98mL氯仿溶液和2ml.二1基：氯硅烷溶液混勾。B.3.710%过硫酸铵溶液
称取1.0g过硫酸铵，溶于10mL去离子水中，混匀，于4℃保存。B.3.81×TBE缓冲液
量取5C0mL10×TBE缓冲液（B.3.上）.加去离-厂水4500mL，混，B.3.96×加样缓冲液
分别称取0.25g溴酚蓝和0.25g叫苯青，分别加人98mL么离子甲酰胺和2mI.0.5mol/L乙胶四乙酸二钠盐(pH8.0)济液搅拌溶解：B.4银染溶液的配制
B.4.1固定液
量取200 mL冰醋酸-加人18U mL.去离子水。B.4.2染色液
称取3.0名硝酸银，溶了1500ml去离子水中。B.4.3显影液
称取30g氢氧化钠.溶于1C00mL去离了水中，再加人5mlL醛。co
核心引物见表C.1.
引物序列(5'→3')
唯录广
(规范性附录)
核心引物
表C1核心引物目录
F:GCTGTTGCICACATCTCTT
13NL24-19
BNL2646
BNL3140
BNL3474
BNI8502
HN4030
LTR216
DPL4-2
DPL513
DPL532
DPL910
R:GGGCAAACAGATAGGCAGAA
F:ATCTTTCAAACAACGGCAGC
R:CGATTCCGGACTCTIGATGT
F:ITCTIIGAFAGATACACATTTTTA
R:AAAATAAACTACGAAAGAGAAAGAGAAF:CACATIGTGGCAALTGAGT
R :GGAAAAGGGAAAGCCATTGT
F:AACK:TAAITCAGTGCGGTIC
R:ATAATGGCATTGATTATAGAGTGTG
F:AATTTCTAAGATAACACACAAACACA R: TACAATCAAATAGCAGTITAGAGTATEG F: LTCCCTC:AGITAAGGTGCA
R:ATGTTGTAAGGGTGCAAGGC
F,TTAGGGTTTAGTTGAATGG
R: ATGAACACACGCACG
F,GCCTCTGAACATGTAGAAATGAATG
R:GTACAAETTGAAGCAAATTACC
F.GAAGGAATCGTATTIATTTGAG
R:GACCGGTAGACAGAGAIGAGAAAT
F:ACAGAGCTATGNGAAATCATGGTA
R:TGTALTGCAAATTGCIGCTAAGAC
F:CTATCACCCTTCTCTAGTTGCCTT
R: ATCGGKCTGACAAACATCA
F:TTACGGTGGCTAATGTAATATCCC
R ATTCTIGAGATICACLAGGAAAG
F:AGACCCGGTACTACATGTTAICTT
R:ACATACAGATGCTTCACACAAACAO
F: CATACATCCATGCATACATACATGCR: TGAGGTATAGGTAGGILTC'IGGTGAFAAACAAAGCAGCCAATGCT
R:ATACTCGACACGGTCAAGGG
5'-6- FAM
5'-HEX
AY/T2469—2013
遇火温度.
等位变异,hp
3'-TAMRA
5'-RUX
5'-6-FAM
5'- HEX
5'-TAMRA
5'-6-FAM
5'-HEX
STAMRA
3'- ROX
iiKAoNiKAca
参照品种
冀裕10号
晋梯25号
中棉所37bzxZ.net
新陈早11号
国抗棉1号
中棉所11
晋棉10号
中棉所19
鲁棉 1-1
鄂棉21号
晋棉12号
湘栉0号
鄂梯18号
冀棉10号
鄂棉16号
冀锦15号
龚橘10号
豫棉10号
国欣棉：号
冀棉儿
晋17号
豫棉11号
晋棉10号
晋橘20号
新陆早10号
言棉研16
中棉所40
新陆早12号
冀梯-3号
湘烯12号
湘烷10号
湘棉12号
鄂鹉 26:号
中棉所12
中棉所43
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陆地棉品种鉴定技术规程SSR分子标记法本标准规定厂利用简单重复序列（sitplesequencerepcats.SsR)分了标记进行陆拖棉（GossybiulirsuturL.)品种鉴定的试验方法、数据记录和判定标本标准适用丁基丁SSR分F标记法的陆地棉DNA分子数据采集和品种鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于木文件的应用是必不可少的，凡是注且期的引而文件，仅注口期的版本适用十本文件。儿是术注目期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T19557.1植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
核心引物corcprimer
指品种DNA指纹鉴定优先选用的一套SSR引物，具有多态性高，重复性好等综合特性.可用于品种DNA指纹数据采集和品种鉴定。3.2
参照品种referelce variety
是对应于特定位点不同等位变异的一组品种，历于辅助确定待测样品在某个位点上等位变异扩增片段的大小,校正仪器设备的系统误差.以保证不向实验室数据具有可比性。4原理
SSR广泛分布于基因组中，不同品种间每个SSR位点重复单位的数量可能不同。针对两侧序列高度保守的简单重复序列，根据其两侧的序列设计一对特异引物.利用聚合酶链反应（polymcrasc?chainreaction，PCR)技术对重复序列进行扩增。在电泳过程中，由于SSR位点重复单位的数量不同引起不同长度的PCR打增片段在电场作用下分离.经硝酸银染色或者荧光架料标记加以区分。因此，根据SSR位点的多态性，利用PCR扩增和电泳技术可以鉴定陆地棉品种。5仪器设备及试剂
仪器设备及试剂见附录A，
6溶液配制
溶液配制方法见附录B
7引物
引物相关信息附录（
8参照品种及其使用
参照品种的名称见附录C，参照品种来源参见附录D。iiKAoNiKAca
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在逊行等位变异检测.应同时包括相成参照品种的PCR扩增产物。注1同一名称不同来源的参照品种的某位点上的等位变异可能不相同，在使用其他来源的参照品种时，成与原参照品种核对确认无误后再使用。注2：对于附录（中未包括的等位变异-应按本标证方法，确定其大小和对应的参照品种。9操作程序
9.1样品准备
每份样品检测8个单株，进行个体分析。9.2DNA提取
9.2.1将种子发芽.取两片真叶期的真叶0.2g.放人1.5imL离心管中。9.2.2置冷冻干燥仪中一50℃冷冻干燥2d.取山，每个试管中放人1个3mm直径的小钢珠，置研磨仪上设定每秒钟30次，研磨约5min.9.2.3加人预冷的新鲜配制的提取缓冲液600uI，冰浴10min。10000g，℃:-离心10rrin.弃上清液。
9.2.4于沉淀中加人600ml65℃预热的裂解缓冲液，搅拌均勾.65℃水浴40min，期间翻转混匀3次：9.2.5加入800μl.氯伤一异戊醇（V：V=24：1)混合液，翻转50次以上，10000g离心20min，将上清液转入新的1.5ml.离心管中
9.2.6加0.6倍体积预冷的异丙醇（20℃），缓慢翻转30次，混匀.静置10min-1200\离心15 min,弃上清液
9.2.7丁沉淀中加人1mL70%的乙醇洗涤，12000g离心2min。9.2. 8弃土清液,通风干燥沉淀
9.2.9加人200μLTE缓冲液，落解DNA,检测DNA浓度，-20℃保存备用：注：其他所获DNA质量能够满足PCR扩增雷要的DNA提取方法都适用丁本标准。9.3PCR扩增
9. 3. 1 反应体系
20μI的反应体积:DNA5μL(1 ng/μL),1C×Bufer2μl.,dNTPC.4μL（10 mmal/L).正向引物0.8 μL, (10 μmol/L). 反向引物 0. 8 μl (10 μmol/ L)- MgCI 1. 2 μI(25 mmol/ L), Taq 酶 0. 1 μI（5U/L），双蒸水9.4uL.在PCR扩增仪上进行扩增。利月毛细管电泳荧光检测时使用炭光标记的引物。引物的荧光染料种类见附录C。注：反应体系的体积可以报据具体情况进行调整。9.3.2反应程序
95℃预变性5min95℃变性30s.根据表C.1推荐的退火溢度退火3Cs.72℃延伸1min，共35个循环;72℃下延仲1℃mi-4保存。9.4PCR产物检测
9.4.1变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染检测9.4.1.1清洗玻璃板
将玻璃板清洗干净.用去离子水冲洗后晾干。用光水乙醇擦洗2遍：吸水纸擦于。在长板上涂C.5mL的亲和硅烷T作液：带凹槽的短板上涂0.5mL离硅烷作液，操作过程中防.两块璃板互相污染。
9.4.1.2组装玻璃板
玻璃极彻底卡燥后，将其组装成电泳胶板.用水-平仪调平，垫片厚度为C.4mm9. 4. 1. 3制胶
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在60mI.6.0%PACE胶中分别加人TEMED50μI新配制的10%过硫酸铵溶液500L.迅速混勾后灌胶。待胶液充满玻璃板夹层.将0.4mm厚粪鱼齿梳子平齐端向里轻轻插入胶液约0.4cm灌胶过程中防止出现气泡。使胶液聚合垒少1i以上，胶聚合后，清班胶板表而溢出的胶液.轻轻拔出梳了.用水清洗于净备用，
9.4.1.4预电泳
将胶板安装丁电泳槽上，向上槽中加入约8001rL预热充6.5%.的1×IBE级冲液.使共超过凝胶例部约3cm-南下中加入800mI.1×THE级冲液。在60W恒功率下，预电泳3C:1min9. 4. 1. 5 变性
在20LPCR样品中加人8L6×加样缓冲液，混匀，在水浴锅或PCR仪上95℃变性bmin，取出，迅速置}碎冰上：冷部10min以上。9.4.1.6电泳
清除气泡和聚丙烯酰胺碎片。将鲨齿梳齿端括人凝胶1mm~2tmm。每一个加样孔点入2L~3u样品。除待测样品外，还应同时加人参照品种扩增产物。在5心W~-80W恒功率下电泳，使凝胶温度保持在约50℃。电泳1.5h~2.5h(电泳时间取决丁扩增片段的大小范围）。电泳结束后小心分开两决玻璃板，取下凝胶附荐的长玻璃板准备固定。注：具体功率大小根据也泳槽的规格型号和实验室空温设定，9.4.1.7银染
a）固定：将凝胶附者的长玻离板置于塑料盒中，加入约1000m固定液，使固定液没过胶，在摇床上轻轻晃动约15min
b）漂洗：取山玻璃板，用去离子水漂洗30sct）染色：将玻离板置放人1500ml.染色液中.使染色液没过凝胶，在播床上轻轻光动3℃min。）漂洗：而去离水快遮漂洗，时间不超过30 s,e）显影：将玻璃板在1500ml.显影液中轻轻显动至出现清晰带纹。定影将凝胶在固定中定影5in：
g）漂洗：在去离子水中漂洗1min。9.4.2毛细管电泳荧光检测
9.4.2.1PCR产物样品准备
将6-FAM和HEX荧光标记的PCR产物瓜超纯水稀释30倍，1AMRA和ROX炭光标记的PCR产物稀释10倍。分别取等体积的上述4种稀释后溶液混合，从混合液中吸取1uI.加人到DVA分析仪专而深孔板孔巾，板中各孔分别加人0.1.1.17500分子量内标剂8.9去离子甲酰胺：混勾离心后PCR仪上95℃C变性5min，取出，立即置于痒冰上冷却约10min，离心待上机电泳除待测样品外，每个SSR位点还应同时包括2个-~3个参照品种的扩增产物。注：不图炭光标记的扩增产物的最适稀释倍数最好通过细管电泳荧光检调预试验碰定：9.4.2.2开机准备
打开DNA分析仪·检查仪器工作状态。更换缓冲液，灌胶。将製有样品的深孔板置放丁样品架基座上.打开数据收集软件。
9.4.2.3编辑电泳板
按照仪器操作程序，创建电泳板-输入电泳板名称，选择适合的程序和电泳板类型输人栏品编号或名称。
9.4.2.4运行程序
启动运行程序，DKA分析仪白动将毛细管电泳数据、运行参数等存放于仪器中。iiiKAoNiiKAca
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10等位变异数据采集
10.1数据表示
样品每个SSR位点的等位变异采爪扩增片段人小的形式表尔。10.2变性聚丙烯凝胶电泳与银染检测将某一位点待测样品和和应的照品种扩增片段的带型和移动危置进行比较，根据参照种的动位置和扩增片段大小，确定待测样品该位点的等位变异大小。10.3毛细管电泳荧光检测
使用DNA分析仪的片段分析软件,读出待测品种与对应参照品种的等位变异数据，比较参照品种的等位变异大小数据与表C.1中参照品种相应的数据，两者之间的差值为系统误差。从待测样品的等位变异数据中去除该系统误差.得到的数据即为待测样品该位点的等位变异大小。10.4结果记录
纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X，其中X为该位点等位变异的大小；杂合位点的等位变另数据记录为X/Y,其中X,Y为该位点上两个不同的等位变异，小片段在前，大片段在后。无效等位变异的大小记录为0/0。
示例1：
一个品种在BNL3140位点上有一个等位变异，大小103bp.则该品种在该位点上的等位变异数据记录为103/103.
示例2：
一二个品种在NAUI1S位点上有两个等位变异-人小分别为2I0bP23bp-则该品种在该位点上的等位变异数据记录为210/231，
11判定方法
用表C.1中引物进行检测，将获得的待测样品等位变异数锯进行品种问比较，或与数据库中品科比较，判定方法如下：
a）品种问相似度≤90%.判定为不同品种；b）品利间相似度为90%S<100%时.判定为近似品种；）品种间相似度一100%，判定为疑同品种。品种相似度(S)按式(1)计算：
S=N+N,
式中：
S一—品种相似度,单位为百分率(%)N，—品种i和j之间共同的等位变异数目；N品种i中出现的等位变异数国;
N一品种，；中山现的等位变异数目，X100
对丁b)和c)的两种情况，按照GB/T19557.1的规定进行出间鉴定·或增加多态性引物进步对群体鉴定。
A.1主要仪器设备
A.1.1PCR扩增仪。
A.1.2高压电泳仪。
A.1.3电泳糟及配套的制胶附件。A.1.4水平电泳槽及配套的制胶附件。附录A
(规范性附录）
仪器设备及试剂
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A.1.5DNA分析仪。基于毛细管电泳，有片段分析功能和数据分析软件，能够分辨最少1个核节酸的差异。
A.1.6高速离心机。
A.1.7水平摇床，
A.1.8胶片观察灯。
电了天平。
微量移液器，规格分别为10μ、20u、100μ、200ml、1000l.连续可调。A. 1. 11
紫外分光光度计。
高玉火菌锅。
酸度讨。
水浴锅或金属浴。
制冰机。
凝胶成像系统或紫外透射仪。
冷冻下燥仪，
冰箱。
其他相关仪和设备。
A.2试剂
除非另有说明,在分析中均使用分析纯的试剂，A.2.1 B-蔬基乙醇。
A.2.2十六烷基三甲基溴化铵（CTAB)A.2.3 乙Z二胺μZ酸(EDTA)。
A.2.4聚乙烯吡喀烷酶
A.2.7氯仿。
A.2.8浓盐酸。
iiKAoNiiKAca
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A.2.9氢氧化钠，
A.2.10氯化钠。
A.2.11 葡萄糖。
2TaqDNA聚台酶。
10XPCR缓冲液。
A.2.14氯化镁。
测种脱氧核糖核苷酸(dNTI)
无水乙醇。
SSR 引物。
3琼脂糖。
溴酚蓝。
二巾苯青 FF。
照糖。
核酸染色剂：
去离子甲酰胺。
硼酸。
甲叉双丙烯酰胺。
内烯酰胺。
A.2.27尿素。
四甲基乙胺（TEMED)。
亲和硅烷，
A.2.30剥离硅烷。
A.2.31过硫酸铵
A.2.32冰醋酸。
3硝酸银，
A.2. 34甲醛、
A.2.35DNA分析仪用聚丙烯酰胺胶液。A.2.36DNVA分析仪用分子量内标：最大分子量500 bp，ILiz标记。A.2.37DNA分析仪用光谱校准基质。包括6-FAM、TAMRA、HEX利ROX4种荧光染料标记的DNA 片段LFAM.即 6 -羧基荧光素,6-carboxy-Iuorescein;TAMRA,即 5(S)-羧基四甲基罗丹明-tetramethyl-6carboxyrhodamine;HEX.即6-HEX亚磷酰胺单体,5-hexachloro-(luorescein:ROX.郎 6-基-X-罗丹明(单一化合物）,6-carhoxy-xrhodamine]。A.2.38DNA分析仪用电泳缓冲液，6
B.1DNA提取溶液的配制
B. 1. 11 mnl/ L氢氧化钠溶液
附录B
（规范性附录）
溶液配制
称取40.0g氢氧化钠.先溶于800ml，去离了水中，加水定容至1000ml.。B.1.20.5mol/L盐酸溶液
量取25ml.37%浓盐酸，加去离子水定容垒500ml。B. 1. 30.5mol/L乙二胺四乙酸二钠盐(FDTA(pH8. 0)溶液NY/T2469—2013
称取186.1乙二胺四乙酸二钠盐，加人8001nL去离子水，再加人20g氢氟化钠，加热搅拌。待乙二胺四乙酸二钠盐完全溶解后,冷却至室温。再用氢氧化钠溶液(B.1.1)准确调 pH至 8.0,定容至1 000 ml.,在 103. 4kPa(121℃)条件下灭菌 20 min.B. 1. 41 mol/ L 三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HC1)(pH8. 0)溶液称取 121.14g 三羟甲基氨基甲烷(Tris).加双蒸水 800 ml..加 HC1约 30 mL调节 pH至 8. 0.定容至 1 000 mL,在 103. 4 kPa(121℃)条件下灭菌20 min。B.1.5氯仿—异戊醇混合液
氯仿和异戎醇按無24：1休积配制。B.1.610%十六烷基三甲基漠化铵(CIAB)称取100g十六烷基三甲基溴化铵加双蒸水定容至1000ml.B.1.7DNA提取缓冲液
分别称取葡萄糖和PVP69.36g和20g.分别加人100tmL1.0mol/LTris-HCipH8.0).10ml0.5 mol/L Na·EDrA(pH 8.0).10 mlβ -巯基Z醇，加双蒸水定容至 1 000 ml- 在 103. kPa(121°)条件下灭菌20 min.于4℃保存。B.1.8裂解缓冲液
分别称取 NaCI 和 PVP 81. 816 g 和 20 g,分别加入 100 mI. 1. 0 mol/1. 1'ris -HCl(pH8. 0).4C mL0. 5 mgl/I Nz·FDTA(pH8. 0).200 ml. 19% CTAB.10 mL3 巯基Z醇,加双蒸水定容至 1 000 mI. 休积，在103.4kPa（121℃)条件下灭菌20 min.于4℃保存，B.1.9TE缓冲液
分别量取5mL三羟巾基氨基烷盐酸溶液(pII8.0)和1 m 乙二胺四乙酸.钠盐溶液(pII8. 0).定容至500 mL,在 103.4kPa(121℃)条件下灭菌20 mir，于4℃下保存，B.2PCR扩增溶液的配制
B.2.1dNTP溶液
用超纯水分别配制dAIP,dTTP,dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸终浓度为100 mmol/L的储存液，分别量取1种储存液20μL.混合-1.20L超纯水定容.配制成每种核苷酸终浓度为10mmm:/1的L作液。在103.4kPa(121℃)条件下灭菌20 min.于20%℃保存，注：也可使用满足试验要求的商品dNTF辫液，7
-riiKAoNhiKAca
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B.2.2SSR 引物溶液
用超纯水分别配制正向引物和反向引物浓度为10加ol/的工作液。B.2.3氯化镁溶液
称政1.190g氯化镁，用去离了水溶解，定容至5001mL，配制成25mmo1/L的工作液。在103.4kPa(127℃）条件下灭菌20min，：20℃保存注：也可使用满足试验婴求的商品氯化镁溶液B.3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制B.3. 110×TBE缓冲液
分别称取108.0g三羟册基氨基甲烷和55.0硼酸，溶F800ml.去离子水中，加人40ml0.5mul/L乙二胺四乙二钠盐溶液（pH8.0),定容至1000tnLB.3.240%丙烯酰胺溶液
分别称取380.0g丙烯酰胺和20.Cg甲叉双丙烯酰胺，溶于800mL去离子水中，楚窄至1000ml.。B. 3.36%变性聚丙烯酰胺胶溶液称取120.0g尿素，用去离子水溶解，分别加人100ml.10×TBE缓冲液利150ml40%丙烯胺溶液.定容至 1 000 ml.。
B.3.4亲和硅烷缓冲液
分别量取49.75ml.无水乙醇和250L冰醋酸.用去离子水定容至50ml.。B.3.5亲和硅烷工作液
分别最取5止亲和硅烷和1mI亲和硅烷缓冲液，混勾。B.3. 6剥离硅烷工作液
分别量取98mL氯仿溶液和2ml.二1基：氯硅烷溶液混勾。B.3.710%过硫酸铵溶液
称取1.0g过硫酸铵，溶于10mL去离子水中，混匀，于4℃保存。B.3.81×TBE缓冲液
量取5C0mL10×TBE缓冲液（B.3.上）.加去离-厂水4500mL，混，B.3.96×加样缓冲液
分别称取0.25g溴酚蓝和0.25g叫苯青，分别加人98mL么离子甲酰胺和2mI.0.5mol/L乙胶四乙酸二钠盐(pH8.0)济液搅拌溶解：B.4银染溶液的配制
B.4.1固定液
量取200 mL冰醋酸-加人18U mL.去离子水。B.4.2染色液
称取3.0名硝酸银，溶了1500ml去离子水中。B.4.3显影液
称取30g氢氧化钠.溶于1C00mL去离了水中，再加人5mlL醛。co
核心引物见表C.1.
引物序列(5'→3')
唯录广
(规范性附录)
核心引物
表C1核心引物目录
F:GCTGTTGCICACATCTCTT
13NL24-19
BNL2646
BNL3140
BNL3474
BNI8502
HN4030
LTR216
DPL4-2
DPL513
DPL532
DPL910
R:GGGCAAACAGATAGGCAGAA
F:ATCTTTCAAACAACGGCAGC
R:CGATTCCGGACTCTIGATGT
F:ITCTIIGAFAGATACACATTTTTA
R:AAAATAAACTACGAAAGAGAAAGAGAAF:CACATIGTGGCAALTGAGT
R :GGAAAAGGGAAAGCCATTGT
F:AACK:TAAITCAGTGCGGTIC
R:ATAATGGCATTGATTATAGAGTGTG
F:AATTTCTAAGATAACACACAAACACA R: TACAATCAAATAGCAGTITAGAGTATEG F: LTCCCTC:AGITAAGGTGCA
R:ATGTTGTAAGGGTGCAAGGC
F,TTAGGGTTTAGTTGAATGG
R: ATGAACACACGCACG
F,GCCTCTGAACATGTAGAAATGAATG
R:GTACAAETTGAAGCAAATTACC
F.GAAGGAATCGTATTIATTTGAG
R:GACCGGTAGACAGAGAIGAGAAAT
F:ACAGAGCTATGNGAAATCATGGTA
R:TGTALTGCAAATTGCIGCTAAGAC
F:CTATCACCCTTCTCTAGTTGCCTT
R: ATCGGKCTGACAAACATCA
F:TTACGGTGGCTAATGTAATATCCC
R ATTCTIGAGATICACLAGGAAAG
F:AGACCCGGTACTACATGTTAICTT
R:ACATACAGATGCTTCACACAAACAO
F: CATACATCCATGCATACATACATGCR: TGAGGTATAGGTAGGILTC'IGGTGAFAAACAAAGCAGCCAATGCT
R:ATACTCGACACGGTCAAGGG
5'-6- FAM
5'-HEX
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遇火温度.
等位变异,hp
3'-TAMRA
5'-RUX
5'-6-FAM
5'- HEX
5'-TAMRA
5'-6-FAM
5'-HEX
STAMRA
3'- ROX
iiKAoNiKAca
参照品种
冀裕10号
晋梯25号
中棉所37bzxZ.net
新陈早11号
国抗棉1号
中棉所11
晋棉10号
中棉所19
鲁棉 1-1
鄂棉21号
晋棉12号
湘栉0号
鄂梯18号
冀棉10号
鄂棉16号
冀锦15号
龚橘10号
豫棉10号
国欣棉：号
冀棉儿
晋17号
豫棉11号
晋棉10号
晋橘20号
新陆早10号
言棉研16
中棉所40
新陆早12号
冀梯-3号
湘烯12号
湘烷10号
湘棉12号
鄂鹉 26:号
中棉所12
中棉所43
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